Name: 在斑马鱼胃中使用双光子显微镜进行深度和空间控制的体积消融 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 学习使用双光子激光消融技术在斑马鱼胚胎中进行精确细胞消融，研究细胞间相互作用与集体迁移机制。该方法可在不损伤邻近组织的情况下，深入观察胚胎发育过程中的细胞动态行为。

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感谢Emilie Menant在鱼类饲养方面提供的帮助，感谢Polytechnique生物成像中心，特别是Pierre Mahou&#160;，在活体成像实验中提供的技术支持，该设施部分得到了法兰西岛大区（interDIM）和法国国家科研署（ANR-11-EQPX-0029 Morphoscope2，ANR-10-INBS-04 France BioImaging）的资助。本研究得到了法国国家科研署（ANR）项目资助（项目编号：15-CE13-0016-1、18-CE13-0024、20-CE13-0016）以及欧盟“地平线2020”研究与创新计划下玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里基金协议No 840201的支持，同时获得法国高等教育与研究部以及法国国家科学研究中心的资助。

所有动物实验均已获得伦理委员会编号59以及法国国家教育部、高等教育与研究部的批准，批准文件编号为APAFIS#15859-2018051710341011v3。下述部分步骤针对我们的仪器设备和软件而设定，但可轻松适配于其他设备。
1. 注射液的制备
<ol>
	<li>在胚胎培养基（EM）中配制75 mL的1%琼脂糖溶液。</li>
	<li>将注射模具放入90 mm的培养皿中，倒入约50 mL琼脂糖溶液，使模具能够漂浮。待琼脂糖凝固后，取出注射模具。</li>
	<li>在30 mm培养皿中加入1 mL琼脂糖溶液，制备琼脂糖包被的培养皿。</li>
	<li>将原液用无RNase水稀释，配制4 µL浓度为30 ng/µL的组蛋白2B-mCherry mRNA溶液，并置于冰上保存。 
	​注意：操作mRNA时应佩戴手套，避免RNase导致的降解。</li>
	<li>使用微量移液器拉针仪从毛细管中拉制注射针。</li>
</ol>
2. 胚胎制备
<ol>
	<li>鱼类产卵后，用 EM 在 90 mm 培养皿中收集、冲洗并收获卵。将胚胎置于 28.5 °C 培养箱中孵育。</li>
	<li>等待 20 分钟，直至第一个细胞清晰可见。</li>
	<li>将 30 个胚胎转移至盛有 EM 的注射板中，用略钝的镊子将胚胎轻轻压入凹槽，并调整方向使动物极朝上。</li>
	<li>使用微量加样吸头，向注射针中加入 2 µL mRNA 溶液。将针头插入显微操作仪上的毛细管固定器中，该固定器通过聚四氟乙烯（PTFE）管路连接至气动注射仪。</li>
	<li>在体视显微镜下，小心折断针头尖端。</li>
	<li>将针头插入细胞，在单细胞期胚胎中注射 mRNA 溶液。 
	注意：注射体积约为细胞体积的三分之一。</li>
	<li>将注射后的胚胎放回 28.5 °C 培养箱中继续孵育。</li>
</ol>
3. 双光子显微镜的准备
注意：本方案中使用两台激光器。其中一台用于成像GFP（在920 nm波长下）并进行消融操作（在820 nm波长下），将称之为绿色/消融激光器。另一台在1160 nm波长下用于成像mCherry，将称之为红色激光器。
<ol>
	<li>将绿色/消融激光设置为 820 nm（消融波长），红色激光设置为 1160 nm（mCherry 激发波长）。</li>
	<li>通过调节光路中的可移动反射镜，对绿色/消融激光和红色激光在扫描头入口和出口处进行光束准直。 
	注意：这可以增强激光束的聚焦效果，并最小化激发和消融的焦体积。</li>
	<li>在物镜下测量 820 nm 波长下绿色/消融激光的最大输出功率。具体操作为：将功率计置于物镜下方，关闭黑色暗室，将绿色/消融激光功率设为 100%，并打开快门。计算达到 300 mW 所需的激光功率百分比。</li>
	<li>将绿色/消融激光重新设置为 920 nm（GFP 激发波长），并将激光功率设为 7%。将红色激光功率设为 15%。</li>
	<li>启用绿色和红色通道的落射式光电倍增管（PMT）检测器；将绿色和红色通道 PMT 的灵敏度设为 65。</li>
	<li>将视野设为 400 × 400 µm，图像分辨率为 512 × 512 像素，扫描频率为 800 Hz。</li>
