Name: 基于核磁共振的片段筛选，样品最少，自动化程度最高 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 了解基于核磁共振的片段筛选方法，用于药物发现中的蛋白质与RNA靶点研究。该自动化工作流程通过高通量样品制备和先进数据分析，显著提高筛选效率与数据质量，加速先导化合物识别。

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本工作由iNEXT-Discovery资助，项目编号871037，资金来自欧洲委员会的“地平线2020”计划。

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</ol>

基于核磁共振的片段/药物筛选的多功能性 BMRZ已成功实施了先进的自动化核磁共振（NMR）仪器，以及饱和转移差（STD-NMR）、水配体观测通过交换转移（waterLOGSY）和弛豫实验，用于在广泛的亲和力范围内识别药物发现中的片段。所安装的硬件包括高通量样品制备机器人、高通量样品存储系统、样品更换装置及数据采集单元，均与一台600 MHz谱仪相连。最近购置的低温探头用于 1H, 19F, 13C 和 15N 确保了所提出测量所需的灵敏度，并允许 1H (1) 去耦期间 19F检测。该探头连接至最新一代的NMR控制台，可使用布鲁克（Bruker）提供的先进软件工具，包括CMC-q、CMC-assist、CMC-se和FBS（包含在TopSpin中）。基于片段的筛选（fragment-based screening, FBS）工具已集成于最新版TopSpin软件中，有助于分析高通量数据，包括STD、水LOGSY、T2/1r-弛豫实验。通过使用样品填充机器人，可自动将液体一维¹H样品装入核磁共振管中。. 通常，一个96管（3 mm）的样品块可在约两小时内完成填充。96孔板架可直接放置于高通量样品转换器中，样品转换器读取样品块上的条形码，并通过自动化软件将核磁共振（NMR）样品管分配至相应的实验中IconNMR)可将五个96孔板架存放在HT样品更换器中并进行编程&#160;同时，每个独立样品架的温度均可单独控制和调节。此外，每个样品在测量前均可进行预处理（包括预热和管路干燥以去除冷凝湿气），使其达到所需的温度。
适用于多种应用领域。 这种基于自动化核磁共振（NMR）筛选的广泛应用之一是识别和开发与生物大分子靶标（DNA/RNA/蛋白质）结合的新型配体。这些配体可包括通常以非共价方式结合的正构或变构抑制剂。此外，基于NMR的片段筛选（FBDD）通常用作选择有前景化合物的第一步，其实现所需满足的条件是能够获得足量的生物分子靶标。该目标可分为两个主要任务。
任务一：构建并表征内部片段库，原因如下：对1000多个片段进行初始和定期的质量控制、表征与定量；测定片段在针对每个靶标（特别是蛋白质靶标）优化的缓冲液中的溶解度；建立多个片段库以容纳多样化的骨架结构，并扩展至其他大分子类别。任务二：通过核磁共振（NMR）整合基于片段的药物设计（FBDD）工作流程，包括：自动化的1D配体观测筛选（1H 和 19F 观测）；自动化的置换实验（与（天然）配体进行竞争实验），以区分正构和变构结合；多个片段的自动化二级筛选；自动化2D蛋白质筛选；利用EU-OPENSCREEN库或其他任何片段库，对初始命中化合物的系列衍生物进行二级筛选；以及使用FDA库对选定靶标进行重新筛选。
此外，可对多种细胞系（与疾病相关）进行代谢表型分析，以揭示细胞周期调控与代谢之间关联的调控机制。同时，还可对RNA/DNA/蛋白质的调控元件进行功能表征。 体内 和 体外 用于优化构建体/结构域（针对结构研究的稳定性优化（缓冲液、pH、温度和盐筛选）），以及将基于核磁共振的片段筛选技术拓展至膜蛋白和内在无序蛋白，这些蛋白通常难以通过其他技术手段进行研究。
局限性。19F 和 1H 片段库的使用各有优缺点，以下将提及其中几点。19F 相较于 1H 检测的最大优势在于实际检测时间以及后续分析的速度更快，因为混合物中包含的片段数量几乎多出一倍，所需进行的实验次数也更少。后续分析对于 19F 筛选而言也更为简便，由于不存在缓冲液的干扰，且在片段混合物设计优化的情况下，19F 具有更宽的化学位移范围，几乎不会出现信号重叠。谱图本身也大大简化，通常每个片段仅有一个或两个信号，具体取决于氟原子的数量。因此，这些谱图的分析可以实现自动化，从而进一步节省时间。但代价是化学多样性较低，至少在本研究所使用的片段库中如此。由于该库中仅约 13% 的片段含有 19F，而所有片段天然均可用于 1H 筛选，因此 19F 筛选所用片段的多样性较低。这一问题可通过使用专门设计的、包含更多片段且化学多样性更广的 19F 片段库来克服。19F 筛选的另一个缺点是每个片段产生的信号数量较少。通常情况下，片段包含的氢原子不止一个，因此基于 1H 检测的筛选实验可利用同一片段的多个不同信号来确认结合事件，从而在识别阳性结果时具有更高的置信度；而 19F 筛选则只能依赖每个片段提供的一个或两个信号。
本文详细介绍了基于现代自动化核磁共振（NMR）的片段筛选仪器、软件、分析方法及相关实验方案。所配备的硬件包括高通量样品制备机器人，以及与600 MHz谱仪相连的高通量样品存储、样品更换和数据采集单元。近期安装的低温探头支持1H、19F、13C和15N检测，确保了所需检测灵敏度，并可在19F检测期间实现1H去耦。此外，最新一代NMR控制台支持使用先进的分析软件，辅助数据采集和实时分析。上述技术、工作流程及所描述的实验方案，将有助于采用NMR进行片段筛选（FBS）的研究人员取得显著成果。

