Name: 胰腺癌矫形小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 了解胰腺癌小鼠模型的原位植入与远端胰腺切除术。该技术结合共感染原位模型与安全的胰腺切除方法，可用于测试辅助与新辅助治疗策略，为肿瘤学研究提供可靠工具。

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作者已获得阿夫纳胰腺癌基金会的支持。

所有实验程序均经新南威尔士大学动物护理与伦理委员会批准（17/109A）。本方案使用8至10周龄、体重16至19 g的雌性裸鼠（Balb/c nude小鼠）。小鼠饲养于独立通风隔离笼中，自由摄取市售颗粒饲料和饮水。 随意摄取.
1. 原位胰腺癌移植
<ol>
	<li>准备细胞以进行移植。首先，计算该操作所需的细胞数量（每只动物需要 1 × 106 个荧光素酶标记的 AsPC-1 细胞和 1 × 106 个癌相关人胰腺星状细胞 [CAhPSCs]）。
	<ol>
		<li>将这些细胞置于湿度和温度可控的 CO2 培养箱中培养，并定期进行支原体检测。AsPC-1 和 CAhPSCs 所用的培养基分别为 RPMI 1640（含 300 mg/L L-谷氨酰胺、20% v/v 胎牛血清、1% v/v 青霉素/链霉素）和 IMDM（含 4 mM L-谷氨酰胺、10% v/v 胎牛血清、1% v/v 青霉素/链霉素）。</li>
		<li>采用标准细胞培养技术将细胞消化为单细胞悬液。使用两倍于胰蛋白酶溶液体积的相应完全培养基中和胰蛋白酶。</li>
		<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤这些细胞两次，并重悬于 50 μL 细胞悬液中，其中包含 1 × 106 个 AsPC-1 细胞和 1 × 106 个 CAhPSCs。</li>
		<li>将该悬液置于冰上，直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为操作准备 II 级生物安全柜。在加热垫上覆盖无菌塑料布。操作过程中如需放大视野，可使用 2.5 倍至 3.5 倍放大倍率的外科手术放大镜。</li>
	<li>通过在纱布敷料上剪一个直径为 1 cm 的孔来制备荷包缝合纱布。用荷包缝线固定该孔。可使用任何细编织缝线（例如 5/0 聚乙醇酸缝线）。推荐使用编织缝线材料，因其在收紧后可使松结保持原位。如 图 1a 所示。</li>
	<li>通过腹腔注射给予小鼠 80 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 赛拉嗪进行麻醉。</li>
	<li>皮下注射 5 mg/kg 恩诺沙星作为抗生素预防，2.5 mg/kg 氟尼辛作为镇痛剂，并注射 1 mL 0.9% 生理盐水。</li>
	<li>麻醉后，将小鼠仰卧位放置于无菌区域，并依次使用聚维酮碘和 70% 乙醇进行皮肤消毒。</li>
	<li>在腹部左侧头侧象限的皮肤上做一纵行切口，然后在镊子之间切开肌层进入腹腔。</li>
	<li>用 29 G 胰岛素注射器吸取 50 μL 细胞悬液——相当于每次注射含有 1 × 106 个 CAhPSCs 和 1 × 106 个荧光素酶标记的 AsPC-1 细胞。将注射器安装至注射装置上。该注射装置的设计与功能详见 图 1b 及其图注。</li>
	<li>将荷包缝合纱布覆盖于剖腹切口上，然后通过纱布孔将脾脏和胰尾拉出体外。收紧荷包缝线，轻柔地环绕胰体部，使胰尾暴露以便注射。缝线应足够紧，使纱布与胰腺周围充分接触，但同时不能造成压迫。</li>
	<li>用镊子夹住胰尾并轻轻施加侧向张力。以浅角度用针头穿刺腹侧腹膜表面，然后使用注射装置缓慢、可控地将细胞悬液注入胰腺（持续 10−15 秒）。</li>
	<li>在注射过程中，仔细观察是否有渗漏——包括注射部位周围（反流）以及胰小叶对侧（穿透性穿刺）。若出现可见渗漏，应立即停止注射，并通过检查注射器内剩余注射液体积记录渗漏量。若渗漏量较小（&#60;10 μL），则用纱布吸除渗漏液，并将针头重新定位至另一胰小叶完成注射。</li>