	<li>选择 3D 时间序列成像 模式，然后创建一个文件夹，并在每次采集后启用 自动保存 功能以保存数据。</li>
	<li>组装加热腔室并将其温度设为 28 °C。等待至少 10 分钟，使腔室和物镜充分预热。</li>
</ol>
4. 胚胎的封片
<ol>
	<li>在荧光体视显微镜下，鉴定表达 GFP 的 70% 原肠胚期胚胎。 
	注意：选择在轴向中胚层具有明亮信号且无背景荧光的胚胎，以获得更佳的成像质量。</li>
	<li>使用塑料巴斯德吸管将三至四个选定的胚胎转移至已涂覆琼脂糖的培养皿（步骤 1.3）中，并用精细镊子小心去除卵膜。 
	注意：去膜后的胚胎非常脆弱，接触空气或塑料表面时容易破裂。</li>
	<li>在小型玻璃小瓶中加入 1 mL 含青霉素-链霉素的 1× EM 培养基配制的 0.2% 琼脂糖溶液，然后将小瓶置于预热至 42 °C 的干式恒温金属浴中。 
	注意：后续步骤必须迅速操作，以便在琼脂糖凝固前完成胚胎定位。</li>
	<li>使用火焰抛光的玻璃吸管将一个去膜胚胎转移至 0.2% 琼脂糖玻璃小瓶中。注意不要将过多 EM 培养基带入琼脂糖溶液中，以免稀释琼脂糖。弃去吸管中多余的培养基，并在胚胎从吸管滑出前，将胚胎连同足量琼脂糖一并吸回，确保能覆盖玻璃底培养皿的载玻片区域。</li>
	<li>将琼脂糖和胚胎吹出至培养皿的玻璃载片上。注意避免胚胎接触空气或培养皿的塑料边缘。随后，用琼脂糖填充载片周围的腔室。</li>
	<li>使用一根眼睫毛轻轻调整胚胎方向，使目标区域朝上（图 1B）。 
	注意：调整胚胎方向时，应仅接触胚盘区域，避免触碰极为脆弱的卵黄。琼脂糖约在 1 分钟内凝固，具体时间取决于室温。</li>
	<li>等待约 5 分钟，待琼脂糖完全凝固后，加入数滴含青霉素-链霉素的 EM 培养基。</li>
</ol>
5. 定位胚胎及消融前成像
<ol>
	<li>将玻璃底培养皿置于加热腔内的物镜下方。将物镜浸入含青霉素-链霉素的 EM 培养基中，并关闭加热腔。</li>
	<li>移动滑块，将光路切换至目镜。然后通过目镜、荧光灯和载物台控制，找到胚胎并将焦距调整至胚胎表面。</li>
	<li>关闭荧光灯，将光路切换至 PMT，然后关闭暗室。 
	注意：务必关闭暗室内所有光源，以免损坏 PMT。</li>
	<li>开始活体成像并定位轴向中胚层。调节绿色/消融激光和红色激光的功率，以获得良好的信号（即，在表达 GFP 的区域，每个像素的光子数介于 1,000 至 20,000 之间）。使用红色通道将载物台移动至胚胎最顶端，并将此位置设为 Z = 0。</li>
	<li>选择 1 分钟的时间间隔和 2 µm 的 Z 轴步长。使用该设置，以 110 µm 的 Z 轴扫描范围足以覆盖整个胚盾，且采集时间少于 1 分钟。将第一层切片设置在轴向中胚层上方 15 µm 处（位于更表层的外胚层）。 
	​注意：胚盾沿曲线移动，因此 Z 轴堆栈的最底层应比胚盾最深位置再深 30 µm，以适应延时成像过程中的运动（图 1E）。</li>
	<li>记录 10–15 分钟的消融前影像。</li>
</ol>
<img alt="斑马鱼胚胎消融实验装置、存活数据及显微图像；胚胎研究、细胞分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62815/62815fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：激光消融的成功结果。（A）原肠胚形成期胚胎在卵黄囊外包70%阶段的示意图，背侧视图；pAM：后部轴向中胚层；黑色箭头表示帽状结构（polster）迁移方向；黑色方框表示在帽状结构中进行消融的典型视野范围。（B）用于切断帽状结构的胚胎固定示意图，侧视图。胚胎被固定成使其帽状结构平面与光轴垂直。（C）对照组与消融组胚胎在受精后24小时的存活情况，以及（D）形态学表现。比例尺为300 µm。（E）对表达Histone2B-mCherry的Tg(gsc:GFP)胚胎帽状结构进行激光消融的时间序列图像。仅显示绿色通道的图像为最大投影。放大图显示了包含细胞碎片的消融区域。同时显示绿色和红色（以洋红色显示）通道的图像为消融前后XY和XZ切片（绿色闪电符号代表消融位置）。XZ切片显示，覆盖在上方的组织（无GFP表达的洋红色细胞核）未受到下方结构消融的影响。黄色虚线框对应于激光消融处理所选的感兴趣区域（ROI）。大图比例尺为50 µm，放大图比例尺为25 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62815/62815fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
6. 靶点定位与激光消融
