Name: 三维运动神经器官生成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 了解利用人诱导多能干细胞和PDMS微流控芯片生成三维运动神经器官的技术。该方法通过轴突自发组装形成束状结构，为研究运动神经元疾病机制和药物筛选提供了更贴近生理的体外模型。

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本研究由日本科学促进会（JSPS）科学研究费补助金17H05661和18K19903、Core-to-Core计划以及Beyond AI研究所资助。

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<li>Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons+within+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips.</a> JoVE. (147), e59250(2019).</li>
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<li>Kirihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Tissue+Model+of+a+Cerebral+Tract+Connecting+Two+Cortical+Regions%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions.</a> iScience. 14, 301-311 (2019).</li>
<li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li>
<li>Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Cortical+Spheroids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Suspension+Bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).</li>
</ol>

在本方案的部分内容中，一项专利已授权给由 Jiro Kawada 创立的 Jiksak Bioengineering, Inc.。

本方案描述了一种运动神经类器官（MNO）的构建方法，该类器官由人诱导多能干细胞（iPS细胞）分化生成的运动神经元球体延伸出轴突束。所形成的轴突束结构厚实、柔韧，并呈现良好的单向有序排列。通过分离轴突束，可获得足量且高纯度的轴突蛋白和RNA，适用于生化分析。利用钙成像技术，可在轴突束和神经元球体中检测神经元活性。Western blot检测未发现轴突裂解物中存在细胞核和树突蛋白的污染，表明本方法能高效地将轴突与胞体及树突分离。
该方案的一个优势在于能够快速分化并生成带有轴突束的运动神经元类器官（MNO），采用三维方案可在4周内完成全部过程，而二维方案则需5至6周。与其他方案相比，这一时间较短，因为其他方案通常仅将胚胎干细胞和诱导多能干细胞分化为运动神经元就需要3至4周。17 并且需要额外2-4周才能获得轴突延伸。由于分化时间更短、步骤更少，且与二维方案相比无需解离步骤，技术风险更低，因此通常优先采用三维方案。基于微流控的组织培养芯片设计为使运动神经元的轴突可通过微通道向另一腔室延伸，从而通过诱导轴突-轴突相互作用及轴突间的亲和性，促进轴突束的形成。由于实验装置简单，此处描述的所有方案不仅可由熟悉组织培养芯片操作的生物工程师完成，也适合不熟悉微流控和微加工技术的生物学家和神经科学家。需要注意的是，步骤1和步骤2也可通过外部加工服务完成。
完成该方案的关键步骤之一是培养基的顺序更换。建议在分化过程中的每一步都完全更换培养基，以避免耗尽的培养基中的因子干扰运动神经元的分化。该方案的另一个关键点是保持未分化iPS细胞的良好质量。初始iPS细胞培养的质量显著影响获得运动神经元和运动神经元球（MNO）的效率。此外，运动神经元球（MNS）的直径应小于芯片孔径（1.5 mm）。过大的类球体无法进入腔室，并可能在中心区域发生严重的缺氧性坏死。MNS的大小可通过调整初始接种的iPS细胞数量（在3D方案中）或运动神经元数量（在2D方案中）来控制。细胞的接种密度应针对每种iPS细胞系进行优化。
带有微沟槽和小孔径滤膜的分区微流控装置已被广泛用于将轴突与细胞体及树突分离开来。该技术还能实现轴突与细胞体及树突的分离，并在束状组织中获得更高丰度的轴突。与其它方法相比，该方法的一个主要局限在于，当前组织培养芯片的设计无法分离两种不同的培养基，从而限制了需要两种不同培养基的两类细胞共培养的应用。另一个局限是，PDMS芯片对组织尺寸施加了预先设定的限制：大于孔径的类球体无法进入腔室，且轴突束的生长厚度不能超过微流控通道的宽度。
该方法可应用于其他类型的神经元。本研究团队已证明，通过结合脑类器官技术并采用改进的方法，能够构建脑部神经束18。将皮层类球体引入两个腔室后，轴突会自发地相互向对方类球体延伸，并最终自发形成轴突束。结果表明，两个皮层类球体可通过轴突束连接，且该组织可作为一个整体被完整获取。这说明该方法在构建轴突束组织方面具有高度通用性，不受神经元细胞类型的限制。本方案中使用了人诱导多能干细胞（iPS细胞），但其他干细胞（如人胚胎干细胞和人神经干细胞）也可在对本方案进行适当修改后加以应用。神经元的三维类球体可通过多种不同方案生成19,20。未来，这种构建含轴突束组织的方法有望与其他用于生成三维运动神经元类球体的分化方案相结合。此外，通过简单调整组织培养芯片中微通道的宽度和高度，即可控制轴突束的厚度和长度，为后续发展提供可调控性。
我们认为，该方案可用于药物测试与筛选，并有助于理解轴突束发育及其相关疾病的发生机制。