	<li>将脾脏和胰腺复位，使用 5/0 聚乙醇酸缝线连续缝合腹壁。用钉皮器关闭皮肤。</li>
	<li>将小鼠置于加温笼中监测，直至从麻醉中恢复。待其清醒并警觉后，将其移回原饲养笼中。</li>
</ol>
2. 癌症切除手术：远端胰腺切除术与脾切除术
<ol>
	<li>切除手术相对于移植的时间可能因实验方案而异。通常，在切除前让肿瘤生长至少3周，但应根据所移植的特定癌细胞系通过实验优化该时间。</li>
	<li>在切除手术前一天，对动物进行生物发光成像，以确认存在局部原发性肿瘤。请注意，该成像仅用于排除具有明显胰腺外病变的小鼠，不应将肿瘤大小或辐射通量作为判断是否适合切除的阈值。
	<ol>
		<li>称量小鼠体重，并通过腹腔注射给予D-荧光素（150 mg/kg）。</li>
		<li>通过绘制荧光素动力学曲线，确定每次实验中成像步骤相对于荧光素注射的时间点。辐射通量高于其最大值90%的时间段即为生物发光成像的最佳时机（本实验中为注射后18至26分钟）。</li>
		<li>使用异氟烷（分别为4%诱导、3%维持）与氧气混合麻醉并维持麻醉状态，并使用生物发光成像设备（例如IVIS Lumina II）进行成像。采用自动曝光和binning设置（但可根据预期的辐射通量进行优化）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备II级生物安全柜以进行操作。在加热垫上覆盖无菌塑料布。解剖过程中使用2.5倍至3.5倍放大倍率的外科手术放大镜以提供视觉辅助。</li>
	<li>通过腹腔注射给予小鼠80 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg赛拉嗪进行麻醉。</li>
	<li>皮下注射5 mg/kg恩诺沙星作为抗生素预防，2.5 mg/kg氟尼辛作为镇痛剂，并给予1 mL 0.9%生理盐水。</li>
	<li>将小鼠仰卧位置于无菌操作区域，依次使用聚维酮碘和70%乙醇进行皮肤消毒准备。</li>
	<li>在腹部左侧头侧象限的皮肤做纵行切口，优先选择通过之前的手术切口部位。</li>
	<li>钝性分离皮肤与下方肌肉腹壁，然后放置Alm自持式牵开器以保持切口开放。</li>
	<li>在镊子夹持下于前次手术缝合线一侧切开肌层，并延长切口以完整切除前次缝合线。</li>
	<li>将脾脏和胰腺远端外翻并向前上方牵拉。在胰腺尾部，结肠可能通过薄膜状粘连附着于此。若发现此类粘连，应钝性分离结肠。</li>
	<li>小心将一对镊子从胰体及脾血管后方穿过并打开该间隙，从而游离出一段胰腺以便后续结扎。</li>
	<li>使用钛夹在肿瘤近端结扎胰体，然后用电凝法在结扎远端横断胰腺。另一种处理胰腺残端的方法是在横断前使用5/0聚乙醇酸缝线连续结扎。</li>
	<li>将胰腺向尾侧牵拉，并电凝位于脾脏头极与胃之间的胃脾血管。</li>
	<li>移除标本并确认止血完全。</li>
	<li>使用5/0聚乙醇酸缝线连续缝合腹壁，皮肤则使用钉皮器闭合。</li>
</ol>
3. 术后管理
<ol>
	<li>在麻醉后的即刻阶段（上述两种操作均适用），将小鼠置于加温的笼子中，监测其直至从麻醉中恢复。一旦小鼠清醒并警觉，将其移回原有笼具中。在术后期间，持续监测动物的疼痛表现及痛苦迹象。通过皮下注射给予 0.05 mg/kg&#160;的布托啡诺，并在接下来的 12 小时内密切观察动物状态。&#160;</li>
	<li>随后每日监测小鼠的体重、摄食量和活动情况。检查手术切口部位，并通过触诊评估肿瘤大小。于术后第 7 天拆除皮肤夹。</li>
	<li>若达到人道终点，则实施安乐死。人道终点包括：体重减轻超过 20%&#62;20%，出现无法缓解的痛苦症状（如弓背姿势、缺乏活动或理毛行为），以及通过外部触诊估计肿瘤体积超过 1 cm3。</li>
</ol>

