三维运动神经类器官的生成

该方案通过体外培养源自人iPS细胞的运动神经类器官，促进对轴突束发育及其相关疾病机制的研究。通过简单地培养神经球和定制的微培养芯片，可自发形成单向轴突束，并可用于多种下游实验。运动神经类器官能够提供比以往体外系统更接近生理状态的模型，从而有助于针对包括肌萎缩侧索硬化症（LS）在内的运动神经元病药物的筛选与测试。

在通风橱内，穿戴适当的个人防护装备，将三毫升 SU-8 2100 涂布于经丙酮清洁的硅片上，并将硅片置于匀胶机中心。通过真空固定硅片，先以每分钟 500 转的速度旋转 10 秒，使 SU-8 在硅片表面均匀涂布，随后以每秒 300 转的加速度加速至每分钟 1,500 转，继续旋转 30 秒，以获得厚度为 150 微米的光刻胶层。软烘后，将光掩模安装至掩模对准器，并将硅片暴露于紫外光下照射 60 秒。

在加热板上烘烤后，将晶圆置于光刻胶显影液中，在轨道摇床上搅拌显影10至20分钟，并在过程中更换一次显影液。为制备用于组织培养的芯片底层，将新配制的PDMS倒入晶圆至所需厚度，并在真空腔室中对混合物进行脱气处理。将PDMS在60摄氏度的烘箱中固化至少三小时。

冷却后，使用刀片将固化的PDMS从硅片上切下，然后利用未固化的PDMS并通过加热固化将其与中层储液池键合至PDMS底层，从而获得组装好的PDMS组织培养芯片。为准备用于运动神经类器官形成的PDMS芯片，需将芯片和一块76毫米×52毫米的显微镜玻璃置于含有70%乙醇的培养皿中，消毒至少一小时。孵育结束后，将芯片放置在湿润的显微镜玻璃上。

经过过夜干燥后，芯片应牢固粘附于玻璃上。在通道入口的一侧放置30微升用DMEM/F12稀释的基底膜基质液滴，并从入口的另一侧抽吸溶液，以使微通道表面被基质均匀包被。随后将含有包被溶液的PDMS芯片置于培养皿中，在室温下孵育1小时。

为诱导3D iPS细胞分化为运动神经元，将4 × 10⁴个iPS细胞每孔接种至96孔U型底培养板的相应孔数中，每孔体积为100 µL，培养基为添加10 µmol/L Y-27632的无饲养层和无血清细胞培养基。次日，将每孔上清液更换为100 µL含10 µmol/L SB431542和100 nmol/L LDN-193189的KSR培养基。第2天和第3天，将各孔上清液更换为100 µL KSR培养基，其中添加10 µmol/L SB431542、100 nmol/L LDN-193189、5 µmol/L DAPT、5 µmol/L SU5402、1 µmol/L视黄酸和1 µmol/L smoothened激动剂。

在第四天和第五天，将上清液更换为含有10 µM SB431542、100 nM LDN193189、5 µM DAPT、5 µM SU5402、1 µM视黄酸和1 µM smoothened激动剂的KSR培养基与N2培养基的混合液（体积比为75% KSR : 25% N2）。在第六天和第七天，将上清液更换为含有5 µM DAPT、5 µM SU5402、1 µM视黄酸和1 µM smoothened激动剂的KSR培养基与N2培养基的混合液（体积比为50% KSR : 50% N2）。在第八天和第九天，将上清液更换为含有5 µM DAPT、5 µM SU5402、1 µM视黄酸和1 µM smoothened激动剂的KSR培养基与N2培养基的混合液（体积比为25% KSR : 75% N2）。

在第10天和第11天，将上清液更换为添加了5 µM DAPT、5 µM SU5402、1 µM视黄酸和1 µM smoothened激动剂的N2培养基。在第12天，将每孔中的上清液更换为100 µL添加了20 ng/mL脑源性神经营养因子的成熟培养基。为诱导运动神经类器官形成，将PDMS芯片中的包被溶液更换为150 µL添加了20 ng/mL脑源性神经营养因子的成熟培养基，并使用宽口微量移液吸头将96孔板中一个孔的运动神经元球体轻柔地加入芯片微通道的入口中。

在培养皿中，将一小 reservoir 无菌水置于组织培养芯片附近，以防止培养基蒸发，并将培养皿放入 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中。每两到三天，从培养基 reservoir 中央更换一半耗尽的培养基，补充新鲜的成熟培养基，其中添加 20 纳克/毫升的脑源性神经营养因子。轴突将从运动神经元球体生长进入微通道，并在两到三周内自发组装成单一束状结构，形成运动神经类器官。

在三维分化过程中，运动神经元在12至14天内完成分化。重要的是，在分化期间，超过60%的细胞表达运动神经元标志物HB9，而在运动神经元球体中约80%的细胞呈SMI32阳性。通过微通道作为物理引导，轴突在引入球体后24小时内从运动神经元球体延伸，并通过轴突-轴突相互作用形成束状结构。

在接下来的三到四天内，轴突到达微通道的中心区域，再经过10天后延伸至微通道的另一端。通过将PDMS从显微镜载玻片上剥离，可从芯片上收集运动神经类器官用于生物学分析。随后可在显微镜下使用手术刀或镊子对轴突束和细胞体进行解剖和分离。

在运动神经类器官的轴突束中，通过蛋白质印迹法无法检测到树突标记蛋白。必须确保类球体完全沉降至培养芯片的底部。我们展示了对芯片侧面和底部的观察有助于确定类球体在芯片中的位置。

分离的轴突束可用于多种其他方法的检测。可获得大量轴突并用于需要大量材料的生化检测。