Name: 三维细胞外囊泡的直接随机光学重建显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 了解直接随机光学重建显微镜（dSTORM）技术，用于三维纳米级可视化细胞外囊泡（EVs）和病毒颗粒。该方法突破衍射极限，为疾病生物标志物发现和病毒感染机制研究提供高分辨率成像工具。

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我们感谢牛津纳米成像公司提供的建设性反馈和指导。本工作由R.P.M.获得的5UM1CA121947-10项目和D.P.D.获得的1R01DA040394项目资助。

1 细胞系的传代与维持
<ol>
	<li>获取人骨肉瘤细胞（U2OS），并将细胞置于添加了10%无外泌体胎牛血清和1×青霉素/链霉素溶液的生长培养基中。 
	注意：无外泌体胎牛血清的制备方法参照McNamara等26所描述的方案。</li>
	<li>将U2OS细胞在37 °C、5% CO2条件下，置于铜涂层培养箱中培养，并在T175培养瓶中进行传代26,27。细胞必须保持在对数生长期中期，以防止亚群的出现或在静止期期间凋亡碎片的积累。</li>
</ol>
2 外泌体的分离与纯化
<ol>
	<li>将U2OS细胞系在10个独立的T175培养瓶中培养至完全汇合，每个培养瓶加入50 mL培养基。收集细胞上清液，并依次通过0.45 µm和0.22 µm的真空过滤装置进行过滤。</li>
	<li>将上清液在配备750 kDa中空纤维滤柱的过滤系统上进行切向流过滤（也称为交叉流过滤），以去除较小的蛋白质或代谢物28。
	<ol>
		<li>在保持截留压力&#60;20 psi的条件下，以恒定的前向压力30 psi将上清液通过切向流过滤装置，使压差Δ达到10 psi或更高。在截留液储罐中放入磁力搅拌子，并设置转速为150 rpm26。</li>
		<li>保持进样流速在40 mL/min或更高。将滤过液收集至废液容器中并予以弃除。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将上清液浓缩至30 mL，然后用四倍体积的1×PBS进行平衡。将经过交叉流过滤并完成平衡的溶液收集至50 mL锥形离心管中。</li>
	<li>在4 °C条件下，使用终浓度为40 mg/mL、分子量为8,000 Da的聚乙二醇（PEG）对EVs进行过夜沉淀。在4 °C下以1,200 × g离心1小时，随后将EVs重悬于500 µL的1×PBS中。</li>
	<li>在4 °C条件下，将EVs与50 µg/mL的光可切换红色膜嵌入染料以及50 µg/mL的RNase A在1×PBS中孵育1小时。</li>
	<li>通过连接有组分收集器的蛋白纯化层析柱去除多余的染料。通过紫外吸光度鉴定EV组分，并将其合并收集至微量离心管中26。</li>
	<li>使用经1×PBS平衡的抗CD81磁珠，共亲和选择200 µL的EVs。
	<ol>
		<li>将100 µL抗CD81磁珠用1×PBS稀释至总体积1 mL，在2 mL微量离心管中4 °C条件下持续轻摇孵育2小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用1×PBS对CD81磁珠及结合的EVs洗涤三次。在37 °C条件下，使用pH 2.0的100 mM甘氨酸溶液洗脱CD81+ EVs，孵育30分钟。</li>
	<li>将纯化的CD81+ EVs转移至等体积、pH 7.5的100 mM Tris-HCl缓冲液中，溶于1×PBS。 
	&#8203;注意：可保留一部分纯化的CD81+ EV溶液用于纳米颗粒追踪分析或电子显微镜检测，以确认溶液纯度及EVs的存在26。</li>
</ol>
3 固定与制备
<ol>
	<li>将亲和纯化的EV置于玻璃底8孔µ载片中，总体积为200 µL（可将EV样品用pH 7.5的100 mM Tris-HCl溶解于1×PBS中），于4 °C孵育过夜，使其贴附于表面。</li>
	<li>无需移除8孔板中已有的溶液，向每孔含EV的溶液中加入200 µL含4%多聚甲醛的1×PBS溶液，室温孵育30分钟，以固定EV21。</li>
	<li>使用微量移液器小心移除多聚甲醛及过量溶液，避免扰动EV。用1×PBS洗涤EV以去除多余的多聚甲醛，重复洗涤三次。移除多余的1×PBS。</li>
	<li>按照生产商说明书，将5 mM原儿茶酸双加氧酶（组分A）溶解于成像缓冲液（组分B）中，每份样品配制250 µL dSTORM B-cubed缓冲液。 