<ol>
	<li>在活体成像中定位前端帽（polster）轮廓，并使用电光调制器感兴趣区域（EOM ROI）工具绘制一个宽20像素（15 µm）、横跨前端帽宽度的矩形，将该矩形置于前端帽的中央位置（图1E）。</li>
	<li>记录包含前端帽细胞的最深和最浅光学切片的轴向位置。将在上述两个层面之间每隔10 µm进行一次消融操作。注意确保在任何层面中，感兴趣区域（ROI）均不与卵黄细胞重叠。</li>
	<li>将载物台置于该区间最深的Z位置。消融必须自下而上进行，以避免碎片吸收激光。</li>
	<li>将绿色/消融激光波长设置为820 nm，并调节功率百分比，使输出功率达到300 mW（见步骤3.3）。</li>
	<li>将成像频率设置为200 Hz。</li>
	<li>将绿色/消融激光成像用EOM设为0，并选择ROI-Treat模式。</li>
	<li>开启EOM，并设置处理立即开始（在0帧之后）。</li>
	<li>将成像模式设为时间序列（Timelapse），并关闭自动保存功能。</li>
	<li>将时间步长设为快速模式（Fast mode）。</li>
	<li>将处理帧数和总帧数设置为与目标深度相对应的数值（表1）。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>深度 (µm)</td>
			<td>处理帧</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-30</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-35</td>
			<td>1-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-40</td>
			<td>1-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-45</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-50</td>
			<td>2-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-55</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-60</td>
			<td>3-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-65</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-70</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-75</td>
			<td>4-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80</td>
			<td>4-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-85</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-90</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-95</td>
			<td>5-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-100</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-105</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：根据胚胎内靶向细胞深度（0表示胚胎表面）推荐的激光处理帧数。
<ol start="11">
	<li>开始成像。由于在EOM处理期间PMT的快门关闭，采集图像为黑色。</li>
	<li>将载物台向上移动至列表中的下一个Z位置（步骤6.2）。</li>
	<li>重复步骤6.10至6.12，直至到达polster的顶部。</li>
</ol>
7. 消融后验证与成像
<ol>
	<li>将绿光/消融激光设置为 920 nm 和 5% 功率。将绿光/消融激光成像 EOM 设置为 100，并选择 全视野 模式。</li>
	<li>将 成像频率 设置为 800 Hz。关闭 EOM。</li>
	<li>在实时模式下扫描整个 Z 层序列，检查每一层是否均已消融。如果未完全消融，请返回步骤 6.2。 
