Name: 在微流体平台内开发 3D 组织人类心脏组织 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: 了解利用微流控芯片与椭圆微柱构建三维成熟人类心脏组织的方法。该技术通过hiPSC-CMs与胶原水凝胶共培养，实现心肌细胞定向排列与自发收缩，为心血管疾病研究及药物筛选提供高仿生体外模型。

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我们感谢美国国家科学基金会职业奖（NSF CAREER Award #1653193）、亚利桑那州生物医学研究委员会（ABRC）新研究者奖（ADHS18-198872）以及弗林基金会奖为本项目提供的资金支持。人诱导多能干细胞系 SCVI20 来自斯坦福心血管研究所 Joseph C. Wu 博士，该研究所由美国国立卫生研究院（NIH R24 HL117756）资助。人诱导多能干细胞系 IMR90-4 来自 WiCell 研究所55,56。

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

构建一种具有增强的细胞间相互作用和仿生三维结构的体外人类心肌组织模型，对于基础心血管研究及其相应的临床应用至关重要1。本方案详细阐述了在微流控装置中利用源自干细胞的心肌细胞（CMs）与包裹于胶原水凝胶中的结缔组织成纤维细胞（CFs）共培养，构建三维各向异性人类心肌组织的方法，以模拟天然心肌复杂的细胞组成与结构。该特定方案具有高度可重复性，因为该装置的特定结构已针对源自大鼠心脏细胞以及人多能干细胞分化而来的CMs（包括hESCs及两种&#160;hiPSCs系：SCVI20和IMR90-4）所形成的三维各向异性心肌组织进行了优化与验证，如我们近期发表的研究所示20。我们与许多其他研究团队均发现，不同细胞系间干细胞向心肌细胞的分化效率存在差异35,36。所采用的纯化方案有助于提高分化产率；然而，所需纯化时间的长短取决于细胞系及其分化效率。因此，不同细胞系在微流控组织构建中的最终成功率可能存在差异。
<p ...

近年来，组织工程技术已被广泛探索，以辅助再生医学和疾病建模中的体内临床发现1,2。由于获取人原代心肌组织存在固有困难，且难以构建符合生理特征的体外替代模型，导致对心血管疾病（CVDs）复杂机制的基础理解受到限制，因此研究尤其重视体外心肌组织建模1,3。传统模型通常采用二维单层细胞培养体系。然而，已有大量研究表明，在三维环境中培养心肌细胞对于模拟心肌组织的天然微环境以及复杂的细胞间相互作用至关重要4,5。此外，迄今为止大多数模型仅包含由干细胞分化而来的单一心肌细胞（CMs）培养体系。然而，心脏由多种细胞类型组成6，并具有复杂的三维结构7，因此迫切需要提高三维体外模型中组织构成的复杂性，以更真实地模拟天然心肌组织的细胞组成。
迄今为止，人们已探索了多种不同方法来构建心肌的仿生三维模型8。这些方法包括从实验装置&#160;出发，实现实时测定生成的力，例如将单一培养的心肌细胞（CMs）接种于薄膜上（称为肌肉薄片（MTFs））9，到在三维水凝胶基质中共同培养心脏细胞，并将其悬置于自支撑悬臂之间（称为工程化心肌组织（EHTs））10。其他方法则聚焦于采用微模塑技术以模拟心肌的各向异性，例如在组织补片中将单一培养的心肌细胞置于突出的微柱之间并悬浮于三维水凝胶中11，或将单一培养的心肌细胞接种于具有凹陷微沟槽的结构中12,13。上述每种方法均有其固有的优势与局限性，因此，应根据预期应用及相应的生物学问题选择合适的技术。
增强干细胞来源的心肌细胞（CMs）成熟的能力对于成功实现 体外 类成人心肌组织的构建及研究结果向临床解读的转化。为此，已在二维和三维条件下广泛探索了心肌细胞成熟的方法14,15,16例如，EHTs 中整合的电刺激、通过表面形貌强制心肌细胞（CMs）排列、信号提示、共培养产生的生长因子和/或三维水凝胶环境等，均可至少在以下一个方面促进心肌细胞成熟：细胞形态、钙处理能力、肌节结构、基因表达或收缩力。
在这些模型中，利用微流控平台的方法具有某些天然优势，例如可控制浓度梯度、所需细胞输入量少以及试剂消耗极少。此外，微流控平台能够同时生成大量生物学重复样本，有助于更深入地解析目标生物学机制，并通过增加实验样本量来提升统计效能17,18,19。另外，在微流控器件的制备过程中采用光刻技术，可实现微米级和纳米级精度结构（如形貌特征）的构建，这些结构可作为介观尺度的信号，增强周围细胞结构及宏观组织架构18,20,21,22，适用于组织再生与疾病建模等多种应用。
我们先前已证明，可开发一种新型的芯片上三维心脏组织模型，该模型通过固有的椭圆形微柱形式的表面拓扑结构，引导包埋于水凝胶中的共培养心肌细胞排列成相互连接的各向异性组织20。在培养14天后，微流控装置内形成的心脏组织在表型、基因表达谱、钙处理特性以及药物反应方面，相较于单层培养和各向同性三维对照组更为成熟23。本文所述方案详细阐述了在微流控装置中利用人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-derived CMs）构建此类三维共培养、定向排列（即各向异性）人源心脏组织的方法。具体而言，我们介绍了将hiPSCs向心肌细胞分化与纯化的步骤，将人心脏成纤维细胞（hCFs）与心肌细胞共培养以建立稳定的共培养体系，将包埋于胶原蛋白水凝胶中的细胞群体植入微流控装置，以及随后通过收缩功能检测和免疫荧光分析对构建的三维组织进行评估。所获得的三维工程化微组织适用于多种应用，包括基础生物学研究、心血管疾病（CVD）建模以及药物筛选。

