在微流体平台内开发 3D 组织人类心脏组织
June 15th, 2021
本协议的目的是解释和演示高度对齐的人类心脏组织的三维（3D）微流体模型的发展，该模型由干细胞衍生心肌细胞组成，与心脏成纤维细胞（CFs）在生物仿真、胶原蛋白基水凝胶中共同培养，用于心脏组织工程、药物筛查和疾病建模。
心血管疾病仍然是全世界头号死因。传统的体外模型依赖于单层文化。然而，心脏，特别是心肌或心肌，其3D异位和细胞组成是复杂的。
因此，改善体外模型内组织成分的复杂性，以更好地模拟细胞成分和心肌结构至关重要。在这项工作中，我们演示了在新型微流体装置中开发3D成熟干细胞衍生人类心脏组织的方案。该设备结合了一个3D主组织通道与与生俱来的椭圆微柱，诱导周围水凝胶封装心脏细胞的高度对齐。
主通道的两侧是带注射端口的介质通道，使营养物质在整个组织中扩散。由于处理微流体设备需要小心，此协议的视觉表示有助于在微流体设备内正确建立 3D 心脏组织，并嵌入微柱以增强组织对齐。要分离人类心脏成纤维细胞，首先从孵化器取出烧瓶。
放入生物安全柜内，开始从烧瓶中吸气。然后采取三个ML的PBS 1X洗烧瓶。关闭盖子并旋转烧瓶，以便底部正确涂上 PBS。
吸气 PBS。服用三个 37 度试穿素的 Mls， 并添加到烧瓶中。然后倾斜烧瓶和漩涡，使底部完全涂层。
然后放入孵化器四到六分钟。通过服用三个 Mls 并将它添加到烧瓶中， 用 Fgm3 中和肌素。将溶液上下移出，以去掉留在烧瓶背面的任何细胞。
将细胞悬架收集到 15 ML 猎鹰管中。取10微升的细胞悬浮，并在血细胞仪中分配，用显微镜数细胞。将细胞悬浮在250 G下悬架4分钟。
离心后，吸气超自然者小心不要干扰细胞颗粒。用新鲜的 FGM3 补充细胞颗粒，使每个 ML 悬架产生所需的 7500 万个细胞。重新安装细胞，然后用松散安装的盖子将管子放下。
要分离心肌细胞，请将盘子从孵化器中取出，并吸气介质。取六个 PBS 的 MLs 并清洗油井，以便每口井中有一个 PBS 的 ML。吸气 PBS，小心不要打扰连接到板上的细胞。
添加六个 MLs 的加热尝试快车， 以便有一个 Ml 在六个井板的每口井。用试管孵化细胞10分钟。10 分钟后，用 6 毫升的 RPMI 加 B27 加胰岛素中和 trypLE，以便您在每个井中添加一个 ML 的 RMPI。
使用一个ML移液器收集溶液，并将其爆炸到井的背面，以确保所有细胞被解除。将细胞悬架收集到 15 ML 猎鹰管中。在300G下将管子离心三分钟。
离心后，吸气媒体和试用。这一步对于洗涤敏感的心肌细胞很重要。此步骤确保所有尝试在 3D 心脏组织形成中消失。
将细胞颗粒在 RPMI 加 B27 加胰岛素的五个 MLs 中恢复。使用单ML移液器上下移液，以确保细胞悬架均匀。使用血细胞计计数时，取 10 微升的细胞悬架。
将细胞在300G下离心三分钟。第二次离心后向媒体发号限供。添加适量的RPMI加B27加胰岛素，实现每个ML悬浮7500万个细胞，然后恢复。
要准备用于封装的胶原蛋白溶液，请将所有试剂放在引擎盖中的冰盒上。然后服用75微升的库存胶原蛋白。胶原蛋白非常粘稠，所以慢慢吸收移液器，然后在冰上的微中微管中分配。
服用 13.85 微升 RPMI，加入猎鹰管中的胶原蛋白。然后服用10微升酚红色，加入冰上的混合物，然后再补充。最后，取1.15微升的一个正常的NaOH，并添加到悬架中和。
然后采取200微升移液器尖端，并恢复悬架。下一步是将胶原蛋白都市体中的细胞封装起来。然后取8微升的CMs，并添加到冰上一个新的猎鹰管。
然后取两微升CS，并添加到该细胞混合物中。恢复细胞悬架，抓住细胞悬架的5.6微升，放入一个新的猎鹰管。然后抓住你刚刚准备的胶原蛋白，取四微升胶原蛋白，然后取2.4微升的麦德龙。
将混合物上下起伏，以确保细胞水凝胶悬架的均匀分布。准备好凝胶注射后，您可以插入设备。采取一个新的提示，并重新发送。
拿培养皿的设备，插入注射端口的尖端，缓慢而稳定地注射。当设备通道充满细胞水凝胶悬架时，您将看到。填充其他端口后，停止注注并移除尖端。
注射后，用钳子翻转设备，放在更大的培养皿内，在孵化器中注水九分钟。九分钟后，将设备从孵化器中取出并直立翻转，然后放回孵化器中 9 分钟，完成水凝胶聚合。现在是时候添加媒体了。
因此，将 RMPI 加 B27 放入媒体端口，然后开始缓慢推动。然后在相反的媒体端口上这样做。您可能会发现媒体没有注射，因此您可以在端口顶部放置一滴介质，然后取出移液器，使用负压力将介质从另一侧拉过。
因此，你会看到媒体开始通过渠道拉。一旦媒体被添加到所有媒体频道，设备将被放回37度的孵化器中。微流体设备显示在左上角。
第一天、第七天和第十四天展示了这张图片。经过14天的培养后，细胞应凝结成围绕微柱形成的高度对齐结构。第14天的痕迹显示在自发收缩的C中，以及作用性染色和心脏标记染色组织的免疫荧光图像。
应该看到的是高度对齐的在文化中形成的14天后形成的纤维，以及平行条纹成熟的肉瘤和局部的缝隙交汇点。在此过程中，在细胞水凝胶注射期间，必须保持所有材料在冰上保持低温，以防止过早聚合。在制造、注射和扩展组织培养过程中，应小心处理微流体设备。
细胞注射应该是一个稳定的过程，以确保整个通道已经充满，同时快速执行，以防止过早聚合或水凝胶干燥之前，媒体添加。
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概述
本协议描述了人类心脏组织三维（3D）微流体模型的开发。该模型由干细胞衍生的心肌细胞与心脏成纤维细胞在胶原基水凝胶中共培养，旨在增强心脏组织工程和药物筛选。
关键研究组成部分
科学领域
- 心脏组织工程
- 干细胞生物学
- 微流体技术
背景
- 心血管疾病是全球范围内的主要死因。
- 传统的体外模型通常使用单层培养。
- 心肌的复杂性需要更复杂的模型。
- 3D模型可以更好地模仿心脏的细胞组成和结构。
研究目的
- 开发人类心脏组织的3D模型。
- 改进体外心脏组织的表现。
- 促进药物筛选和疾病模型的应用。
所用方法
- 开发微流体装置。
- 创建3D主要组织通道。
- 加入椭圆形微柱以实现细胞对齐。
- 在水凝胶中共培养心肌细胞和心脏成纤维细胞。
主要结果
- 成功开发了对齐的人类心脏组织。
- 提高了组织模型的结构和功能特性。
- 展示了改进药物筛选的潜力。
- 为心脏疾病模型提供了见解。
结论
- 3D微流体模型有效地模拟了人类心脏组织。
- 这种方法可以推进心脏健康和疾病研究。
- 未来应用可能包括个性化医疗和治疗测试。
常见问题
Executive Industry Relevance