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</ol>

作者对本项目无任何利益冲突需要披露。

胰腺癌的切除性原位小鼠模型非常重要，因为它可用于测试辅助治疗和新辅助治疗。这一点在胰腺癌中尤为关键，因为手术仍然是最有效的治疗方法，但术后复发风险很高。本文介绍了一种可靠的方法，能够构建出可通过切除治愈的胰腺癌模型，从而模拟临床上需要进行新辅助或辅助治疗的真实情况。
相对于现有方法的意义 
尽管辅助治疗和新辅助治疗在胰腺癌中具有重要意义，但文献中描述良好的原位切除小鼠模型却很少。这些已描述的切除模型在模拟人类临床情况的真实性方面存在差异。先前的模型大致可分为以下几类：(i) 仅在荧光引导下进行肿瘤切除；(ii) 不行脾切除术的部分胰腺切除；(iii) 远端胰腺切除术/脾切除术。
在已有报道中，采用荧光引导进行肿瘤切除的研究数量最多15,17,18,<sup class="xre...

胰腺导管腺癌（胰腺癌[PC]）的预后较差1。手术切除仍是目前唯一可能实现治愈的治疗方法，应考虑用于早期疾病患者。然而，即使进行了R0切除（即切缘无肿瘤残留），其复发率（局部复发或来自未被发现的转移性疾病）仍然很高2,3。因此，几乎所有接受切除手术的患者均需接受系统性辅助治疗4。此外，尽管目前新辅助治疗仅推荐用于临界可切除的癌症患者，但其适应证正在不断扩大，其常规应用已成为大量临床研究的重点5,6,7,8。为了开发涉及手术切除的新型胰腺癌治疗策略，必须首先在能够准确模拟临床情况的临床前模型中对这些策略进行评估。
过去，胰腺癌（PC）的原位小鼠模型常被用于测试药物治疗效果9,10。其中许多模型是通过将癌细胞单独注射到小鼠胰腺中建立的，所形成的肿瘤缺乏胰腺癌典型的显著间质成分。近年来，共注射原位模型逐渐被常规使用，例如我们首次建立的将人胰腺癌细胞与人胰腺星状细胞（PSCs，胰腺癌胶原性间质的主要产生细胞）混合注射的模型11,12。此类癌细胞与间质细胞共注射所形成的肿瘤具有（i）胰腺癌的肿瘤成分以及特征性的间质（促结缔组织增生性）成分，以及（ii）增强的癌细胞增殖和转移能力11。因此，该模型更接近人类胰腺癌的真实情况。尽管已有多种原位胰腺癌切除模型被报道13,14,15,16，但这些模型均未能像本模型一样准确反映人类胰腺切除术的临床实际情况，因此在辅助治疗或新辅助治疗的测试中效果欠佳。
本小鼠模型的研究目的是展示如何：（i）成功植入原位胰腺癌，同时最大限度减少意外的腹膜播散；（ii）随后完全切除肿瘤。本文重点介绍了该技术的操作要点及潜在注意事项。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;植入手术所需的动物、材料与设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AsPC-1 人胰腺癌细胞系，携带荧光素酶标记（来自 Promega PGL3 Basic 质粒的 luc+ 基因）</td><td>美国典型培养物保藏中心，马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国</td><td></td><td>由日本埼玉县埼玉医科大学的Takashi Murakami教授提供</td></tr><tr><td>Autoclip 伤口缝合钉，9 mm</td><td>Becton Dickson Pty Ltd，North Ryde，NSW，澳大利亚</td><td>500346</td><td></td></tr><tr><td>基础敷料包</td><td>澳大利亚新南威尔士州维拉伍德，Multigate Medical Products Pty Ltd公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>与癌症相关的人胰腺星状细胞</td><td>胰腺研究组细胞库</td><td></td><td>内部细胞库</td></tr><tr><td>冻存管，1.0 mL</td><td>赛默飞世尔科技澳大利亚有限公司，斯科雷比，维多利亚州，澳大利亚</td><td>366656</td><td></td></tr><tr><td>一次性不锈钢手术刀片（带手柄），15号</td><td>利文斯通国际， Mascot， 新南威尔士州</td><td>SCP15</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>澳大利亚维多利亚州图拉马林生命技术公司</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Gilles 细齿镊子 12 cm</td><td></td><td></td><td>通用不锈钢显微外科器械套装</td></tr><tr><td>用于手术期间及术后恢复期间维持体温的加热垫</td><td>通用</td><td></td><td></td></tr><tr><td>纯合型无胸腺裸鼠：品系 BALB/c-Fox1nu/Ausb，雌性</td><td>澳大利亚生物资源中心，莫斯维尔，新南威尔士州，澳大利亚</td><td></td><td></td></tr><tr><td>含4 mM