脊髓运动神经元（MN）向骨骼肌发出轴突以控制身体运动。在发育过程中，这些轴突的走行具有高度有序性和调控性。尽管已有大量关于轴突延伸与导向的研究1，但轴突束有序形成的机制仍处于探索阶段。运动神经元的轴突常因神经退行性疾病（如肌萎缩侧索硬化症，ALS）2 而受损，然而轴突束损伤的病理生理机制尚不明确。因此，该领域迫切需要建立一种能够重现轴突束形成与退化的生理和病理模型。
由人类干细胞衍生的运动神经元是研究发育过程及肌萎缩侧索硬化症（ALS）等疾病的一种有前景的平台3。利用患者来源的细胞所获得的人类诱导性多能干细胞（iPS细胞），可用于建立疾病模型。迄今为止，已有多种从多能干细胞分化为运动神经元（MN）的方法被报道4,5,6。然而，在二维培养条件下，神经元的轴突呈随机取向，无法模拟发育中神经内轴突通过密集的轴突-轴突相互作用进行单向排列的真实微环境7。为解决这一问题，我们开发了一种利用人类iPS细胞生成类似运动神经的三维组织的技术8，并将该组织命名为运动神经类器官（MNO）。MNO由位于运动神经元球状体（MNS）内的胞体和从球状体延伸出的轴突束组成。该轴突束中的轴突呈单向排列，类似于发育中运动神经内的轴突结构。因此，MNO独特地提供了以往任何已建立的神经元培养方法均未能实现的生理性轴突微环境。
在本方案中，我们描述了用于组织培养芯片制备、快速运动神经元分化以及在已开发芯片中形成运动神经类器官的方法。我们的组织培养芯片结构非常简单，仅包含一个用于容纳球状体的腔室、一个用于形成轴突束的微通道，以及一个用于容纳轴突末端的腔室。该装置不包含复杂的结构，例如常用于根据尺寸分离轴突和细胞体的微沟槽或微孔滤膜9,10。因此，只要具备光刻设备，即可按照本方案中描述的步骤轻松制备此类装置。
通过优化诱导和模式化因子（SB431542、LDN-193189、视黄酸（RA）和smoothened激动剂（SAG））以及加速因子（SU5402和DAPT）的组合，可实现人iPS细胞的快速分化。已有报道表明，SU5402与DAPT的联用可加速外周神经元和神经嵴细胞的分化11。在本方案中，我们提供了三种不同的MNOs生成方法，以便读者根据自身需求选择最合适的方法。我们推荐在形成球状体后进行人iPS细胞的分化（即三维方法），因为分化的MNS可直接转移至组织培养芯片中。 alternatively，人iPS细胞也可在单层（二维）培养条件下分化为运动神经元，随后如我们先前报道的那样形成三维运动神经元球状体8。我们已对方案进行了更新，采用本方案中描述的三维分化方法，可避免从二维向三维的转换过程，且能够在更短的分化时间、更少的操作步骤以及无需解离步骤的情况下获得MNOs，从而降低技术风险。此外，也可使用 commercially available neurons 生成MNS，以缩短分化所需时间。
为了生成微神经束（MNO），我们在组织培养芯片中培养了微神经球（MNS）。轴突从球状体延伸出来，进入微通道，在微通道中轴突聚集并单向排列。这促进了轴突之间的相互作用，并自发形成紧密组装的单向轴突束组织，该特性为本方案所独有，而其他方案仅能实现自发成束或引导轴突定向排列中的一项12,13,14。在典型实验中，仅有少量细胞从球状体迁移至微通道，大多数细胞仍停留在球状体附近。该方法使轴突能够自发地从球状体中分离出来，无需使用依赖尺寸的物理屏障（例如微沟槽或微孔滤膜）将轴突与胞体分离。
所得的运动神经类器官（MNO）可进行多种检测，包括形态学、生物化学和物理分析。通过切割可将细胞体和延伸的轴突束在物理上分离，并可分别用于后续实验，例如生物化学分析。仅从少数几束轴突中即可分离出RNA和蛋白质等生物材料，用于常规生物化学实验，包括RT-PCR和蛋白质印迹（western blotting）。本文中，我们描述了一种由诱导多能干细胞（iPS细胞）生成运动神经类器官的实验方案，该模型为研究轴突束发育及其相关疾病机制提供了理想的生理与病理研究平台。