	注意：消融有时会引起邻近组织的垂直位移，因此可能需要重新定义 Z 层序列。</li>
	<li>将 成像模式 设置为 3D 时间序列，并重新启用 自动保存。记录 40–60 分钟的消融后影像。</li>
	<li>在消融后的影像中检查目标细胞是否被有效消融。若出现荧光恢复，或目标细胞仍占据空间并阻碍后续细胞通过，则表明目标细胞仅发生光漂白而未被消融（图 1E 和 图 2A）。</li>
</ol>
<img alt="细胞消融过程；荧光显微镜；消融前后细胞排列；实验装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62815/62815fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：激光消融的阴性结果。（A）激光消融中潜在失败的典型示例。大视野XY图显示最大投影，XZ图为重建切片。激光处理区域位于两个白色箭头之间。重建切片中高亮显示了三个焦平面，并在右侧展示。它们对应三种不同类型的失败情况。平面1显示位于胚盾（polster）上方的细胞被消融，可通过该焦平面上方出现的自发荧光碎片（见放大图）识别（参见平面1在重建切片中的位置）。这可能是由于待消融区域定义不准确所致。平面2显示细胞被漂白但未被完全消融，可通过仍保留完整细胞轮廓的微弱荧光信号识别（见放大图）。平面3显示细胞保持完整，几乎未受激光漂白作用影响，这可能是由于待消融区域定义错误或处理效果不佳所致。在平面2和平面3所示情况下，可对未被消融的目标细胞重新施加消融处理。大视野图中的比例尺为50 µm，放大图中为20 µm。（B）因激光强度过高导致空化效应形成气泡的典型示例（以白色星号标记）。此类气泡不限于单一Z平面，有时甚至贯穿整个胚盾高度，导致邻近组织变形。比例尺为50 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62815/62815fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
8. 数据分析
<ol>
	<li>使用图像分析软件打开延时成像序列，并设置正确的像素尺寸。</li>
	<li>在 Spot 功能中，将 Object Size 设置为 10 µm，因为这是原肠胚形成期间细胞核的平均大小。然后运行 Spot 功能以检测并追踪细胞核。 
	注意：通过考虑较低的轴向分辨率，并在 Z 轴方向拟合一个 12 µm 长的椭球形，可略微提高检测效果。</li>
	<li>使用滤波器去除假阳性信号。Tg(Gsc:GFP) 品系中，胚胎轴向细胞和部分内胚层细胞呈绿色标记。因此，基于绿色荧光强度进行筛选可快速选中这些细胞（图 3A）。</li>
	<li>将连续点之间的最大距离设置为与细胞移动速度相匹配的数值。 
	注意：需注意两帧之间的时间间隔。Polster 细胞的迁移速度为 2.8 ± 0.8 µm/min。因此，在时间步长为 1 分钟时，将最大位移设为 4 µm 可消除大多数伪迹轨迹。</li>
	<li>允许跨越一个或两个时间点的间隙可获得更长的连续轨迹，但可能引入追踪错误。若某一时间点的细胞核未被正确检测，可考虑使用不同的参数或滤波器重新运行斑点检测。</li>
	<li>对轨迹进行目视检查，并在必要时进行手动校正。</li>
	<li>将结果导出为 .xlsx 文件。使用已发表的电子表格分析程序24（图 3B）以及数据处理软件中的自定义程序对文件进行处理（可应要求提供）。</li>
</ol>
<img alt="胚胎消融实验、方向自相关图、延时显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62815/62815fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：分离胚盾前半部分影响细胞运动方向性。（A）表达组蛋白2B-mCherry（以洋红色显示）的Tg(gsc:GFP)胚胎在激光消融切断胚盾中部前后的三维重建图像。属于胚盾前半部分的细胞核用洋红色点标记，并在消融前后随时间进行追踪（见视频S1）。比例尺为50 µm。（B）作为迁移持续性的衡量指标，显示了消融前后胚盾前部细胞的方向自相关性。消融前细胞呈现持续运动，消融后则显著下降，表明集体定向迁移能力丧失。作为对照，还测量了未消融胚胎中构成胚盾前半部分细胞的方向自相关性。图中曲线包络表示标准误。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62815/62815fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