基于片段的筛选现已成为一种常用方法，用于鉴定对蛋白质、DNA和RNA等大分子靶标具有弱结合能力的结构相对简单且分子量较低的分子（分子量 &#60;250 Da）。初筛获得的阳性片段可作为基础，进一步对商业可得的更大结构类似物进行二次筛选，并采用基于化学的片段生长或连接策略。一个成功的基于片段的药物发现（FBDD）平台通常需要具备以下几个要素：一种可靠的生物物理方法用于检测和表征弱结合信号、一个片段库、一个生物大分子靶标以及后续化学优化策略。在药物发现项目中，常用的四种生物物理方法包括热迁移实验、表面等离子共振（SPR）、晶体学和核磁共振波谱法（NMR）。
核磁共振（NMR）波谱技术在基于片段的药物发现（FBDD）各个阶段中展现出多种作用。除了确保片段库中的片段在优化的缓冲体系中具有化学纯度和溶解性外，基于配体观测的NMR实验能够检测到片段与靶标之间低亲和力的结合，而基于靶标观测的NMR实验则可描绘出片段的结合表位，从而支持深入的构效关系研究。在表位定位过程中，基于NMR的化学位移变化不仅能够识别正构结合位点，还能发现可能隐匿且仅在生物大分子靶标的所谓“激发态”构象中才可接近的变构位点。如果生物大分子靶标已结合内源性配体，可通过基于NMR的竞争实验，轻松将所鉴定出的片段命中化合物归类为变构或正构调节剂。测定配体-靶标相互作用的解离常数（KD）是FBDD过程中的重要环节。可通过基于NMR的化学位移滴定实验（无论是观测配体还是观测靶标）便捷地测定KD。NMR的一大优势在于，相互作用研究在溶液中进行，且接近生理条件，因此可探测所有构象状态，用于分析配体/片段与其靶标之间的相互作用。此外，基于NMR的方法不仅限于对结构明确的可溶性蛋白进行筛选，还正被应用于更广泛的靶标类型，包括DNA、RNA、膜结合蛋白以及内在无序蛋白1。
片段库是基于片段的药物发现（FBDD）过程中不可或缺的一部分。通常，片段作为初始前体，最终会成为针对特定生物靶点开发的新抑制剂的一部分（子结构）。已有多种药物（如Venetoclax2、Vemurafenib3、Erdafitinib4、Pexidartnib5）被报道最初来源于片段，目前已在临床中成功应用。通常，片段是低分子量（&#60;250 Da）的有机分子，具有较高的水溶性和稳定性。一个精心设计、通常包含数百个片段的片段库，即可有效探索化学空间。片段库的总体组成随着发展不断演进，通常通过将已知药物拆解为更小的片段获得，或通过计算方法设计而成。这些多样化的片段库主要包含平面芳香环或杂原子，并遵循Lipinski五规则6 ，或当前商业上流行的三规则7 ，同时避免含有反应性基团。一些片段库还来源于高溶解性的代谢物、天然产物或其衍生物8。大多数片段库面临的一个普遍挑战是下游化学修饰的便利性。
位于法兰克福歌德大学的生物分子磁共振中心（BMRZ）是iNEXT-Discovery（用于转化研究的核磁共振、电子显微镜和X射线基础设施-发现项目）的合作伙伴，该项目是面向所有欧洲地区生物化学与生物医学研究领域研究人员的结构研究基础设施联盟。在2019年结束的前期iNEXT计划中，构建了一个包含768个片段的片段库，其设计目标为&#34;最少数量的片段，最大程度的多样性&#34;，以覆盖广泛的化学空间。此外，与其他任何片段库不同，iNEXT片段库还基于&#34;预设片段&#34;的概念进行设计，旨在简化后续合成复杂、高亲和力配体的过程，因此该库也被称为内部库（Diamond、结构基因组联盟及iNEXT）。
通过核磁共振（NMR）建立基于片段的药物发现（FBDD）需要人力、专业知识和仪器设备。在BMRZ，已开发出优化的工作流程，以提供针对NMR片段筛选的技术支持。这些流程包括片段库的质量控制与溶解度评估9、针对选定靶标优化缓冲条件、基于1H或19F观测的一维配体筛选、用于区分正构与变构结合的竞争实验、基于二维的靶标观测NMR实验以进行表位作图，以及对初始片段命中化合物的二级衍生物集合进行相互作用表征。BMRZ已建立用于小分子-蛋白质相互作用分析的自动化流程，相关方法在以往文献中已有报道10,11，并配备了基于NMR的片段筛选所需的全部自动化基础设施。该中心已实施饱和转移差谱NMR（STD-NMR）、通过梯度观测水-配体信号的NMR（waterLOGSY）以及基于Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG-based）的弛豫实验，以识别在广泛亲和力范围内结合的片段，并配备了用于药物发现的先进自动化NMR仪器与软件。尽管基于NMR的片段筛选在蛋白质研究中已较为成熟，但该方法在发现与RNA和DNA相互作用的新配体方面应用较少。BMRZ已建立新方案的概念验证，可用于识别小分子-RNA/DNA相互作用。本文后续部分将报告这些筛选流程在蛋白质和RNA样品中的应用，旨在为生物大分子研究领域的广大用户提供已建立的标准化操作方案参考。

