卵巢组织细菌的特征和功能预测
2021年10月23日
为了发现和区分原位癌和非癌卵巢组织的细菌，进行了免疫造血染色和16S核糖核化核糖核素（16S rRNA基因）测序。通过利用"未观测状态"（PICRUST）重建对社区的虫基和邻苯二甲酸酯遗传学调查来预测细菌的组成和功能差异。
该协议旨在发现卵巢组织中的细菌并预测其功能。免疫造血化学染色和16S rRNA测序，用于发现和区分原位癌和非癌卵巢组织的细菌。通过重建未观察到的日子，通过对社区的BOP和细胞遗传调查来预测细菌的补偿和功能差异。
我们的协议旨在从卵巢组织中提取细菌。它也可用于发现任何种类的肿瘤中的细菌。我们协议的主要优点是它简单方便，几乎每个实验室都能实现。
获得结果也很快。在协议中的练习中，重要的是排除任何细菌异位肿瘤组织。因此，本协议中的所有程序都需要无菌。
在手术过程中，用一对新的无菌钳将卵巢分离成大约一厘米厚的组织样本。在整个过程中避免触摸任何其他内容。分离后，将样品取出到无菌管中，放入液氮中进行传输。
将样品保存在零下80摄氏度。用正式组织修复组织，然后用石蜡嵌入组织。此协议可以在此处暂停。
组织可以保存在室温下以进行更长的保存。为了进一步操作，将样品切成五微米序列部分。然后，干燥样品。
对样品进行脱石蜡和补液。要检索抗原，需要在EDTA缓冲区进行10分钟的微波处理。将样品浸入含有0.3%氢气的PBS中。
过氧化20分钟，以阻止内源性过氧化酶活动。在 LPS 核心执行抗体 EMA，浓度为 1 超过 300。并在摄氏四度下维持一晚。
为了发现细菌，使用 DAP 基板套件来检测 HRP 的存在。根据制造商的说明，使用 HRP 聚合物、抗兔抗体。使用表浓缩器让抗体完全结合。
使用 PBS 消除未组合的抗体。按照制造商的说明进行化学染色，然后将样品冲洗到水下。对样品脱水。
通过签名来套取样品。并根据制造商的协议使用成像 Pro Plus 准备库作为示例输入。练习引物模式，该模式由基因特异性序列和 Illumina 适配器悬空核苷酸序列组成。
为了放大rRNA基因序列中细菌16sV4区域的出生率，使用放大PCR放大DNA样本输入的模板。使用 Mag-Bind RxNPure 加磁珠从 PCR 产品中去除反应组合。第二次执行指数化 PCR 放大。
使用安捷伦 2200 磁带站检查库。使用量子流 dsDNA 系统对库进行量化。v3 标准流细胞具有 600 个周期，可产生大约 100，000 个配对端。
2 倍 300 基 3.图书馆是去规范化、集中化和排序的。每个样品的原始速率根据修剪的测序质量进行过滤。
应同时删除引物和适配器序列。序列读取与对和质量低于25应缩短。通过软件包 QIIME 分析 16s rRNA。
收集序列以形成具有相似性截止值的 OTUs，对于 OTUs，应在每个样本中计算相对丰度。使用 Bayesian 分类器，该分类器在 RDP 培训集中对所有序列进行排序。在给定的 OTU 中，将具有序列主要一致性的分类分配给 OTU。
OTUs 基于样本组信息与席尔瓦数据库对齐。执行字母多样性和基于 UniFrac 的主要坐标分析。要预测相关说明细菌的特征，请使用 BugBase。
预测 PICRUST 的元基因组的功能组成。使用监控数据和包含参考基因组的数据库，在 STAMP 软件的帮助下分析每个组之间的不同功能。使用一个统计软件来计算结果。
统计意义的指示应设定为 p 小于 0.05。通过学生的 t 测试计算混淆因素（包括年龄和均等值）。通过Chi-square测试计算更年期状况、高血压史和糖尿病。
通过曼-惠特尼 U 测试计算卵巢细菌分类数。16名患者参加了这项研究。BugBase 用于对预测的元信息进行实践分析。
使用抗菌LPS抗体的卵巢的潜在病原体和免疫造血术。这个数字显示了癌症和对照组的细菌丰富性和多样性。通过 16S rRNA 测序显示。
这些数字是观察到的物种指数。超1指数、ACE指数、香农指数、均匀指数、辛普森指数。卵巢样本中植物的相对丰度和12种最丰富的细菌物种如图所示。
图A、B、C和D表示对照组患者卵巢和卵巢癌组中面板的相对丰度。对照患者卵巢和卵巢癌组12种最丰富的细菌的相对丰度。这是最常见的，使用PCoA和相对丰度的氧纳龙西比里库姆和梅萨诺萨尔西纳真空。
图 A 显示了使用 PCOA 聚类的最常见值。PC1 和 PC2 绘制在 x 和 y 轴上。红块等于卵巢癌组的样本。
蓝色圆等于对照组中的示例。卵巢癌组的样本可以从对照组的其他样本中分离出来。图 B 显示了使用 PCOA 聚类的最常见。
PC1 和 PC2 绘制在 x 和 y 轴上。红色块等于卵巢癌组的样本。蓝色固体圆等于子宫肌瘤患者的样本。
蓝色空心圆等于子宫腺瘤患者的样本。图 C 显示了氧纳龙西比里库姆的相对丰度。图 D 是梅萨诺萨尔西娜真空。
这个数字是预测的元基因组学的BugBase分析。癌症组卵巢的潜在致病性和氧化抗压表型强于对照组。通过PICRUSt分析，这个数字与癌症和对照组之间的KEGG路径空间有显著差异。
当我们得到我们的样品，一对新的无菌钳子是需要的。注意样品的潜在污染。这种细菌的异地肿瘤组织可能会极大地影响解决。
首选将控制组设置为每个步骤。为了减少潜在污染的影响。
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概述
该协议旨在发现并区分原位癌性和非癌性卵巢组织中的细菌。免疫组织化学染色和16S rRNA测序用于预测细菌的组成和功能差异。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 肿瘤学
- 免疫学
背景
- 了解卵巢组织中的细菌组成可以为癌症生物学提供洞见。
- 免疫组织化学染色允许在组织样本中可视化细菌。
- 16S rRNA测序是一种识别细菌物种的强大工具。
- 预测工具如BugBase和PICRUSt可以根据其遗传信息推断细菌功能。
研究目的
- 从卵巢组织中提取并识别细菌。
- 比较癌性和非癌性组织中的细菌种群。
- 预测已识别细菌的功能角色。
使用的方法
- 免疫组织化学染色用于组织可视化。
- 16S rRNA基因测序用于细菌识别。
- BugBase用于预测细菌组成。
- PICRUSt用于预测细菌之间的功能差异。
主要结果
- 在癌性和非癌性卵巢组织中识别出不同的细菌种群。
- 功能预测指出两种组织类型之间的代谢能力差异。
- 该协议可适用于各种肿瘤类型。
结论
- 本研究为理解细菌在卵巢癌中的作用提供了框架。
- 这些方法易于实施，可以在大多数实验室中应用。
- 进一步的研究可能探索这些细菌群落在癌症进展中的影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding microbial presence in ovarian tissues addresses a growing need to de-risk cancer target hypotheses by revealing microenvironmental factors that may influence tumor biology. This protocol enables biopharma R&D to assess bacterial contributions to oncogenic pathways, supporting mechanistic insight in early discovery. By providing a standardized method to detect and functionally predict tissue-associated microbes, it aids in prioritizing targets with stronger translational confidence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates tumor microenvironment hypotheses by identifying bacteria differentially abundant in cancerous versus non-cancerous ovarian tissues.