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</ol>

作者声明无竞争利益。

本文描述了一种利用非线性光学技术进行深层且空间定位精确的体积消融的实验方案。该方案最关键的步骤是确定合适的处理条件，以提供足以实现消融的激光能量，同时避免能量过高导致产生过多碎片或空化效应。靶点处实际传递的能量主要取决于以下因素：（1）激光输出功率，（2）激光准直质量，（3）光束在到达消融平面过程中所穿过的组织性质，（4）消融平面的深度。因此，在每次实验前，必须测量激光输出功率，并将其调整至参考值（在本方案中为820 nm波长下300 mW），同时确保激光准直正确。在满足上述条件的前提下，实验处理参数应在不同实验日之间具有良好的可重复性。我们建议针对特定类型的样本进行充分测试，以确定最佳参数（激光功率和处理帧数），这些参数随后可用于所有类似的实验。以本文所述示例（原肠胚形成期间切断胚盾结构）为例，我们已针对胚胎内不同深度的消融建立了相应的处理条件（表1），并在后续实验中直接参考该图表。值得注意的是，选择820 nm波长是因为在我们的系统中，该波长能够提供最高的峰值能量（由激光器和光学系统的特性决定）。根据系统性能的不同，也可选用更短或更长的波长6...

细胞间的相互作用在发育过程中发挥着至关重要的作用。细胞可提供信号，供其直接相邻的细胞或更远距离的细胞感知，从而影响这些细胞的命运和/或行为。这些信号中许多具有化学性质。例如，在已被充分表征的诱导事件中，一群细胞产生可扩散的分子，影响另一群细胞的命运1。然而，其他信号则属于机械性质；细胞对其邻近细胞施加力学作用力和约束，邻近细胞能够感知并对此作出响应2。
研究这些细胞间相互作用重要性的一种方法 体内 是消除某些细胞并观察其后续发育。遗憾的是，目前可用于去除或破坏细胞的技术有限。细胞可通过手术方式移除3,4，使用针头或细金属丝，但这类方法具有侵入性，精确度较低，通常需在体视显微镜下操作，从而无法在显微镜下立即成像。此外，靶向深层细胞需要穿透覆盖的组织，造成不必要的干扰。基因编码的光敏蛋白（如 KillerRed）已可用于通过光照诱导细胞死亡5光敏剂是经光照后可产生活性氧物种的发色团。其主要局限性在于需要较长的光照时间（约15分钟），若细胞处于运动状态，则难以实现有效照射；此外，光敏剂通过诱导细胞凋亡导致细胞死亡，该过程并非即时发生。
近15年来，激光消融技术已得到发展并被广泛应用6,7,8,9,10,11,12。激光束被聚焦于目标细胞或组织，通过加热、光消融或等离子体诱导消融实现靶向破坏；具体过程取决于激光的功率密度和照射时间13。大多数消融方案采用紫外（UV）激光，因其具有高能量。然而，紫外光在生物组织中既易被吸收又易发生散射。因此，若要靶向深层细胞，就需要更高的激光功率，而这会导致更表层的、非焦平面组织受损。这限制了紫外激光仅能用于表层结构，并导致其轴向分辨率相对较低。非线性光学技术（即双光子显微镜）利用光的非线性特性，使用两个近红外区的约半能量光子激发荧光分子。将该技术应用于消融时具有三个主要优势。首先，红外光在生物组织中的散射和吸收程度均低于紫外光14，因此可在不增加所需激光功率的情况下到达更深的结构。其次，使用飞秒脉冲激光可实现极高的功率密度，通过诱导等离子体形成进行消融，而与加热不同，该过程不会在空间上扩散15。第三，只有在焦点处才能达到诱导等离子体形成的功率密度。凭借这些特性，双光子激光消融可用于精确靶向深层细胞，同时不干扰周围组织环境。
集体迁移是细胞间相互作用至关重要的发育过程的典型范例。集体迁移被定义为邻近细胞&#160;影响单个细胞行为的细胞迁移过程16。这些相互作用的性质（化学或机械）及其对细胞迁移的影响可能差异很大，且通常尚未被完全理解。移除部分细胞并观察其对其他细胞的影响，对于进一步揭示这些集体行为机制至关重要。数年前，我们通过手术方法证实，在斑马鱼原肠胚形成过程中，前端帽（polster）的迁移属于一种集体迁移17。前端帽是一群位于胚胎背侧、最早发生内陷的细胞18。在Tg(gsc:GFP)转基因品系中，这些细胞被标记为绿色，位于胚胎深层，处于多层外胚层细胞之下。在原肠胚形成期间，该细胞群引领轴向中胚层的延伸，从胚胎组织中心向动物极迁移19,20,21,22,23（图1A）。我们已证实，细胞需要与其邻近细胞保持接触，才能将迁移方向定向至动物极。然而，要更深入理解这一集体迁移的细胞与分子基础，还需通过移除部分细胞，观察其对剩余细胞的影响。因此，我们开发了一种基于双光子显微镜系统的大型深层组织消融技术。本文中，我们演示了如何利用该方案将前端帽从中间切断，并通过追踪组蛋白2B-mCherry标记的细胞核，观察其对细胞迁移的影响。