<table><tbody><tr><td>(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)-1-三氯硅烷</td><td>Sigma</td><td>440302</td><td></td></tr><tr><td>16% 甲醛（多聚甲醛）水溶液</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>200&amp;micro;宽口移液器吸头</td><td>BMBio</td><td>BMT-200WRS</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>Violamo</td><td>2-8588-01</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ICT</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>B-27添加剂（50倍浓缩）</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>脑源性神经营养因子（BDNF）</td><td>和光</td><td>020-12913</td><td></td></tr><tr><td>CO2培养箱</td><td>松下</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10</td><td>干细胞技术</td><td>07959</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Dojindo Laboratories</td><td>CS22</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 补充剂</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>生长因子减少型基质胶（基底膜基质）</td><td>康宁</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>HB9 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-22542</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>和光</td><td>085-09355</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>iCell 运动神经元（商品化的人iPS细胞来源的运动神经元）</td><td>细胞动态</td><td>R1051</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇（IPA）</td><td>和光</td><td>166-04836</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清替代物（Knock Out Serum Replacement）</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Sigma</td><td>SML0559</td><td></td></tr><tr><td>MEA探针</td><td>Alpha MED Scientific 公司</td><td>MED-P5004A</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸溶液（100倍浓缩）（NEAA）</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>显微镜玻璃</td><td>Matsunami</td><td>S9111</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>干细胞技术</td><td>05825</td><td></td></tr><tr><td>N2 补充剂</td><td>和光</td><td>141-08941</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>光刻胶 SU-8 2100</td><td>微化学</td><td>#SU-8 2100</td><td></td></tr><tr><td>96U 表面包被</td><td>住友电木</td><td>MS-9096U</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR（传代试剂）</td><td>干细胞技术</td><td>05872</td><td></td></tr><tr><td>视黄酸</td><td>和光</td><td>186-01114</td><td></td></tr><tr><td>SAG</td><td>Sigma</td><td>SML1314</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>和光</td><td>192-16541</td><td></td></tr><tr><td>硅片</td><td>SUMCO</td><td>PW-100-100</td><td></td></tr><tr><td>Silpot 184 w/c 试剂盒</td><td>Dow Toray</td><td>Silpot 184 w/c 套件</td><td></td></tr><tr><td>Smi32 抗体</td><td>Biolegend</td><td>801701</td><td></td></tr><tr><td>SU5402</td><td>Sigma</td><td>SML0443</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 显影液</td><td>微化学</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>突触素 I 抗体</td><td>默克密理博</td><td>Ab1543</td><td></td></tr><tr><td>不含酚红的 TrypLE Express 液体（解离液）</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td></td></tr><tr><td>Tuj1 抗体</td><td>Biolegend</td><td>801202</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>和光</td><td>030-24021</td><td></td></tr></tbody></table>