- Operational Value: Uses immunohistochemistry and 16S rRNA sequencing to spatially resolve and quantify bacterial presence in situ.
- Predictive Value: Employs BugBase and PICRUSt to infer functional phenotypes, such as pathogenicity and oxidative stress tolerance, linked to cancer phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantifiable 16S rRNA sequencing outputs suitable for comparative microbial profiling across sample groups.
- Reproducibility: Incorporates contamination controls and sterile tissue handling to ensure reliable detection of true tissue-associated signals.
- Scalability: Compatible with high-throughput sequencing and bioinformatics pipelines for broader application across tumor types.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Detects microbial signatures in human ovarian cancer tissues, supporting relevance to human pathophysiology.
- Translational Continuity: Enables longitudinal tracking of microbial shifts from normal to malignant states, informing biomarker discovery.
- Mechanistic De-risking: Predicts functional microbial contributions (e.g., metabolic pathways) that may modulate tumor progression or therapeutic response.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation to preclinical validation, particularly in immuno-oncology and microenvironment-focused programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing whether specific bacteria are enriched in tumor tissues and associated with cancer phenotypes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative microbial profiling data that can be integrated with multi-omics datasets for target prioritization.
- Analytics: Provides functional predictions via BugBase and PICRUSt, enabling comparison of metabolic and phenotypic potentials between groups.
- Translational Research: Connects microbial detection to cancer biology through differential abundance and functional inference in patient-derived tissues.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other solid tumors, allowing cross-cancer microbiome studies using a standardized workflow.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking microbial presence to functional phenotypes in cancer-relevant pathways.
- Operational Value: Employs accessible techniques (IHC, 16S sequencing, bioinformatics) feasible in most research laboratories.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by identifying microbial confounders or modulators of tumor biology early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target selection by accounting for microenvironmental variables that may affect drug efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, molecular biology, and bioinformatics for sequencing and functional prediction.
- Necessitates sterile tissue handling, PCR equipment, sequencing platforms, and tools like QIIME, Trimmomatic, and STAMP.
- Demands standardized protocols across sites to minimize contamination and ensure comparability of microbial data.
- Must account for host tissue variability and low biomass challenges when applying to other organ systems.
- Limited by detection sensitivity in low-abundance communities and dependence on reference databases for functional inference.