L-谷氨酰胺且不含酚红的Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）</td><td>Life Technologies Corporation，Tullamarine，VIC，澳大利亚</td><td>21056023</td><td></td></tr><tr><td>11.5 cm 珠宝镊子</td><td></td><td></td><td>通用不锈钢显微外科器械套装</td></tr><tr><td>微针持针器（圆柄），15 cm，直型</td><td></td><td></td><td>通用不锈钢显微外科器械套装</td></tr><tr><td>微型剪刀（圆柄），15 cm，直刃</td><td></td><td></td><td>通用不锈钢显微外科器械套装</td></tr><tr><td>青霉素 10,000 U/mL，链霉素 10,000 &amp;mu;g/mL</td><td>生命技术公司，澳大利亚维多利亚州图拉马林</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>聚乙醇酸缝合线，美国药典规格5/0，配13毫米半圆形圆体针</td><td>Braun 澳大利亚私人有限公司，贝拉维斯塔，新南威尔士州，澳大利亚</td><td>C1049407</td><td></td></tr><tr><td>便携式电子秤</td><td>精密天平，Bradford，马萨诸塞州，美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>反射式夹钳施加器与夹钳移除器</td><td>美国佛罗里达州萨拉索塔市世界精密仪器公司</td><td>500345</td><td></td></tr><tr><td>含酚红和300 mg/L L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基</td><td>Life Technologies Corporation，Tullamarine，VIC，澳大利亚</td><td>11875085</td><td></td></tr><tr><td>圆柱形体腔扩张器 15 cm，0.1 mm 尖端</td><td></td><td></td><td>通用不锈钢显微外科器械套装</td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶，0.02% EDTA</td><td>澳大利亚维多利亚州图拉马林生命技术公司</td><td>25300054</td><td>对于胰腺星状细胞</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶，0.02% EDTA</td><td>澳大利亚维多利亚州图拉马林生命技术公司</td><td>25200056</td><td>对于 ASPC-1 细胞</td></tr><tr><td>U-100 胰岛素注射器，0.5 mL，29 G（0.33 mm） &amp;times; 13 mm 针头</td><td>美国马里兰州埃尔克顿市，泰尔茂医疗公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;切除手术所需设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alm 自动持针器牵开器</td><td></td><td></td><td>通用不锈钢显微外科器械套装</td></tr><tr><td>Autoclip 伤口夹 9 毫米</td><td>Becton Dickson Pty Ltd，北赖德，新南威尔士州</td><td>500346</td><td></td></tr><tr><td>基础敷料包</td><td>澳大利亚新南威尔士州维拉伍德，Multigate Medical Products Pty Ltd公司</td><td>08-559NP</td><td></td></tr><tr><td>一次性不锈钢手术刀片（带手柄），15号</td><td>Livingstone International，Mascot，新南威尔士州</td><td>SCP15</td><td></td></tr><tr><td>Gilles 细齿镊子 12 cm</td><td></td><td></td><td>通用不锈钢显微外科器械套装</td></tr><tr><td>手持式高温精细电烙器</td><td>Bovie Medical Corporation，Melville，NY，美国</td><td>AA01</td><td></td></tr><tr><td>用于手术期间及术后恢复期间维持体温的加热垫</td><td>通用</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina II 生物发光成像仪</td><td>美国马萨诸塞州霍普金顿，Caliper生命科学公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>11.5 cm 珠宝镊子</td><td></td><td></td><td>通用不锈钢显微外科器械套装</td></tr><tr><td>微针持针器（圆柄），15 