	注：若发生光漂白，缓冲液中酶的浓度可加倍至10 mM。
	<ol>
		<li>按照生产商说明书，在成像前向每孔加入250 µL配制好的缓冲液，室温孵育20分钟，以清除氧化性分子。 
		&#8203;注：EV可立即观察，或于4 °C保存最多一周。每次成像前需更换缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4 直接随机光学重建显微镜校准
<ol>
	<li>通过将100 nm微球稀释至分子生物学级水中至0.5%的浓度，并将200 µL加入玻璃底8孔µ载片的每个孔中，制备超分辨率显微镜校准所需的微珠。
	<ol>
		<li>在室温下静置1小时，使微珠在孔中沉降。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>不移除现有溶液，向每孔的校准微珠溶液中加入200 µL含4%多聚甲醛的PBS溶液，在室温下孵育30分钟。</li>
	<li>小心使用移液器移除多聚甲醛，避免扰动微珠，并用1×PBS洗涤微珠三次。缓冲液的配制请参照步骤3.4。</li>
	<li>移除1×PBS，向每孔中加入250 µL已配制的缓冲液。在成像前让缓冲液静置20分钟。</li>
	<li>在将任何样品放置于载物台前，点击连接显微镜按钮以连接至3D显微镜。在物镜上添加100倍油镜，并将孔的中心置于物镜上方。在采集设置中，打开473 nm和640 nm激发激光，然后点击查看。
	<ol>
		<li>在未激活3D镜头的情况下，通过在图像显示选项中点击光子计数，在光子饱和设置下观察微珠。将473 nm激光的初始激光功率设为8.4 mW，640 nm激光设为11.6 mW。</li>
		<li>将激光焦点降低至约-300 nm或校准微珠的焦平面，以清晰分辨单个微珠。一旦Z平面聚焦完成，进一步调整激光功率以补偿每个视野之间的差异。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在仪器功能中，完成3D映射校准和通道映射校准，以获得X、Y和Z轴上的误差。在通道映射校准过程中，将最大视野数设为20，目标点数设为4,000，通道间最大距离设为5.0像素，通道间排除半径设为10.0像素。</li>
	<li>确保校准产生的点覆盖率&#62;90%，且映射质量良好。保存此次校准数据，供后续图像采集使用。</li>
</ol>
5 细胞外囊泡的三维可视化
<ol>
	<li>在物镜上加入100倍镜油，将制备好的EV样品放入显微镜中。在未激活3-D镜头的情况下，打开640 nm激发激光，根据信号强度和视野范围，初始激光功率设置在1.2 mW至12.5 mW之间，以激发经红色膜嵌入染料染色的EV。
	<ol>
		<li>在图像显示选项中，将观察方式从光子饱和切换为百分位数，以便更清晰地观察EV。调节激光功率以最小化噪声并最大化信号，其余参数保持不变。</li>
		<li>通过点击Z轴上的向上或向下图标调节Z平面焦距。 
		注意：Z平面应聚焦在-200至-350 nm之间，但具体数值可能因视野不同而有所变化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置曝光时间为20 ms，帧数采集为10,000帧，初始激光功率设置在1.2 mW至12.5 mW之间，或根据步骤5.1确定的激光功率，具体数值取决于信号强度和视野范围。
	<ol>
		<li>通过图标激活3-D镜头，并点击采集按钮开始数据采集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在整个图像采集过程中，每1000帧逐步增加激光功率3次，每次增加10个单位，或调整至足以维持高信噪比的水平。采集过程中不得调节Z平面。 
	&#8203;注意：激光功率最高可升至90 mW。</li>
</ol>
6 采集后修饰与细胞外囊泡示踪
<ol>
	<li>图像采集完成后，切换至Analyze视图窗口。对未滤波的图像执行漂移校正，然后启用滤波器。根据表1调整光子计数、定位精度、sigmas和帧索引。</li>
	<li>在视野中单个EV的X轴方向叠加XYZ平面视图工具，并导出光开关事件的.CSV文件。</li>
	<li>在X乘Y的视野范围内，使用线状直方图工具沿XY轴对单个EV进行分割，将光开关事件按设定的距离组进行分箱。</li>
	<li>拍摄单个EV的图像，并将其保存为.tiff文件。</li>
	<li>使用3D可视化工具创建单个EV的3D视频，并根据其在Z轴上的位置进行着色。</li>
</ol>