三维运动神经类器官的生成

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

轴突束是神经系统中观察到的主要结构模式之一。轴突束的破坏可能导致发育性和神经退行性疾病。尽管已有大量关于轴突的研究，但由于缺乏可靠的三维体外模型，我们对轴突束形成及其功能障碍的理解仍然有限。本文中，我们描述了一种基于微流控组织培养芯片从人诱导多能干细胞（iPS细胞）快速生成运动神经类器官（MNO）的逐步实验方案。首先介绍了该方法所用芯片的制备过程。从人iPS细胞出发，形成运动神经元球体（MNS）。随后，将分化后的MNS转移至芯片中。此后，轴突会自发地从球体中生长出来，并在芯片内置的微通道内组装成束，从而形成携带从球体延伸出的轴突束的MNO组织。在后续分析中，可将MNO从芯片中取出，用于固定以进行形态学分析，或进行解剖以开展生化分析、钙成像以及多电极阵列记录。利用本方案生成的MNO有助于药物测试与筛选，并有助于揭示轴突束发育及其相关疾病机制。

在三维分化程序中，运动神经元在12至14天内完成分化（图4 和 图5）。重要的是，在分化过程中，超过60%的细胞表达运动神经元标志物HB9。免疫组织化学结果显示，MNS中约80%的细胞为SMI32阳性的运动神经元。HB9和SMI32是公认的早期运动神经元标志物15,16。HB9和SMI32的表达是确认运动神经元细胞身份所需验证的关键参数。将MNS引入培养芯片后，轴突延伸进入微通道并形成轴突束。由于微通道起到物理引导作用，轴突从MNS延伸出来，并通过轴突-轴突相互作用形成束状结构（图6A）。必须通过显微观察确认轴突束的形成，以验证MNO的成功构建。一个成功的MNO应具有宽度超过50 μm的轴突束，且通道中束外孤立轴突较少。在类球体接种后24小时即可观察到轴突的初始延伸。在接下来的3至4天内，轴突到达微通道中心，并在随后的10天内延伸至另一端（图6A）。最终，轴突在芯片中于2至3周内组装形成笔直且单向的轴突束，之后可观察到神经元活动。
可通过将PDMS从显微镜载玻片上剥离，从芯片中收集运动神经类器官，用于生物学分析（图6B）。在显微镜下使用手术刀或镊子切割，可分离并获取轴突束和细胞体（图6B）。这些生物材料（包括RNA和蛋白质）可用于常规生化检测，如RT-PCR和蛋白质印迹（western blotting）。在MNOs的轴突束中，蛋白质印迹检测不到细胞核或树突标志蛋白（图6C）。
结合钙离子指示剂（Fluo-4 AM），可在组织培养芯片中捕捉神经元活动。在MNO中观察到类球体及轴突束中运动神经元的自发活动。此外，还使用多电极阵列系统观测了神经活动。
<img alt="微流控通道设计示意图；用于流体动力学分析的尺寸与几何结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：PDMS组织培养芯片的尺寸。 
(A) 组织培养芯片的光刻掩模图。(B) 组织培养芯片中微通道的尺寸。用于容纳运动神经元球体的基底腔室直径为2 mm，PDMS腔室上方的孔径为1.5 mm。连接两个腔室的微通道宽度和高度均为150 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="iPS细胞分化过程、2D/3D方案、类球体形成、运动神经元类器官示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：运动神经元分化的示意图。 