Engineering 3D organized human cardiac tissue within a microfluidic platform addresses the critical gap in physiologically relevant in vitro cardiac models for drug discovery and disease research. This approach enables predictive evaluation of cardiac function and tissue architecture, supporting translational continuity from early discovery through preclinical assessment. The platform's reproducibility and alignment with native myocardium architecture enhance confidence in mechanistic and safety studies across the biopharma pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cardiac-specific pathways in a structurally relevant human tissue context.
- Supports biological de-risking by modeling native myocardium anisotropy and cellular complexity.
- Facilitates functional target validation through observation of tissue maturation and contractility.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized 3D cardiac tissue system for reproducible compound screening.
- Delivers quantitative outputs such as tissue alignment, contraction, and marker expression.
- Enables scalability and platform reuse for high-content screening applications.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant human cardiac biology for translational biomarker studies.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by modeling human tissue responses.
- Reduces risk of late-stage attrition by providing predictive human cardiac data.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic 3D cardiac tissue model integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing, assay development, and translational research within a single platform.
- Discovery Biology: Supports mechanistic studies and pathway clarification in a human-relevant system.
- Screening: Offers reproducible, quantitative readouts for compound evaluation and safety profiling.
- Analytics: Provides measurable outputs such as tissue alignment, contractility, and marker localization for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by mimicking native cardiac tissue architecture.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for ongoing cardiac biology and pharmacology studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac research.
- Operational Value: Standardizes tissue engineering and assay workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust human cardiac data early in development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of cardiac-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell biology, tissue engineering, and microfluidics.
- Demands access to specialized microfluidic devices and imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible tissue formation and analysis.
- Adaptation may be needed for different cardiac cell sources or disease models.
- Careful temperature and handling protocols are critical to prevent premature hydrogel polymerization and ensure tissue integrity.