<table><tbody><tr><td>25倍水浸物镜</td><td>Olympus</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A8963,0500</td><td></td></tr><tr><td>数据分析软件：Matlab</td><td>数学工作</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电光调制器（EOM）</td><td>ConOptics</td><td>350-80LA</td><td></td></tr><tr><td>胚胎培养基（EM）溶液</td><td></td><td></td><td>Westerfield, M. 《斑马鱼手册：斑马鱼（Danio rerio）实验室使用指南》，第5版。俄勒冈大学出版社，尤金（图书）。（2000）</td></tr><tr><td>环境箱</td><td>Okolab</td><td>H201-T-UNIT-BL</td><td></td></tr><tr><td>EOM 驱动器</td><td>ConOptics</td><td>302RM</td><td></td></tr><tr><td>荧光光源</td><td>Lumencor</td><td>SOLA</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>哈佛仪器公司</td><td>300085</td><td>外径 1.0 mm，内径 0.58&amp;nbsp;毫米</td></tr><tr><td>玻璃移液管</td><td>Volac</td><td>D810</td><td>尖端应进行火焰抛光</td></tr><tr><td>绿光/消融激光</td><td>Spectra Physics</td><td>Mai Tai HP DeepSee</td><td></td></tr><tr><td>组蛋白2B-mCherry mRNA</td><td></td><td></td><td>由pCS2-H2B-mCherry质粒（Dumortier）合成&amp;等 2012）</td></tr><tr><td>图像分析软件：IMARIS</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImSpector 软件</td><td>Abberior Instruments 开发团队</td><td></td><td></td></tr><tr><td>注塑模具</td><td>自适应科学工具</td><td>I-34</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器吸头</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>微移液管拉制仪</td><td>Sutter</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 体外转录试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140-122</td><td>每毫升含10000单位青霉素和10毫克链霉素</td></tr><tr><td>光电倍增管（PMT）</td><td>滨松</td><td>H7422-40</td><td></td></tr><tr><td>PicoPump（空气注射器）</td><td>世界精密仪器公司</td><td>PV820</td><td></td></tr><tr><td>红激光</td><td>Spectra Physics</td><td>OPO/Insight DeepSee</td><td></td></tr><tr><td>注射用无RNase水</td><td>Sigma</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>电子表格软件：Excel</td><td>微软</td><td></td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>尼康</td><td>SMZ18</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Tg(gsc:GFP)&lt;/em&gt; 斑马鱼品系</td><td></td><td></td><td>Doitsidou, M. 等. 原始生殖细胞迁移受趋化因子 SDF-1 的引导. Cell. 111 (5), 647&amp;ndash;59，doi: doi.org/10.1016/S0092-8674(02)01135-2 (2002)。</td></tr><tr><td>TriM Scope II 显微镜</td><td>La Vision Biotech</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用双光子显微镜在斑马鱼原肠胚中实现深度与空间可控的体积消融

Deep and Spatially Controlled Volume Ablations using a Two-Photon Microscope in the Zebrafish Gastrula