(A) 分化步骤包括神经诱导、定向分化为运动神经元谱系以及运动神经元的成熟过程。(B) 从iPS细胞生成运动神经元类球体（MNS）的两种方案：3D方案，以及包含运动神经元解离步骤的2D方案。两种方案均可获得运动神经元类器官（MNO）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="实验PDMS装置中的静态平衡过程；PDMS包被、孵育、培养流程图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：基底膜基质包被及运动神经元球体引入的逐步操作流程。 
(A) 在组织培养芯片的通道内进行基底膜基质包被。(B)) 将运动神经元球体（MNS）引入芯片的孔中。(C)) 通过吸除耗尽的培养基来更换培养液。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="随时间推移的干细胞分化；显微镜图像；从-D2到D12的发育阶段。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：二维和三维运动神经元分化。 
(A) 典型的三维MNS分化时间进程（三维方案）。MNS的尺寸随时间逐渐增大。比例尺：500 μm。(B) 二维分化在-D2、D0、D1、D6、D12的时间进程（二维方案）。比例尺：500 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="3D 和 2D 神经元培养图像；使用 SMI-32、Synapsin、TUJ1、HB9 标记物进行免疫荧光染色。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：运动神经元的表征。 
(A)（左）使用 SMI-32 抗体和 DAPI 染色的运动神经元球（MNS）冰冻切片。（中）重接种于基底膜基质包被表面的 MNS 的相差图像，可见轴突延伸。（右）重接种 MNS 的轴突经 Synapsin I 和 Tuj1 抗体染色。比例尺：500 μm（左和中）和 50 μm（右）。(B) 二维培养运动神经元经 Tuj 和 HB9 抗体免疫染色的代表性图像。比例尺：200 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="轴突分离过程；微流控装置、荧光标记、Western blot蛋白标志物" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig06.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：在培养芯片中生成的运动神经类器官（MNO）的表征。 
(A) 第32天轴突延伸及粗大轴突束形成的代表性图像。比例尺：500 μm。(B) 运动神经类器官（MNO）经SMI-32和DAPI免疫荧光染色。轴突与胞体可通过物理切割实现分离。比例尺：1 mm。(C) 通过Western blot定量分析轴突与胞体来源蛋白的纯度。树突标志物MAP2在轴突蛋白中未被检测到，而轴突标志物Tau1在轴突蛋白中富集。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案提供了一种全面的流程，通过在组织培养芯片中由类球体自发组装延伸出强健的轴突束，从而构建人诱导多能干细胞来源的运动神经类器官。