<table><tbody><tr><td>Bruker Avance III HD</td><td></td><td>Bruker</td><td>600 MHz 核磁共振波谱仪</td></tr><tr><td>Matrix Clear 聚丙烯 2D 条形码开口顶部储存管</td><td>3731-11 0.75ML V型底管/带卡扣架</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>条形码管</td></tr><tr><td>Matrix SepraSeal 和 DuraSeal&amp;amp;</td><td>4463 盖板，SeptraSeal 10/箱</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>SampleJet</td><td></td><td>Bruker</td><td>高通量样品更换器</td></tr><tr><td>SamplePro 管</td><td></td><td>Bruker</td><td>移液机器人</td></tr></tbody></table>

以最少样品和最大程度自动化模式进行基于核磁共振的片段筛选

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

基于片段的筛选（FBS）是学术界和工业界药物发现过程中一种经过充分验证且被广泛接受的方法。基于核磁共振（NMR）的片段筛选最大的优势在于，它不仅能够检测到跨越7至8个数量级亲和力的结合分子，还能监测片段的纯度和化学质量，从而获得高质量的阳性结果，并最大限度地减少假阳性或假阴性。在FBS中，一个必要的前提是需对片段库进行初始及定期的质量控制，以确定片段在相关缓冲液中的溶解度和化学完整性，并建立多个片段库以覆盖多样化的骨架结构，从而适应不同类型的生物大分子靶标（如蛋白质/RNA/DNA）。此外，还需针对样品用量、采集与分析速度，在生物分子构建体/片段空间、条件空间（缓冲液、添加剂、离子、pH值和温度）以及配体空间（配体类似物、配体浓度）等方面，对基于NMR的筛选方案进行系统优化。迄今为止，在学术界，这些筛选工作大多仍以手动方式进行，且规模极为有限，导致不仅在药物开发过程中，而且在化学探针开发背景下，可用的筛选基础设施都非常稀缺。为了以经济高效的方式满足上述需求，本文介绍了一系列先进的工作流程。这些流程利用最新的高端硬件设备，可将液体样品以自动化方式、在控温条件下装入NMR样品管中。1H/19F NMR配体检测谱图随后在设定温度下采集。高通量样品更换器（HT样品更换器）可在控温样品架中同时处理超过500个样品。结合先进的软件工具，可显著加快数据的采集与分析速度。此外，本文还描述了该筛选流程在蛋白质和RNA样品中的应用，旨在为生物大分子研究领域的广大用户提供可参考的标准操作方案。