M.G.C. 无任何利益冲突需要声明。R.P.M. 和 D.P.D. 收到来自牛津纳米成像公司（Oxford Nanoimaging, ONI）和赛多利斯公司（Cytiva Inc.，前身为通用电气医疗集团）的物资支持。R.P.M. 和 D.P.D. 声明，本研究中部分展示的信息可能存在商业化利益冲突。这些利益冲突由北卡罗来纳大学负责管理。资助方未参与本手稿的解释或撰写工作。

由于细胞外囊泡（EVs）在多种细胞内过程及细胞间信号传导中发挥重要作用，已成为当前研究的热点领域1,30。然而，由于其体积微小，低于光学显微镜的衍射极限，对其进行可视化观察具有较大挑战性。直接随机光学重建显微技术（dSTORM）是一种突破衍射极限的直接可视化方法，其通过随时间捕获单个荧光分子的光开关事件，并基于这些闪烁事件重建图像21,31。超分辨率显微技术已成功实现对多种细胞结构的三维成像，例如肌动蛋白丝、微管、质膜中嵌入的受体以及感染细胞中的病毒蛋白32,33,34,35,36。...

细胞外囊泡（EVs）是由所有细胞类型释放的膜结合囊泡。它们含有脂质、蛋白质、代谢物和核酸，并可在细胞之间以及组织和器官之间局部或远距离传递这些物质。EVs主要有三种亚型：凋亡小体、微囊泡和外泌体1,2。本文将重点讨论外泌体及其相关蛋白质。
外泌体是由早期内体向多泡体（MVB）内陷出芽而产生的分泌性囊泡。随后，MVB 与细胞膜融合，将外泌体释放到细胞外空间，使其能够迁移至其他细胞3,4。外泌体的大小范围介于 40 至 150 nm 之间，富含源自内体的跨膜蛋白，称为四跨膜蛋白（tetraspanins，如 CD9、CD63、CD81）、参与运输所需的膜结合型内体分选复合物（ESCRT）以及脂筏相关蛋白1,2, 5,6,7。
对细胞外囊泡（exosome）的生化组成进行表征已成为研究人员深入理解其功能特性的一个热门领域。目前存在多种用于可视化和表征细胞外囊泡的方法，包括纳米级流式细胞术、纳米颗粒追踪分析（NTA）、扫描电镜与透射电子显微镜（TEM）、表面等离子共振、电阻脉冲传感以及传统的光学显微镜技术，每种方法均有其固有的优缺点8,9。TEM 和冷冻电镜（cryo-EM）可实现纳米级分辨率，但通常需要脱水和冷冻断裂步骤，可能导致细胞外囊泡（EVs）收缩或裂解10,11。NTA 依赖光散射原理，可同时对数百个细胞外囊泡进行表征，但其对粒径的测量是间接的，且难以有效区分细胞外囊泡、病毒和蛋白质聚集体12,13,14,15,16。纳米级流式细胞术利用激发光路中的光散射信号，进而推算出颗粒大小，但该技术尚处于发展初期，对于不同仪器可检测的线性范围内的颗粒尺寸，目前尚无统一共识12,17,18。
利用荧光蛋白或染料的传统光学显微镜技术一直是用于观察细胞内亚细胞结构、蛋白质复合物以及信号传导机制的最主要技术之一。尽管该技术在可视化复合物定位方面具有重要作用，但传统光学显微镜的衍射极限（约250–400 nm）限制了对典型外泌体尺寸范围（40–150 nm）内的蛋白质或结构进行清晰分辨12,19,20。
超分辨率显微技术，特别是直接随机光学重建显微技术（dSTORM），通过利用特定荧光染料的光可切换特性，并检测这些闪烁事件，从而实现纳米级精度的图像重建，由此区别于传统的光学显微技术21。光切换事件通过高帧率探测相机在数万次独立曝光过程中被采集，再利用点扩散函数高置信度地确定发生光切换的荧光染料分子的精确位置19,20,22。这使得dSTORM能够突破光学显微技术的衍射极限。已有多个研究团队报道了利用超分辨率技术对外泌体及其相关蛋白进行可视化和追踪22,23,24,25。最终分辨率取决于荧光染料的生物物理特性，通常在XY轴方向上达到±10–100 nm，可实现单分子水平的分辨。
在XY轴上以该尺度分辨单个荧光基团的能力已彻底改变了显微镜技术。然而，关于外泌体的三维（3-D）dSTORM研究数据仍然十分有限。因此，我们致力于建立一种基于dSTORM技术对外泌体等纯化细胞外囊泡（EVs）进行三维纳米级可视化与表征的标准操作流程（SOP）。