<table><tbody><tr><td>0.65 mL 离心管</td><td>VWR</td><td>87003-290</td><td></td></tr><tr><td>1 mm 活检打孔器</td><td>VWR</td><td>95039-090</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mm 活检打孔器</td><td>VWR</td><td>95039-088</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon 管</td><td>VWR</td><td>89039-670</td><td></td></tr><tr><td>18x18 mm 盖玻片</td><td>VWR</td><td>16004-308</td><td>盖玻片应为 No.1，以适用于高倍成像</td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>ThermoFisher</td><td>101176-014</td><td></td></tr><tr><td>6 孔平底组织培养板</td><td>VWR</td><td>82050-844</td><td></td></tr><tr><td>B27 不含胰岛素</td><td>LifeTech</td><td>A1895602</td><td></td></tr><tr><td>B27 含胰岛素</td><td>LifeTech</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>VWR</td><td>10188-030</td><td></td></tr><tr><td>胶原蛋白 I，大鼠尾部来源</td><td>Corning</td><td>47747-218</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>ThermoFisher</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ThermoFisher</td><td>21600069</td><td></td></tr><tr><td>E8</td><td>ThermoFisher</td><td>A1517001</td><td>也可自行配制</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>VWR</td><td>45001-122</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FGM3</td><td>VWR</td><td>10172-048</td><td></td></tr><tr><td>GFR-Matrigel</td><td>VWR</td><td>47743-718</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma</td><td>G8898-500G</td><td></td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>VWR</td><td>10152-212</td><td></td></tr><tr><td>hESC-Matrigel</td><td>Corning</td><td>BD354277</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇（IPA）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IWP2</td><td>Sigma</td><td>I0536-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes 纸巾</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>MTCS</td><td>Sigma</td><td>440299-1L</td><td></td></tr><tr><td>NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S2002-25G</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen/Strep）</td><td>VWR</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（150x15 mm）</td><td>VWR</td><td>25384-326</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（60x15 mm）</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>酚红</td><td>Sigma</td><td>P3532-5G</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>ThermoFisher</td><td>MT10040CM</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 不含葡萄糖</td><td>VWR</td><td>45001-110</td><td></td></tr><tr><td>硅晶圆（100 mm）</td><td>University Wafer</td><td>1196</td><td></td></tr><tr><td>乳酸钠</td><td>Sigma</td><td>L4263-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SU8 2075</td><td>Microchem</td><td>Y111074 0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>SU8 显影液</td><td>ThermoFisher</td><td>NC9901158</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 弹性体</td><td>Essex Brownell</td><td>DC-184-1.1</td><td></td></tr><tr><td>T75 培养瓶</td><td>VWR</td><td>82050-856</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100（Triton X-100）</td><td>Sigma</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>ThermoFisher</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.5%）</td><td>ThermoFisher</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>EVG620 对准仪</td><td>EVG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗机 PDC-32G</td><td>Harrick Plasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioObserver Z1 显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