形态发生涉及多种细胞运动，以将细胞组织成组织和器官。为了实现正常的发育，所有这些运动都需要高度协调，越来越多的证据表明，这种协调至少部分是通过机械相互作用实现的。在胚胎中验证这一点需要直接进行物理扰动。激光消融是一种日益常用的方法，可用来解除机械约束，或在物理上将两个细胞群体相互隔离开。然而，许多消融操作使用的是紫外（UV）激光，其轴向分辨率和组织穿透能力有限。本文介绍了一种利用双光子显微镜消融深层、显著且空间位置明确的组织体积的方法。该方法在一个转基因斑马鱼品系中进行了演示，该品系在轴向中胚层中表达绿色荧光蛋白，并可用于切断轴向中胚层，同时不损伤其上方的外胚层或下方的卵黄细胞。通过活体成像在消融前后持续监测细胞行为。该消融方案可用于不同的发育阶段、任意细胞类型或组织，作用尺度可从数微米到超过一百微米。

为了在中段切断胚盾，将注射了组蛋白2B-mCherry mRNA的Tg(gsc:GFP)胚胎按照步骤4所述方法固定于70%上胚层延伸阶段。通过GFP表达确定胚盾位置，并将胚胎固定，使胚盾平面垂直于光轴（图1B）。若将胚胎偏离此位置倾斜，则会使操作复杂化，光线需穿过更多组织才能到达消融平面，且消融平面将相对于胚胎轴线发生倾斜。在确认所有细胞核均被正确标记后，记录10分钟的消融前延时成像，以捕获消融前的细胞运动（图1E和图3A，电影S1）。
通过形态学方法鉴定了帽状结构（polster），并在其中部选取一个15 µm × 200 µm的矩形区域，在五个焦平面上进行消融，以确保贯穿整个帽状结构的深度完成切断（图1E，&#160;视频S1）。消融后立即重新开始成像，用于...

胚胎发育需要细胞运动的大规模协调。双光子激发介导的激光消融技术可实现对深层大量细胞进行空间可控的三维消融。此外，该技术还可用于探究集体迁移细胞的反应 体内 其力学环境的扰动。