神经束是神经系统中观察到的主要结构模式之一。神经束的破坏可能导致发育和……

该方案通过体外培养源自人iPS细胞的运动神经类器官，促进对轴突束发育及其相关疾病机制的研究。通过简单地培养神经球和定制的微培养芯片，可自发形成单向轴突束，并可用于多种下游实验。运动神经类器官能够提供比以往体外系统更接近生理状态的模型，从而有助于针对包括肌萎缩侧索硬化症（LS）在内的运动神经元病药物的筛选与测试。在通风橱内，穿戴适当的个人防护装备，将三毫升 SU-8 2100 涂布于经丙酮清洁的硅片上，并将硅片置于匀胶机中心。通过真空固定硅片，先以每分钟 500 转的速度旋转 10 秒，使 SU-8 在硅片表面均匀涂布，随后以每秒 300 转的加速度加速至每分钟 1,500 转，继续旋转 30 秒，以获得厚度为 150 微米的光刻胶层。软烘后，将光掩模安装至掩模对准器，并将硅片暴露于紫外光下照射 60 秒。在加热板上烘烤后，将晶圆置于光刻胶显影液中，在轨道摇床上搅拌显影10至20分钟，并在过程中更换一次显影液。为制备用于组织培养的芯片底层，将新配制的PDMS倒入晶圆至所需厚度，并在真空腔室中对混合物进行脱气处理。将PDMS在60摄氏度的烘箱中固化至少三小时。冷却后，使用刀片将固化的PDMS从硅片上切下，然后利用未固化的PDMS并通过加热固化将其与中层储液池键合至PDMS底层，从而获得组装好的PDMS组织培养芯片。为准备用于运动神经类器官形成的PDMS芯片，需将芯片和一块76毫米×52毫米的显微镜玻璃置于含有70%乙醇的培养皿中，消毒至少一小时。孵育结束后，将芯片放置在湿润的显微镜玻璃上。经过过夜干燥后，芯片应牢固粘附于玻璃上。在通道入口的一侧放置30微升用DMEM/F12稀释的基底膜基质液滴，并从入口的另一侧抽吸溶液，以使微通道表面被基质均匀包被。随后将含有包被溶液的PDMS芯片置于培养皿中，在室温下孵育1小时。为诱导3D iPS细胞分化为运动神经元，将4 × 10⁴个iPS细胞每孔接种至96孔U型底培养板的相应孔数中，每孔体积为100 µL，培养基为添加10 µmol/L Y-27632的无饲养层和无血清细胞培养基。次日，将每孔上清液更换为100 µL含10 µmol/L SB431542和100 nmol/L LDN-193189的KSR培养基。第2天和第3天，将各孔上清液更换为100 µL KSR培养基，其中添加10 µmol/L SB431542、100 nmol/L LDN-193189、5 µmol/L DAPT、5 µmol/L SU5402、1 µmol/L视黄酸和1 µmol/L smoothened激动剂。在第四天和第五天，将上清液更换为含有10 µM SB431542、100 nM LDN193189、5 µM DAPT、5 µM SU5402、1 µM视黄酸和1 µM smoothened激动剂的KSR培养基与N2培养基的混合液（体积比为75% KSR : 25% N2）。在第六天和第七天，将上清液更换为含有5 µM DAPT、5 µM SU5402、1 µM视黄酸和1 µM smoothened激动剂的KSR培养基与N2培养基的混合液（体积比为50% KSR : 50% N2）。在第八天和第九天，将上清液更换为含有5 µM DAPT、5 µM SU5402、1 µM视黄酸和1 µM smoothened激动剂的KSR培养基与N2培养基的混合液（体积比为25% KSR : 75% N2）。在第10天和第11天，将上清液更换为添加了5 µM DAPT、5 µM SU5402、1 µM视黄酸和1 µM smoothened激动剂的N2培养基。在第12天，将每孔中的上清液更换为100 µL添加了20 ng/mL脑源性神经营养因子的成熟培养基。为诱导运动神经类器官形成，将PDMS芯片中的包被溶液更换为150 µL添加了20 ng/mL脑源性神经营养因子的成熟培养基，并使用宽口微量移液吸头将96孔板中一个孔的运动神经元球体轻柔地加入芯片微通道的入口中。在培养皿中，将一小 reservoir 无菌水置于组织培养芯片附近，以防止培养基蒸发，并将培养皿放入 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中。每两到三天，从培养基 reservoir 中央更换一半耗尽的培养基，补充新鲜的成熟培养基，其中添加 20 纳克/毫升的脑源性神经营养因子。轴突将从运动神经元球体生长进入微通道，并在两到三周内自发组装成单一束状结构，形成运动神经类器官。在三维分化过程中，运动神经元在12至14天内完成分化。重要的是，在分化期间，超过60%的细胞表达运动神经元标志物HB9，而在运动神经元球体中约80%的细胞呈SMI32阳性。通过微通道作为物理引导，轴突在引入球体后24小时内从运动神经元球体延伸，并通过轴突-轴突相互作用形成束状结构。在接下来的三到四天内，轴突到达微通道的中心区域，再经过10天后延伸至微通道的另一端。通过将PDMS从显微镜载玻片上剥离，可从芯片上收集运动神经类器官用于生物学分析。随后可在显微镜下使用手术刀或镊子对轴突束和细胞体进行解剖和分离。在运动神经类器官的轴突束中，通过蛋白质印迹法无法检测到树突标记蛋白。必须确保类球体完全沉降至培养芯片的底部。我们展示了对芯片侧面和底部的观察有助于确定类球体在芯片中的位置。分离的轴突束可用于多种其他方法的检测。可获得大量轴突并用于需要大量材料的生化检测。