cm，直型</td><td></td><td></td><td>通用不锈钢显微外科器械套装</td></tr><tr><td>微型剪刀（圆柄），15 cm，直型</td><td></td><td></td><td>通用不锈钢显微外科器械套装</td></tr><tr><td>聚乙醇酸缝合线，美国药典规格5/0，配13毫米半圆形圆体针</td><td>Braun 澳大利亚有限公司，贝拉维斯塔，新南威尔士州，澳大利亚</td><td>C1049407</td><td></td></tr><tr><td>便携式电子秤</td><td>精密天平，Bradford，马萨诸塞州，美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>反射式伤口缝合钉施加器与取钉器</td><td>美国佛罗里达州萨拉索塔，世界精密仪器公司</td><td>500345</td><td></td></tr><tr><td>圆柱形体腔扩张器 15 cm，0.1 mm 尖端</td><td></td><td></td><td>通用不锈钢显微外科器械套装</td></tr><tr><td>钛 &amp;ldquo;韦克式&amp;rdquo; Ligaclip，小型</td><td>HZMIM，中国杭州</td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于开放手术的小型钛合金 Ligaclip 施夹器</td><td>HZMIM，中国杭州</td><td></td><td></td></tr><tr><td>挥发性麻醉机，包括蒸发器和诱导室</td><td>通用型</td><td></td><td>通用型蒸发器与诱导室</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;用于操作的药物&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% w/w 乙醇溶液</td><td>Sigma-Aldrich Pty Ltd，Castle Hill，NSW，澳大利亚</td><td></td><td>作为外科皮肤准备的局部应用</td></tr><tr><td>布托啡诺 0.3 mg/mL</td><td>Troy Laboratories Pty Ltd，Glendenning，NSW，澳大利亚</td><td></td><td>剂量：0.05 mg/kg，皮下注射</td></tr><tr><td>D-荧光素（1 U/g）</td><td>PerkinElmer, Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>122799</td><td>用 PBS 稀释至 15 mg/mL。剂量：150 mg/kg，腹腔注射</td></tr><tr><td>恩诺沙星 50 mg/mL</td><td>澳大利亚新南威尔士州格伦登宁特洛伊实验室有限公司</td><td></td><td>剂量：5 mg/kg，皮下注射</td></tr><tr><td>氟尼辛 50 mg/mL</td><td>Norbrook Laboratories Australia，Tullamarine，VIC，澳大利亚</td><td></td><td>剂量：2.5 mg/kg，皮下注射</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Zoetis Australia Pty Ltd.，罗德，新南威尔士州，澳大利亚</td><td></td><td>剂量（与氧气一同雾化）：4% 用于诱导，3% 用于维持</td></tr><tr><td>氯胺酮 100 mg/mL</td><td>澳大利亚昆士兰州斯莱克斯克里克梅莱布</td><td></td><td>剂量：80 mg/kg，腹腔注射</td></tr><tr><td>聚维酮碘 10% w/v 溶液</td><td>Perrigo Australia，Balcatta，WA，澳大利亚</td><td>RIO00802F</td><td>作为手术皮肤准备，局部应用于腹部前侧</td></tr><tr><td>润眼膏（液体石蜡 42.5% w/w，软白石蜡 57.3% w/w）</td><td>Allergan Australia Pty Ltd，戈登，新南威尔士州，澳大利亚</td><td></td><td>双眼应用</td></tr><tr><td>0.9% w/v 氯化钠</td><td>Braun 澳大利亚私人有限公司，贝拉维斯塔，新南威尔士州，澳大利亚</td><td>9481P</td><td>剂量：900 &amp;mu;皮下注射 L</td></tr><tr><td>注射用水BP</td><td>辉瑞澳大利亚公司，悉尼，新南威尔士州，澳大利亚</td><td></td><td>用于药物稀释</td></tr><tr><td>Xylazine 20 mg/mL</td><td>澳大利亚新南威尔士州格伦登宁特洛伊实验室有限公司</td><td></td><td>剂量：10 mg/kg，腹腔注射</td></tr></tbody></table>