在微流控平台上构建三维有序的人类心脏组织

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

心血管疾病（CVD）仍是全球最主要的死亡原因。然而，在体外（in vitro）模拟心肌——即心肌组织——的生理和生物学复杂性一直极具挑战性。主要难点在于需要获取具有成人特征或成人心肌细胞（CMs）表型的人类心肌细胞，并能够有效重现心肌组织的细胞复杂性和精细的三维结构。遗憾的是，由于伦理问题以及缺乏可获取的原代患者来源的人类心脏组织，加之心肌细胞增殖能力极低，导致可用的人类心肌细胞来源成为心脏组织工程发展的限制性环节。为此，目前大多数研究已转向利用人类诱导多能干细胞（hiPSCs）分化为心肌细胞，作为人类心肌细胞的主要来源，从而推动hiPSC-CMs在体外（in vitro）心脏组织建模实验中的广泛应用。
在此工作中，我们展示了一种在微流控装置内构建三维成熟干细胞来源的人心脏组织的实验方案。我们具体阐述并以可视化方式演示了三维 体外 由hiPSC来源的心肌细胞构建各向异性的心脏类器官芯片模型。本文主要描述了一种用于富集心肌细胞的纯化方案，通过将心肌细胞与人源心肌成纤维细胞（hCFs）按特定比例混合，实现共培养，并将该共培养体系悬浮于基于胶原蛋白的水凝胶中。进一步地，我们将负载细胞的水凝胶注入结构明确的微流控装置内，该装置内置交错排列的椭圆形微柱，作为表面拓扑结构，可诱导周围细胞及水凝胶基质高度有序排列，从而模拟天然心肌组织的结构特征。我们预期，所提出的三维各向异性心脏类器官芯片模型适用于基础生物学研究、疾病建模，以及作为药物筛选工具用于药理学测试。

为了从人诱导多能干细胞（hiPSCs）中获得高纯度的心肌细胞（CMs）群体，采用了一种改良方案，该方案结合了Lian分化方案33与Tohyama纯化步骤34（实验时间线见图1A）。在开始心肌细胞分化时（即传代后3–4天），hiPSCs应呈集落状生长，汇合度约为85%，并在培养孔中均匀分布（图1B）。具体而言，在第0天，hiPSC集落应高表达包括SOX2和Nanog在内的多能性转录因子（图1C）。根据本方案，成功的干细胞分化与纯化过程如图1D所示，可见密集的心肌细胞集落表达肌节α-肌动蛋白（α-actinin），周围非心肌细胞极少。此外，人心脏成纤维细胞（hCFs）必须保持成纤维细胞形态，并高表达波形蛋白（vimentin）（图1E），因此应在第10...

本实验方案旨在介绍并演示一种高度定向的人类心肌组织三维（3D）微流控模型的构建方法。该模型由干细胞来源的心肌细胞与心脏成纤维细胞（CFs）在仿生性胶原基水凝胶中共培养形成，可用于心肌组织工程、药物筛选及疾病建模等应用。