片段文库的质量控制 
内部片段文库中的片段以50 mM的储备液形式提供，溶剂为90% d6-DMSO和10% D2O（其中10%的D2O可有效减少因反复冻融导致的化合物降解14）。单个化合物样品由1 mM配体溶于50 mM磷酸缓冲液（25 mM KPi pH 6.2 + 50 mM KCl + 5 mM MgCl2）中制备，pH值为6.0，溶剂组成为90% H2O/9% D2O/1% d6-DMSO。1H-NMR实验在500/600 MHz NMR波谱仪上对iNEXT文库中的片段进行检测。该数据进一步用于通过CMC-q软件在1H筛选实验中识别单个化合物，该软件可实现光谱的全自动采集；同时使用分析插件CMC-a评估片段的质量（包括溶解度和完整性）。CMC-a的自动化分析结果以图形化方式输出，形式类似于图3所示。图形输出呈现一个96孔板的布局，红色圆圈表示该片段在结构或浓度上存在不一致，绿色孔位则表示片段一致可靠。
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig03.jpg" /> 
图3：片段文库的质量控制。 基于CMC-a的自动化输出示意图。对片段的浓度和结构完整性等性质进行评估。绿色表示一致，橙色表示不一致。对于不一致的片段，按照所示工作流程进行人工修正。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
在DMSO和缓冲液中，约65%和35%的片段分别被分类为一致和不一致。此外，经过对谱图的仔细人工检查后，30%被分类为不一致的配体变为一致9。
19F 混合物设计 
从内部化合物库中选取的103个含有一个或多个氟基团的片段被分为5个混合物（A、B、C、D、E），每个混合物包含20至21个片段。在此情况下，必须谨慎设计混合物以避免信号重叠。19F横向弛豫实验针对每种混合物进行测定，并应用了CPMG脉冲序列。通过调整弛豫延迟时间，可对这些实验条件进行优化。混合物A-E的19F化学位移如图4所示。
<img alt="图 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig04.jpg" /> 
图 4：来自内部文库混合样品的19F 1D-NMR 谱图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
样品制备 
19F 筛选实验中的样品制备可通过手动操作或使用移液&#160;机器人进行自动化移液完成。每种混合物中的片段浓度为 2.5 mM，溶剂为 90% d6-DMSO 和 10% D2O。筛选样品的最终体积为 170 µL，其中含有 5% D2O 作为锁场溶剂。每种混合物分别移取两份：一份加入不含靶标的缓冲液中，另一份加入含靶标的缓冲液中。靶标与片段的比例设定为 1:1，最终靶标/配体浓度为 50 µM。此外，还需设置对照样品：一份为筛选缓冲液中仅含靶标生物分子的样品，用于确保靶标完整性；另一份为仅含缓冲液和 D2O 的样品，用于确保缓冲液质量。
如第3.1节所述，对19F-1D和19F-CPMG-T2进行了NMR筛选检测。&#160;例如，在RNA的情况下，采用跳返回波序列（pp = zggpjrse,15）在缓冲液中对单一靶标样品进行检测。
数据分析 
在多个靶标中，19F筛选方法已应用于大肠杆菌（E. coli）的TPP核糖开关thiM以及结核分枝杆菌（M. tuberculosis）的蛋白酪氨酸激酶（PtkA）16。19F筛选文库包含103个片段，分为5个混合物，标记为Mix A至E。筛选样品的制备可手动完成，无需使用样品移液机器人。将40 µM的thiM RNA溶液（缓冲条件）与各混合物中的3.2 µL组分混合。此外还制备了对照样品，包括仅含缓冲液的样品、含5% DMSO的缓冲液（此前已确认生物大分子在目标DMSO浓度下的稳定性），以及含RNA的缓冲液。共制备13个筛选样品，并转移至3 mm NMR样品管中。