<table><tbody><tr><td>15 个 &amp;micro;-Slide 8 孔板</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr><tr><td>1× PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>1× 青霉素-链霉素溶液</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆底离心管</td><td>Thermo Fisher</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 0.22 &amp;micro;m 真空过滤装置</td><td>Genesee</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>750 kDa 中空纤维截留滤芯</td><td>Cytiva</td><td>29-0142-95</td><td></td></tr><tr><td>AKTA Flux S</td><td>Cytiva</td><td>29-0384-37</td><td></td></tr><tr><td>AKTA Start</td><td>Cytiva</td><td>29022094-ECOMINSSW</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD81 磁珠</td><td>Thermo Fisher</td><td>10616D</td><td></td></tr><tr><td>B-cubed 缓冲液</td><td>ONI</td><td>&amp;nbsp;BCA0017</td><td></td></tr><tr><td>CellMask Red</td><td>Thermo Fisher</td><td>C10046</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Thermo Fisher</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>Frac 30 组分收集器</td><td>Cytiva</td><td>29022094-ECOMINSSW</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸 pH=2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap CaptoCore 700 柱</td><td>Cytiva</td><td>17548151</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学级水</td><td>Corning</td><td>9820003</td><td></td></tr><tr><td>Nanoimager</td><td>Oxford Nanoimaging</td><td>定制</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Promega</td><td>A797C</td><td></td></tr><tr><td>T175 培养瓶</td><td>Genesee</td><td>25-211</td><td></td></tr><tr><td>Tetraspek 微球</td><td>Invitrogen</td><td>T7279</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl pH=7.5</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>Unicorn V</td><td>Cytiva</td><td>29022094-ECOMINSSW</td><td></td></tr></tbody></table>

三维细胞外囊泡的直接随机光学重建显微镜成像

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

所有细胞类型均可释放细胞外囊泡（EVs），其在细胞信号传导和稳态维持中发挥重要作用。由于EVs直径较小（40–250 nm），低于常规光学显微镜的衍射极限，因此对其成像通常需要借助间接方法。我们开发了一种基于超分辨率显微镜的EVs可视化技术，可在二维和三维空间中突破衍射极限。利用该方法，我们能够以XY轴方向±20 nm、Z轴方向±50 nm的分辨率解析EVs的三维形态。综上所述，我们建议将超分辨率显微镜作为EVs（包括外泌体）以及包膜病毒的一种表征方法予以考虑。

本研究旨在评估超分辨率显微镜在三维（3-D）空间中以纳米级分辨率可视化单个细胞外囊泡（EV）的有效性。为了分析单个EV的形态和大小，我们采用光可切换染料，将EV与远红光、可插入膜结构的染料共同孵育，并通过色谱法去除过量染料29。随后，在超分辨率显微镜下使用640 nm激发激光观察经亲和捕获的抗CD81抗体结合且呈红色染色的EV。在完成显微镜校准后，其在XY轴上的平均误差为16 nm，Z轴上的平均误差为38 nm（图1A、B），纯化的U2OS EV成功实现了最高达XY轴20 nm、Z轴50 nm的分辨率成像。
通过dSTORM技术对单个细胞外囊泡（EVs）进行三维成像，在10,000帧曝光过程中随着激光功率的增加实现光开关，这些EVs在所获得的图像中清晰可见图 2A、B）。对采集后图像的Z平面、光子计数、标准差及重构图像的定位精度进行校正，实现了细胞外囊泡在三维空间中的清晰分辨。<strong class="x...