形态发生涉及多种细胞运动，以将细胞组织成组织和器官。为了实现正常的发育，所有这些运动都需要被严密调控……

在胚胎内部，细胞之间相互作用，交换化学和机械信息。研究这些相互作用的一种有效方法是杀死部分细胞，并观察其对邻近细胞造成的影响。本文所述方法可实现对细胞的精确消融，即使在胚胎内部操作，也不会损伤周围组织。通过将第一束激光设置为消融波长820纳米，第二束激光设置为mCherry成像波长1,160纳米，来准备双光子显微镜。利用光路中的可移动反射镜，在扫描头的入口和出口处对准两束激光束，然后在820纳米处测量第一束激光的最大功率。将功率计置于物镜下方，关闭黑色腔室，将第一束激光功率设为100%。在功率计上开始数据采集，打开激光快门，测量输出功率，并计算达到300毫瓦所需的激光功率百分比。将第一台激光器设置为GFP激发波长920纳米，功率设为7%；将第二台激光器功率调整为15%。激活绿色和红色通道的PMT检测器，并将绿色和红色通道的PMT灵敏度均设为65。将视野调整为400乘以400微米，图像分辨率为512乘以512像素，扫描频率为800赫兹。选择三维时间序列成像模式，然后创建文件夹并启用自动保存功能，以便每次采集后自动保存数据。组装加热腔室并将其温度设置为 28 摄氏度。等待至少 10 分钟，使腔室和物镜充分预热。在荧光体视显微镜下，鉴定处于 70% 上胚层形成期且表达 GFP 的胚胎。使用塑料巴斯德吸管，将三到四个挑选出的胚胎转移至涂有琼脂糖的培养皿中，并用精细镊子小心去除卵膜。取一个小玻璃瓶，加入一毫升含有2%琼脂糖的青霉素-链霉素胚胎培养基溶液，将该瓶置于预热至42摄氏度的干式恒温金属浴中。使用火焰抛光的玻璃吸管，将一个去卵膜的胚胎转移至小瓶中，注意不要将过多的胚胎培养基带入琼脂糖溶液中。弃去移液管中剩余的胚胎培养基。吸取胚胎，并加入足量的琼脂糖以覆盖玻璃底培养皿的玻璃表面。将含有胚胎的琼脂糖吹打至培养皿的玻璃片上，确保胚胎不接触空气或培养皿的塑料侧壁。然后，用琼脂糖填充载玻片周围的腔室。使用一根睫毛将胚胎调整方向，使目标区域位于上方。五分钟后，当琼脂糖完全凝固时，在载玻片上加入数滴青霉素-链霉素胚胎培养基。将玻璃底培养皿置于加热腔内的物镜下方。在关闭腔室前，将物镜浸入青霉素-链霉素胚胎培养基中。移动滑块，将光路切换至目镜。打开荧光灯。找到胚胎并将焦距调至其表面。关闭荧光灯，在闭合暗室前将光路切换至PMTs。开始活体成像并定位轴旁中胚层。为获得良好的信号，调整激光功率。使用红色通道将载物台移动至胚胎最顶端，并将此位置设定为 Z 等于 0。选择时间步长为一分钟，Z步长为两微米。将第一层设置在轴向中胚层上方15微米处，最后一层设置在轴向中胚层下方15微米处。记录10至15分钟的消融前影片。在活体成像过程中，定位胚盾（polster）轮廓，然后使用电光调制器感兴趣区域（EOM-ROI）工具，绘制一个宽度覆盖整个胚盾、大小为20像素的矩形，并将该矩形置于胚盾中央。记录需消融的最高和最低层面的轴向位置，确保在任何层面上，感兴趣区域均不与卵黄细胞重叠。将载物台置于需消融的最低Z位置。将第一台激光器的波长设置为820纳米，并输入先前计算出的功率百分比，以获得300毫瓦的输出功率。将成像频率设置为200赫兹，第一台激光器成像EOM设置为零。选择ROI Treat模式后，关闭EOM，并将处理设置为在零帧后立即开始。将成像模式设置为延时成像，并关闭自动保存。在时间步长中选择快速模式后，调整处理帧数和帧数至对应目标深度的数值。开始成像。采集的图像应为黑色，因为在电光调制（EOM）处理期间，光电倍增管（PMT）的快门处于关闭状态。接下来，将载物台向上移动至下一个Z位置，并同样进行消融。重复此步骤，直至到达polster的顶部。消融过程完成后，将第一台激光器设置为920纳米，并调整至先前选定的成像功率。将第一台激光器的成像EOM设为100，并选择全视野模式。成像频率应为800赫兹，在以实时模式检查整个图像堆栈以确认每个层面均已消融之前，应关闭EOM。确认消融完成后，选择“3D延时成像”作为成像模式。重新启用自动保存功能，并开始记录消融后40至60分钟的影像。在消融后影像中，检查靶向细胞是否被有效消融。由于对极体的消融不应损害胚胎，因此可在受精后24小时观察消融胚胎的正常形态。在激光消融成功的情况下，表层组织不会因下层结构的消融而受到影响。处理强度过高或过低均会导致激光消融失败。一个消融失败的示例显示，位于胚盾上方的细胞被消融，这可通过胚盾上方焦平面上的自发荧光碎片明显看出。另一次无效尝试中，细胞被漂白但未被消融，低荧光信号仍显示出完整的细胞轮廓。最后，由于激光处理不足，部分细胞甚至未被漂白。气泡的形成是由于激光处理过强所引起的空化效应。在一次成功的消融实验中，每隔一分钟采集一次Z轴层扫图像，持续40分钟，同时记录细胞质中的GFP荧光信号和细胞核中的mCherry荧光信号。此外，在消融前后，对属于前半部分帽区（polster）的细胞核用洋红色圆点标记，并进行随时间追踪。为了评估迁移的持续性，研究了消融前后细胞的运动方向自相关性。属于胚盾前部的细胞在消融前表现出持续的迁移运动，而在消融后这种持续性显著降低，表明集体定向迁移能力的丧失。正确校准激光并测量激光功率对于获得可重复的实验结果至关重要。在消融后的首张成像图像上检查消融效率也至关重要。我们利用激光消融来探究细胞间相互作用在胚胎内细胞迁移过程中的作用。但该方法可轻松适用于许多其他需要精确消融细胞或组织（可能位于生物体较深部位）的研究问题。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

在斑马鱼胃中使用双光子显微镜进行深度和空间控制的体积消融

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