扫描NMR管的条形码后，按照前述在298 K下进行的19F NMR实验，分别测定各混合物在有RNA和无RNA存在下的信号，以及对照样品的信号。对thiM RNA与本实验室文库的筛选通过执行T2测量完成，针对每个不同样品分别采用0 ms和200 ms的CPMG脉冲序列。测量结束后，通过比较所有样品额外测得的1H 1D谱图中DMSO峰的展宽程度和强度损失，评估匀场效果和水峰抑制情况。所获得的CPMG T2&#160;19F弛豫谱图使用TopSpin中预先编写并自动化的宏程序进行处理。数据分析按照本方案部分所述的步骤进行。通过预设条件和阈值，可使用预先制作的电子表格或任何类似软件快速、简便地分析TopSpin获得的积分数据。如前所述，设定阈值有助于区分结合物、弱结合物或非结合物。图5分别展示了thiM RNA和PtkA的典型CPMG谱图结果。在某些情况下，还需进一步由专家进行复核。
<img alt="图 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig05.jpg" /> 
图 5：截取的19F CPMG NMR 谱图，显示基于 CPMG 实验在不同延迟时间下获得的信号强度变化。 （A）在大肠杆菌E. coli的TPP核糖开关thiM RNA上进行的19F片段筛选实验中，结合物（阳性信号）与非结合物的示意图。（B）在结核分枝杆菌M. tuberculosis的PtkA蛋白上进行的19F片段筛选实验中，结合物与非结合物的示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
1H 筛选
混合物设计 
所使用的内部化合物库具有高度多样性，因此针对1H筛选无需进行混合物设计。这意味着通过随机选择12个化合物组成一组混合物，共制备了64组混合物。
样品制备 
针对一种典型的 SARS-CoV-2 RNA 进行 1H 筛选时，采用移液机器人进行自动化移液以制备样品。每种混合物中的片段浓度为 4.2 mM，溶剂为 90% d6-DMSO 和 10% D2O。筛选样品的终体积为 200 µL，其中含有 5% D2O 作为锁场试剂。共制备 64 个不含靶标 RNA 的样品，每个样品含有不同的混合物，缓冲体系为 25 mM KPi、50 mM KCl，pH 6.2。相应地，另制备 64 个含有靶标 RNA 的样品，每个样品也含有不同的混合物。RNA 与配体的比例设定为 1:20，使 RNA 浓度达到 10 µM，配体浓度为 200 µM。
数据分析 
对于1H分析，使用TopSpin中的FBS工具。为确定某个片段是否为阳性结果，需进行一维化学位移、waterLOGSY和T2弛豫实验。在T2弛豫实验中，信号强度降低超过30%即判定为阳性；在化学位移实验中，位移大于6 Hz为判定阈值。waterLOGSY实验必须显示出显著的信号变化（本实验中为从负信号变为正信号）。若上述三项标准中有任意两项呈阳性，则该片段被判定为阳性结果。两个示例见图6。
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig06.jpg" /> 
图6：对代表性SARS-CoV-2 RNA进行的1H筛选，显示命中判定标准。三项不同实验的采集结果（1H T2 CPMG（5/100 ms）、waterLOGSY 和 1D 1H）。&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
Hit-1 的 T2 下降约 50%，且化学位移扰动（CSP）≥ 6 Hz。waterLOGSY 实验的信号变化不够显著，因此不计为阳性。由于三项实验中有两项为阳性，该片段被判定为阳性片段。对于 Hit-2，T2 信号强度下降约 80%，且 waterLOGSY 可观察到明显的信号变化。尽管该情况下 CSP 未达到显著水平，但由于前两项标准均为阳性，仍被判定为阳性片段。