直接随机光学重建显微镜（dSTORM）可用于突破光学显微镜的典型衍射极限，从而在纳米尺度下观察外泌体。该技术可在二维和三维条件下用于外泌体的表征。

细胞均可释放细胞外囊泡（EVs），其在细胞信号传导和稳态维持中发挥重要作用。EVs 的可视化通常……

本方案采用超分辨率显微技术，具体为直接随机光学重建显微镜（dSTORM），以突破衍射极限，实现细胞外囊泡（EVs）在三维空间中纳米级精度的可视化。dSTORM 的一个显著优势在于，无需进行破坏性处理即可直接观察光衍射极限以下的颗粒，从而避免改变 EV 的生化特性。许多进化上不同的病毒利用 EV 进行信号传递，因此 dSTORM 可用于表征 EV 中的疾病生物标志物及其进展过程，同时可用于可视化单个病毒颗粒（如 SARS-CoV-2）。首先，将亲和纯化的细胞外囊泡（EVs）加入总反应体积为 200 微升的玻璃底八孔微孔板中，并在 4 摄氏度条件下孵育过夜，使其贴附于表面。无需从八孔板中移除现有溶液，通过向每孔含EV的溶液中加入200微升4%多聚甲醛（溶于1×PBS），将EV固定在板上，并在室温下孵育30分钟。使用微量移液器小心移除多聚甲醛及过量溶液，避免扰动EV。用1×PBS洗涤EV，以去除多余的多聚甲醛。洗涤步骤重复进行三次。去除多余的1× PBS。按照生产商的说明书，通过将5毫摩尔原儿茶酸双加氧酶稀释于成像缓冲液中，为每个样品制备250微升dSTORM Bcubed缓冲液溶液。根据制造商的说明书，向每个孔中加入 250 微升已配制好的缓冲液，并在成像前于室温孵育 20 分钟，以清除氧化性分子。EVs 可立即进行观察，或在 4 摄氏度保存一周。为准备用于超分辨率显微镜校准的微珠，将 100 纳米微球用分子生物学级水稀释至 0.5% 的浓度，然后将 200 微升移液至玻璃底微型八孔板的每个孔中。将珠子在室温下静置1小时，使其沉降到各孔底部。不移除现有溶液，向每孔的校准珠溶液中加入200 µL含4%多聚甲醛的PBS溶液，在室温下孵育30分钟。用微量移液器小心吸除多聚甲醛溶液，避免扰动珠子，并用1×PBS洗涤珠子3次。按照文中的描述制备缓冲液。移除1X PBS，向每孔加入250 µL已制备的缓冲液。在观察前让缓冲液静置20分钟。在将样品放置于载物台之前，先使用“连接显微镜”按钮连接至三维显微镜。在物镜上添加100倍镜油，并将孔的中心置于物镜上方。在“采集”设置中，打开473纳米和640纳米激发激光器，然后点击“查看”。在不激活3D镜头的情况下，通过点击“图像显示选项”中的“光子计数”，在光子饱和设置下观察微珠。将473纳米激光器的初始激光功率设为8.4毫瓦，640纳米激光器的初始激光功率设为11.6毫瓦。将激光焦点降低至约负300纳米，或调整至校准微珠的焦平面，以获得单个微珠的清晰分辨率。Z平面聚焦后，进一步调整激光功率水平，以补偿每个视野之间的差异。在仪器功能下，完成3D映射校准和通道映射校准，以获取X、Y和Z轴上的误差。在通道映射校准期间，将最大视野数设为20，目标点数设为4,000，通道间最大距离设为5.0像素，通道间排除半径设为10.0像素。确保校准产生的点覆盖率达到90%以上，且成像质量良好。保存当前校准数据，供后续图像采集使用。在物镜上添加100倍镜油，将制备好的EVs样本置于显微镜载物台上。不启用3D镜头，打开640纳米激发激光，根据视野中信号强度将激光功率初步调至1.2至12.5毫瓦之间，以激发红色膜染料标记的细胞外囊泡（EVs）。在“图像显示选项”中，将观察方式从光子饱和切换为百分位数，以便更清晰地观察EVs。调节激光功率，在最大化信号的同时尽量减少噪声，并保持所有其他参数不变。通过点击 Z 轴上的向上或向下图标来调整 Z 平面的焦距。