一种胰腺癌的原位切除小鼠模型

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

目前尚缺乏令人满意的动物模型，用于研究拟接受胰腺癌（PC）手术治疗的患者在辅助治疗和/或新辅助治疗中的疗效。为弥补这一不足，我们描述了一种小鼠模型，该模型涉及胰腺癌的原位移植，随后进行远端胰腺切除术和脾切除术。该模型已被证明在辅助治疗和新辅助治疗研究中具有良好的安全性，并且具备足够的灵活性，适用于多种治疗策略的研究。
在该模型中，首先通过将人胰腺癌细胞（荧光素酶标记的 AsPC-1）和人源癌相关胰腺星状细胞的混合物植入 Balb/c 裸鼠的胰腺远端，以生成胰腺肿瘤。三周后，通过再次剖腹手术、远端胰腺切除术和脾切除术对肿瘤进行切除。在该模型中，可利用生物发光成像技术监测癌症的发展进程以及切除/治疗的效果。切除术后可给予辅助治疗； alternatively，也可在切除术前给予新辅助治疗。
展示了来自45只小鼠的代表性数据。所有小鼠均成功接受了远端胰腺切除术/脾切除术，且无止血相关问题。43只（96%）小鼠实现了大于5 mm的肉眼可见近端胰腺切缘。胰腺切除手术的技术成功率为100%，早期死亡率和并发症发生率均为0%。术后一周内无动物死亡。
综上所述，我们描述了一种稳定且可重复的小鼠胰腺癌手术切除模型技术，该模型可模拟临床情况。此模型可能有助于辅助治疗和新辅助治疗的测试。

连续59只小鼠接受了植入手术。其中8只（14%）出现明显渗漏。注射时的渗漏程度评估方法如上文方案部分所述。为使植入的肿瘤生长三周后，进行术前生物发光成像，以排除在切除前已存在明显转移性疾病的动物。共有45只（76%）小鼠接受了手术切除。
所有45只（100%）小鼠均成功接受了远端胰腺切除术/脾切除术，术中止血无异常。43只（96%）小鼠获得了大于5 mm的肉眼可见近端胰腺切缘。
在切除时，45只小鼠中有9只（20%）发现局部转移——多数位于缝合线处（与原发肿瘤不连续），其中9只中的3只在胃大弯处显示额外的孤立结节，1只在肝脏表面显示包膜下结节。原发性胰腺肿瘤在5只（11%）小鼠中与缝合线粘连，在1只（2%）小鼠中与肝脏粘连。这些粘连组织均被整块切除（en bloc）。
手术时间（从麻醉诱导到切口闭合）的平均值（标准误）为22（0.9）分钟。切除术后1周内无动物死亡。
术后一周，对小鼠进行生物发光成像...

在临床背景下，局限性胰腺癌患者将接受胰腺切除术，随后进行辅助治疗。本方案旨在通过在裸鼠中进行原位胰腺癌移植，继而实施远端胰腺切除术和脾切除术，建立一种模拟该临床情景的安全且有效的方法。