全球死亡的主要原因仍然是心血管疾病（CVD）。然而，对心脏的生理和生物学复杂性进行建模……

心血管疾病仍然是全球首要的死亡原因。传统的体外模型依赖于单层培养。然而，心脏，特别是心肌组织，具有复杂的三维各向异性和细胞组成。因此，为了更好地模拟心肌的细胞组成和结构，提高体外模型中心肌组织构成的复杂性至关重要。本文展示了一种在新型微流控装置中构建三维成熟干细胞来源的人类心脏组织的实验方案。该装置包含一个三维主组织通道，内部设有椭圆形微柱，可诱导周围水凝胶包封的心脏细胞高度有序排列。主通道两侧为含有注入端口的培养基通道，可实现营养物质在整个组织中的扩散。由于操作微流控装置需要格外小心，因此本方案的可视化展示有助于在带有嵌入式微柱以增强组织排列的微流控装置中正确构建三维心肌组织。为解离人的心脏成纤维细胞，首先将培养瓶从培养箱中取出。将培养瓶放入生物安全柜中，开始吸去瓶中的废弃培养基。然后取三毫升1×磷酸盐缓冲液（PBS）清洗培养瓶。盖紧瓶盖，轻轻摇晃培养瓶，使底部充分浸润于PBS中。吸去 PBS。取 3 mL 37 摄氏度的胰蛋白酶加入培养瓶中。然后倾斜培养瓶并轻轻晃动，使底部完全覆盖。随后放入培养箱中孵育四到六分钟。取三毫升 FGM3 培养基加入锥形瓶中以中和胰蛋白酶。用移液器反复吹打溶液，使仍附着在瓶壁上的细胞脱落。将细胞悬液收集到15 mL Falcon管中。取10微升细胞悬液，加入血细胞计数板中，用显微镜进行细胞计数。将细胞悬液在250 ×g下离心4分钟。离心后，吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。用新鲜的FGM3重悬细胞沉淀，制成每毫升含7500万个细胞的悬液。充分重悬细胞后，将离心管盖上松盖的管盖，放置一旁。为了分离心肌细胞，将培养板从培养箱中取出，并吸除培养基。加入六毫升磷酸盐缓冲液（PBS），洗涤各孔，使每孔中留有一毫升 PBS。小心吸除 PBS，注意不要扰动贴壁于培养板上的细胞。向六孔板的每个孔中加入1 mL预热的TrypLE Express，共加入6 mL。将细胞与TrypLE共同孵育10分钟。孵育10分钟后，用6 mL含B27和胰岛素的RPMI培养基中和TrypLE，即向每个孔中加入1 mL RPMI培养基。使用一支毫升移液器吸取溶液，并将其冲击孔板孔壁背面，以确保所有细胞均被吹打下来。将细胞悬液收集至15毫升Falcon管中。以300 ×g离心3分钟。离心后，吸除培养基和 TrypLE。此步骤对于洗涤敏感的心肌细胞至关重要，可确保在三维心脏组织形成过程中完全去除 TrypLE。将细胞沉淀重悬于5 mL RPMI培养基中，该培养基需添加B27和胰岛素。使用1 mL移液器反复吹打溶液，确保细胞悬液均匀。取10 µL细胞悬液，用于血细胞计数板计数。将细胞以 300 G 离心 3 分钟。第二次离心后吸除上清液。加入适量 RPMI 加 B27 加胰岛素，制成每毫升含 7500 万细胞的悬液，然后重悬。为制备用于包封的胶原蛋白溶液，需将所有试剂置于生物安全柜内的冰盒上。然后取75 µL的胶原蛋白储备液。由于胶原蛋白黏度较高，需缓慢使用移液器吸取，再滴加至预冷的微量离心管中，并置于冰上。取13.85 µL RPMI，加入Falcon管中的胶原中。然后取10 µL酚红，加入冰上的混合物中并重悬。最后，取1.15 µL 1 N NaOH，加入悬液中以中和。然后取一支200微升枪头重悬该悬浮液。下一步是将细胞包埋于胶原基质凝胶中。接着取8微升心肌细胞样品，加入预冷的Falcon管中，置于冰上。然后取 2 µL 的 CS，加入到细胞混合物中。重悬细胞悬液，取 5.6 µL 细胞悬液放入一个新的 Falcon 管中。接着取刚刚配制好的胶原蛋白，吸取 4 µL 胶原蛋白，再取 2.4 µL Matrigel。用移液器上下吹打混合物，以确保细胞水凝胶悬浮液均匀分布。凝胶注射剂准备好后，即可将其注入装置中。更换新的枪头并重新悬浮。取含有装置的培养皿，将移液枪头插入注入口，缓慢而稳定地注入。您将观察到装置的通道逐渐充满细胞水凝胶悬浮液。当另一端的注入口也被完全填充后，停止注入并移除枪头。注射后，用镊子将装置翻转，并放入含有水的较大培养皿中，在培养箱内孵育九分钟。九分钟后，将装置从培养箱中取出，正置，然后重新放回培养箱中继续孵育九分钟，以完成水凝胶的聚合。现在可以加入培养基了。因此，取RMPI加B27，将枪头插入培养基端口并缓慢推入。然后对另一侧的培养基端口进行相同操作。您可能会发现培养基无法注入，此时可在端口上方滴加一滴培养基，然后用移液枪从另一侧施加负压，将培养基抽吸通过。因此，当培养基开始被吸入通道时，您将看到这一过程。一旦所有培养基通道都已加入培养基，装置将被放回37摄氏度的培养箱中。微流控装置显示在左上角。图中展示了培养第1天、第7天和第14天的情况。培养14天后，细胞应收缩形成围绕微柱的高度有序结构。此处C图展示了第14天自发收缩的轨迹，以及肌动蛋白染色和心肌标志物染色组织的免疫荧光图像。应观察到在培养14天后形成的高度排列的肌动蛋白纤维，以及平行的条纹状成熟肌节和局部的缝隙连接。在该操作过程中，关键是要在细胞水凝胶注射期间将所有材料保持在低温冰上，以防止过早聚合。在微流控装置的制备、注射以及长期组织培养过程中，均应小心操作。细胞注射过程应保持稳定，以确保整个通道被完全填充，同时操作需迅速，以防止在添加培养基之前发生过早的聚合或水凝胶干燥。

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在微流体平台内开发 3D 组织人类心脏组织

生成排列整齐的心肌组织是将干细胞生物学的最新进展应用于临床实用目的的关键要求。本文中，我们描述了一种微接触印刷技术，可精确控制细胞形态与功能。利用高度纯化的胚胎干细胞来源的心脏前体细胞，我们进而生成了各向异性的功能性心肌组织。...

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