Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

该程序的总体目标是创建具有确定细胞组成的人类工程心脏组织。这种方法可以解决心脏组织工程领域的关键挑战，包括控制变异性和心脏分化效率，以及了解特定细胞类型如何影响心脏收缩功能。该技术的主要优点是最终结果是具有受控和确定成分的人类工程心脏组织。

该技术的复制扩展到心脏病的治疗，因为确定的组织可以提供一种新的、生物学相关的生物医学筛选平台，能够评估治疗干预。虽然这种方法可以提供对新型心脏疗法的见解，但人类工程的心脏组织系统也可用于了解心脏细胞治疗的机制。从人胚胎干细胞衍生的心肌细胞培养物开始，用 PBS 洗涤细胞一次，并加入 1 毫升 0.04% 胰蛋白酶-EDTA。

将细胞在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育 10 分钟。当细胞孵育时，将 12 μL ROCK 抑制剂添加到 6 mL 胰蛋白酶中和溶液中。从培养箱中取出板，向 6 孔板的每个孔中加入 1 毫升中和溶液。

每个孔中的所有细胞转移到单个 15 mL 离心管中。用一瓶 3 mL 体积的 PBS 洗涤所有六个孔，并将此洗涤液与试管中的细胞混合。将试管在 4 摄氏度下以 300 倍 G 离心 5 分钟以沉淀细胞。

为了准备细胞以进行 FACS 活细胞分选，通过在冰上向 45 毫升 PBS 中加入 5 毫升 FBS 和 50 微升 ROCK 抑制剂来制备染色缓冲液。从沉淀的细胞中取出上清液，并将其重悬于 1.2 mL 染色缓冲液中。将 200 μL 悬浮细胞转移到冰上新的预冷 50 mL 离心管中。

接下来，将剩余的 1 毫升细胞悬液转移到冰上新的预冷 50 毫升离心管中，并加入 2 微升 SIRP α-PE/Cy7 和 4 微升 CD90-FITC 抗体。用移液管轻轻混合细胞悬液，并将试管置于冰上。将两支含有阴性对照和样品的 50 mL 试管放在摇床上，在 4 摄氏度的冰上孵育 1 小时。

在细胞孵育时，将 3 mL 分化培养基 2 转移到两个 15 mL 离心管中。然后加入 3 微升 ROCK 抑制剂，并在使用前将这些 FACS 收集管储存在冰上。接下来，在 4 摄氏度下以 300 倍 G 的浓度沉淀染色的细胞 5 分钟。

并用 10 毫升冰冷的 PBS 洗涤两次。用 1 至 3 mL 含有 DAPI 的染色缓冲液轻轻重悬样品沉淀。向阴性对照沉淀中加入 500 微升不含 DAPI 的染色缓冲液。

通过 40 微米细胞过滤器过滤两种细胞悬液以去除细胞团块，然后将它们转移到冰上的聚苯乙烯 FACS 管中。立即将样品带到细胞分选仪中。从阴性染色对照样品开始，建立门控参数。

然后，在运行样品细胞时，为 DAPI 阴性活细胞群选择。在 20 PSI 下独立收集 FITC 阳性和 PE/Cy7 阳性细胞群。如文本方案所示，在培养和重新聚集细胞后，从培养箱中取出细胞培养板，并将培养基转移到 50 mL离心管中。

用 3 毫升 PBS 洗涤板，并将洗涤液转移到同一个 50 毫升离心管中。然后向板中加入 3 毫升 0.04% 胰蛋白酶-EDTA，并在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育。五分钟后，使用显微镜检查板是否脱离。

一旦所有细胞都分离，向板中加入 3 毫升胰蛋白酶中和溶液。轻轻混合并将细胞转移到原来的 50 mL 离心管中。用 5 毫升 PBS 洗涤板，并将此洗涤液也加入试管中。

在室温下以 300 倍 G 离心 5 分钟，使细胞沉淀。去除上清液，将沉淀重悬于一毫升新生儿牛血清或 NBS 培养基中。接下来，将细胞转移到 1.5 mL 微量离心管中。

在室温下以 300 x G 的浓度沉淀细胞 5 分钟，然后去除上清液。要开始生成六种工程心脏组织，用 1.5 微升 1 摩尔氢氧化钠、9.6 微升 10X PBS 和 24.9 微升无菌超纯水将 60.0 微升 5 毫克/毫升胶原蛋白原液稀释至 3.125 毫克/毫升。在这里，避免将气泡引入胶原蛋白混合物中至关重要，因为气泡从粘性溶液中释放的速度很慢，并且会干扰组织压实过程中的组织形成。

从 15 毫升试管的侧面向下移液，加入 12.0 微升 10X MEM 和 0.2 个 pH 值为 9 的正常堆，以稀释胶原蛋白混合物。然后将基底膜基质添加到胶原蛋白混合物中，最终浓度为 0.9 毫克/毫升，并轻轻混合。将最终的组织混合物储存在冰上。

接下来，将整个组织混合物转移到细胞沉淀中，并按照文本方案中的指示添加补充细胞。用无细胞 NBS 培养基填充试管至最终体积为 150 μL，并轻轻混合。小心地将 25 μL 细胞悬液移液到生物反应器底板的 6 个孔中。

在每个孔之间重复混合程序，以重悬可能已沉淀的任何细胞。一次仅移液一个组织/孔，以确保每个组织的体积和细胞数量一致。另外，将两排聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 力传感器推到聚砜框架的两侧，形成六对相对的柱子。

倒置底板顶部的框架，使一对柱子进入包含细胞悬液的每个孔。然后将生物反应器放入 60 毫米的培养皿中，并将该培养皿（无盖）放入 10 厘米的培养皿内。盖上 10 cm 培养皿的盖子，将整个生物反应器组件移至组织培养箱中。

孵育 2 小时后，取下生物反应器组件，加入 14 mL NBS 培养基以覆盖底板。将生物反应器放回细胞培养箱中，每天更换一半的培养基。48 小时后，轻轻地取下底板，一次几毫米。

然后将生物反应器放回去，使组织朝下放回培养基。如果在卸下底板时组织从柱子上脱落，请轻轻地将组织重新连接到柱子上。人胚胎干细胞的分化导致主要由心肌细胞和成纤维细胞混合培养而成，这些细胞自组织成簇，并在整个培养皿中形成稳健跳动的网。

这些培养物的 FACS 分选显示，这种分化方法导致群体包含至少 65% SIRP α 阳性细胞和 10% CD90 阳性细胞。移除底板后，允许人类工程心脏组织 （HECT） 在生物反应器内自组装。成熟而紧凑的 HECT 以平均 5 到 15 微牛顿的力明显偏转集成的力传感柱。

Twitch 力测量揭示了孤立变量如何改变这些定义的工程组织中的收缩力。在这里，当组织补充 10% 人间充质干细胞时，在 1 赫兹和 2 赫兹起搏频率下观察到收缩力的显着增强。一旦掌握，分化大约需要 20 天，细胞分选大约需要 5 小时，组织构建大约需要 3 小时。

施工后还需要 7 天才能正常形成组织。在此程序之后，可以执行其他方法，包括细胞标记和组织混合物的补充，以回答有关特定细胞间相互作用影响的其他问题或确定细胞治疗的机制。观看此视频后，您应该对如何创建具有已知且受控细胞组成的人类工程心脏组织有很好的了解。