基于核磁共振的片段筛选是一种快速鉴定小分子与生物大分子（DNA、RNA 或蛋白质）结合的有效方法。本视频介绍了基于自动化样品制备和核磁共振实验的实验方案 &amp;#38; 采集条件和分析流程进行了介绍。该技术可实现对两者的最佳利用 1H 和 19用于检测的 F 核磁共振活性核。

基于片段的筛选（FBS）是药物发现过程中在学术界和工业界均得到充分验证和广泛认可的一种方法。其最大的……

我们开展核磁共振研究，这使我们能够确定蛋白质、RNA 和 DNA 在溶液中的结构。这些生物大分子是细胞的组成成分，而本文所介绍的实验方案涉及小分子的筛选及其与这些靶标分子的结合。从这些分子出发，我们的药物化学与结构生物学研究能够开发出对抗疾病的新药。本技术的主要优势在于，我们能够完全控制分子靶标（如蛋白质）的质量，同时也能完全控制小分子片段及药物的质量，并且还可以对蛋白质进行广泛亲和力范围的结合筛选，这是相较于其他方法的优势所在。为准备用于核磁共振（NMR）检测的筛选样品，需使用样品制备机器人将768种化合物分配至八个96孔板中，从而获得64个混合物，每个混合物包含12个片段，最终浓度为每混合物4.2毫摩尔。将目标生物大分子用适当的筛选缓冲液稀释后，转移至相应数量的带条形码的三毫米核磁共振高通量样品更换管中，并使用机器人将每种配体混合物各10微升加入每根含有目标生物大分子的样品管中。随后，由机器人充分混合各溶液。进行核磁共振检测时，将样品装入波谱仪中。打开波谱仪软件，然后选择基于配体实验的参数集和脉冲序列。对于所列出的所有实验，选择激发塑形法作为水信号抑制方法。对于氟-19筛选，选择一维（1D）和T2实验。将谱宽设置为220 ppm，激发频率设置为140 ppm，分析时间设置为1至5小时。对于T2，CPMG时间应在5至100毫秒之间交替变化。记录T1r和T2实验。将饱和转移差值记录为伪二维谱。处理两个单维谱时，使用AU程序的ProcStd功能，可选择是否使用relax选项。WaterLOGSY为单维谱，其溶剂信号应以负相位进行相位校正。为分析氢谱筛选数据，请按照片段筛选工具的说明，存储筛选实验中获得的生物分子磁共振核磁共振（NMR）数据，使每个筛选混合物都有其独立的目录，且该目录下包含一个子目录，用于存放针对该样品所测量的不同实验数据。将参考谱图数据存储在独立目录中，这些参考样品包含混合物和单个化合物，但不含生物分子靶标。创建一条指向包含所采集数据目录的直接路径，并选择NMR目录，其中所有混合物应各自拥有独立的子目录。确保 CSV 文件、片段筛选文件、XML 文档和 BAC 文件也已复制到数据的 NMR 目录中。要对已筛选的样本使用基于片段的筛选工具，请将基于片段的筛选项目符号拖入分析窗口中央。