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三维运动神经器官生成

该视频展示了利用微流控装置形成神经肌肉接头的过程。将神经前体细胞和肌源性前体细胞分别接种到装置内的不同小室中，并使其分别成熟为运动神经元和肌管。通过建立体积和化学梯度，诱导形成具有活性的神经肌肉接头。...

使用微流控装置生成神经肌肉接头

本视频展示了通过以下步骤创建运动神经类器官的方法：首先将人诱导多能干细胞在特定培养基中培养形成球状体，然后利用特定抑制剂将其分化为运动神经元，最后在微流控芯片中进行培养，以促进轴突延伸并形成运动神经类器官。...

利用微流控芯片开发人诱导多能干细胞来源的运动神经类器官

本视频展示了将人胚胎干细胞（hESCs）分化为多巴胺能神经元的过程，以提供研究帕金森病的模型。将hESCs在微孔板中的神经诱导培养基中培养，形成三维神经球。随后在神经诱导培养基中继续培养，以促进其分化为多巴胺能前体神经元。最终神经元的成熟过程在培养小室中的气液界面条件下进行，从而形成由成熟多巴胺能神经元组成的三维类器官。...

由人胚胎干细胞生成多巴胺能神经元类器官

本研究介绍并描述了两种特定人源神经类器官的培养方案 ，作为研究以下两个方面的相关且精确的模型：1）仅在人源神经类器官内研究人脑胶质母细胞瘤的发展；2）生成三维类器官以诱导多巴胺能神经元分化。...

人脑类器官在脑癌与神经退行性疾病研究中的应用

我们描述了一种在市售微流控装置中生成人类运动单位的方法，该方法通过共培养人诱导多能干细胞来源的运动神经元与人原代中血管母细胞来源的肌管细胞，从而形成功能性活跃的神经肌肉接头。...

在微流控装置中生成具有功能性神经肌肉接头的人类运动单元

本文介绍了一种利用人诱导性多能干细胞（iPSCs）生成脑类器官的实验方案。为了大量且高质量地获得脑类器官，我们使用自制的微型生物反应器。...

利用自制微型生物反应器由诱导性多能干细胞生成脑类器官

本研究提供了一种详细的技术方法，用于建立一种简单且稳健的皮质类器官培养体系，该体系基于标准的无饲养层人多能干细胞（hPSC）培养系统。该方案快速、高效且可重复，可用于生成模拟脑衰老特征的类器官。 体外.

稳健且高度可重复的皮质脑类器官生成方法用于模拟脑神经元衰老 体外

尽管周围神经系统（PNS）在损伤后具有显著的修复能力，但调控这一现象的细胞和分子机制仍知之甚少。通过使用活体转基因斑马鱼和可重复的神经横断实验，我们能够研究神经变性和再生过程中胶质细胞的动态行为。...

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中枢神经系统中的星形胶质细胞在受到有害刺激时会改变其功能和结构特性。本报告介绍了一种在疾病状态或治疗干预后评估星形胶质细胞三维形态的实验方案。...

星形胶质细胞三维共聚焦形态计量分析方案

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三维成像与分析人表皮内神经纤维中的线粒体

了解利用人诱导多能干细胞和PDMS微流控芯片生成三维运动神经器官的技术。该方法通过轴突自发组装形成束状结构，为研究运动神经元疾病机制和药物筛选提供了更贴近生理的体外模型。

三维运动神经类器官的生成

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