目前尚缺乏令人满意的动物模型，用于研究拟接受胰腺癌手术治疗患者的辅助治疗和/或新辅助治疗。

本方案描述了一种稳定且可重复的小鼠胰腺癌手术切除模型，可用于辅助治疗和新辅助治疗的测试。该技术结合了共感染原位模型，能够有效模拟人类胰腺癌，并采用了安全有效的胰腺切除技术。尽管本方案描述的是免疫缺陷模型，但也可采用另一种免疫健全模型，即将KPC肿瘤细胞植入C57黑六小鼠体内进行实验。这种替代方法可用于测试免疫疗法。首先，将麻醉后的小鼠仰卧置于无菌区域，依次使用聚维酮碘和70%乙醇进行皮肤消毒。在腹部左前象限做一纵向切口以分离皮肤，并用镊子剪开肌层。将含有细胞悬液的注射器安装到注射装置上后，将荷包缝线棉签置于腹部切口上方，并通过棉签的开口将脾脏和胰腺尾部外置。轻轻收紧荷包缝线棉签，暴露胰腺尾部以进行注射，确保纱布与胰腺周围充分接触，但不对其造成压迫。用镊子夹住胰腺尾部，并轻轻施加侧向张力。用针头穿刺胰腺，针尖斜面向上，推进针头时将针尖略微向上抬起，直至针头斜面完全进入腹膜腔。以缓慢且可控的方式将细胞悬液注射至胰腺实质中。注射后，将针头在原位停留数秒钟，然后撤出，以尽量减少渗漏。使用浸有聚维酮碘的棉签轻轻蘸拭部位，以吸收意外泄漏的细胞悬液。将脾脏和胰腺复位至其解剖学原位，并用5-0聚乙醇酸缝线关闭腹壁。用皮夹关闭皮肤。在腹部左上象限的皮肤上做一个纵向切口，最好通过先前的切口位置。钝性分离皮肤与下方的肌肉性腹壁，并放置一个全自动自持牵开器以保持切口开放。在止血钳之间切开肌层，切口位于先前手术缝合线的一侧，然后延伸切口以切除整个先前的缝合线。通过向头侧牵拉，将脾脏和胰腺显露于体外。在此情况下，发现部分粘连附着于肿瘤的下表面，需用电灼法予以分离。结肠可能通过菲薄的粘连附着于胰腺的尾部。若发现此情况，直接钝性分离结肠。通过在胰体部脾脏血管后方小心地插入一对镊子，暴露需结扎的胰腺段。使用钛夹在肿瘤近端结扎胰腺，然后用电凝法在钛夹远端横断胰腺。或者，在横断前使用5-0聚乙醇酸缝线将胰腺连续结扎，以控制胰腺残端。小心地向尾侧牵拉胰腺，并在脾脏颅极与胃之间电凝胃脾血管。注意这些血管较细，若发生撕脱或电凝不充分，可能容易出血。此类血管可能回缩至腹腔内并引起出血，且出血可能难以控制。切除标本后，检查手术部位以确认止血完全。使用5-0聚乙醇酸缝线连续缝合腹壁，并用钉皮钉闭合皮肤。在连续接受植入手术的59只小鼠中，有8只出现了明显的渗漏。经过三周的肿瘤生长后，术前活体成像可排除患有明显转移性疾病的动物，使其不接受手术切除。最终共有45只小鼠接受了胰腺切除术。该操作在100%的小鼠中成功实施。其中，43只小鼠获得了大于五毫米的肉眼可见的胰腺近端切缘。在切除时，45只小鼠中有9只发现局部转移。除了缝合线处发生转移外，3只小鼠的胃大弯上观察到孤立性转移结节，1只小鼠的肝脏上观察到包膜下结节。6只小鼠出现局部胰腺外侵犯，其中5只小鼠直接侵犯至缝合线，1只小鼠侵犯至肝脏。术后1周，32只小鼠的最大辐射率比值低于10，提示残留病灶极少或无残留病灶。从麻醉诱导至关闭切口的平均手术时间为22分钟。切除手术中的关键步骤是识别位于脾血管和胰腺背侧的无血管胚胎平面。沿此平面进行分离可游离出一段胰腺，以便后续结扎。切除术后，可对小鼠进行辅助治疗。随后可根据当地动物伦理规范，结合活体成像、尸检结果和动物生存情况来评估疾病进展。

an-orthotopic-resectional-mouse-model-of-pancreatic-cancer

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科研

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Cancer Research

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