根据信号强度和视野范围，将曝光时间设置为 20 毫秒，帧采集数设置为 10,000 帧，初始激光功率设置在 1.2 至 12.5 毫瓦之间。使用图标激活 3D 镜头，然后点击“采集”按钮开始数据采集。在整个图像采集过程中，每采集1000帧图像，将激光功率分三个阶段逐步增加10，或增加至足以维持高信噪比的水平。采集过程中不得调整Z平面。图像采集完成后，切换至分析查看窗口。对未滤波图像执行漂移校正，然后启用滤波器。根据论文所述，调整光子计数、定位精度、sigmas 和帧索引。沿视场中单个EVs的X轴叠加X、Y、Z平面视图工具，并导出光开关事件的单个csv文件。使用线性直方图工具，在X乘Y的视场中沿X轴和Y轴对单个细胞外囊泡（EV）进行分割，将光开关事件归入设定的距离组。拍摄单个EV的图像，并将其保存为tif文件。利用三维可视化工具创建单个EV的三维视频，并根据其在Z轴上的位置进行着色。在对显微镜进行校准后，其在X、Y轴方向的平均误差为16纳米，Z轴方向为38纳米。利用该系统成功实现了对纯化的u20s EVs的可视化，其分辨率在X、Y轴方向可达20纳米，Z轴方向可达50纳米。通过dSTORM技术获取的三维图像中，在10,000帧的曝光过程中，随着激光功率的增加，单个EVs呈现出光控开关现象，并在所获得的图像中清晰可见。对采集后的图像进行Z平面校正，并结合光子计数、sigma值及定位精度分析，最终实现了EVs三维结构的清晰分辨。如右上角图例所示，该EV仅在前7,000帧中发生了光转换。直方图证实，大多数光转换事件发生在100纳米半径范围内，表明所观察到的EV为外泌体，且小直径EV的分离成功。利用线直方图工具和X、Y、Z平面视图工具对其他单独追踪的EV进行的粒径分布分析也证实，大多数光转换事件均发生在中心100纳米半径范围内。Z轴方向的误差增大，导致囊泡沿轴向的最终成像被拉长。光转换事件与囊泡大小无相关性，表明基于dSTORM的表征方法可用于直径小于100纳米的外泌体及小型包膜病毒等小型囊泡。进行dSTORM实验时，需注意将初始激光功率设置得非常低，并在图像采集过程中缓慢升高，以防止光漂白。自开发以来，dSTORM 技术使研究人员能够更深入地理解亚细胞结构的形态，这些结构由于传统光学显微镜的衍射极限而一直无法被清晰观察。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

三维细胞外囊泡的直接随机光学重建显微镜

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利用随机锥形倾斜法通过单颗粒电子显微镜重构外泌体复合物

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基底膜在发育过程中对组织和器官的形态发生至关重要。为了更好地理解导致该结构正确定位的机制，本文介绍了一种利用共聚焦显微镜和超分辨率显微镜观察和表征上皮细胞中基底膜蛋白的细胞内转运与分泌的方法。...

共聚焦与超分辨率成像技术揭示基底膜蛋白极化性细胞内运输及分泌过程 黑腹果蝇 卵子发生

本方案详细描述了如何构建单物镜光片荧光显微镜，并用于观察细胞骨架网络。...

可定制单物镜光片荧光显微镜的设计与构建用于细胞骨架网络的可视化

了解直接随机光学重建显微镜（dSTORM）技术，用于三维纳米级可视化细胞外囊泡（EVs）和病毒颗粒。该方法突破衍射极限，为疾病生物标志物发现和病毒感染机制研究提供高分辨率成像工具。

三维细胞外囊泡的直接随机光学重建显微镜成像

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