如果之前保存的数据集已复制到该目录中，此符号应会显示。基于片段的筛选选项窗口应自动打开。选择一个包含混合物名称、各个片段名称以及各片段在混合物中分配情况的 CSV 鸡尾酒文件。定义一个参考配体光谱文件夹，其中包含所有单个片段的实测光谱数据，并定义一个参考空白实验文件夹，该文件夹通常包含不含被研究靶标的混合物数据集。为了定义待分析的光谱及光谱显示颜色，请打开“光谱类型”选项卡，并根据工艺数据设置光谱类型。在“显示布局”选项卡中，根据光谱类型定义将进行比较的光谱。然后，单击“确定”以启动项目。在数据处理过程中，将打开一个独立窗口，显示汇总所有混合物组合及每种混合物中配体的表格。双击单元格可打开相应的数据集。在指定结合分子之前，需确保参考峰相互匹配且化学位移相同。若观察到差异，请打开“处理”选项卡，使用串行处理选项进行校正。对于氟-19混合物的首次分析，请打开“分析”选项卡并选择积分功能。确保为混合物中每个组分的相应氟-19信号明确定义清晰的积分区域。保存导出的积分区域，以便将来使用时导出积分文件，并将任何已使用的积分文件保存到相应的安装目录中。对于氟-19 数据，打开包含或不包含被测目标的 dataset，在“分析”选项卡下，单击“积分”并选择“读取导入积分区域”，以将相应的积分文件加载到当前谱图中。然后，单击“保存并返回”，在“积分”选项卡中定位积分区域列表，并将此信息复制到电子表格中以进行下游分析。使用分子置信度软件分析片段库中配体的分子结构或组成，并以图形化形式展示结果。橙色表示该片段在结构或浓度上存在不一致，绿色表示该片段一致。在此代表性分析中，从内部化合物库中选取了103个含有一个或多个氟基团的片段，将其分为五组混合物，每组包含20至21个片段。对每种混合物均进行了氟-19横向弛豫实验，并应用了CPMG脉冲序列。如在这些典型的硫胺素蛋白酪氨酸激酶A和RNA谱图中所观察到的，阈值可用于界定混合物中的结合物、弱结合物或非结合物。在此代表性分析中，化合物“hit one”的T2弛豫时间减少了约50%，且化学位移大于或等于6赫兹。WaterLOGSY实验未显示显著的信号变化，因此不计为阳性。但由于三项实验中有两项结果为阳性，该片段仍被判定为有效命中。对于第二个阳性结果，T2信号强度下降了约80%。WaterLOGSY实验也观察到明显的信号变化。该实验中的化学位移变化虽不显著，但由于前述两项标准均为阳性，仍将其判定为阳性结果。这些方法的最终目标是开发出针对某些靶点（例如酶）的新药物或高亲和力抑制剂，在这一过程中，药物化学将接手并合成这些新分子；而结构生物学及其在此应用的技术能够指导药物化学研究，使该过程大大加快。

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