Name: 土壤样本中昆虫病原真菌的分离与选择及真菌对害虫的毒力评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 学习从土壤样本中分离和筛选昆虫病原真菌的方法，利用黄粉虫诱饵系统结合有效分生孢子数公式，评估真菌对害虫的毒力与耐热性，为微生物防治提供高致病性菌株。

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本研究由台湾科技事务主管部门（MOST）资助，项目编号为109-2313-B-005 -048 -MY3。

注意：整个流程图见图1。
1. 潜在昆虫病原真菌（EPF）的分离与筛选
<ol>
	<li>采集土壤样品
	<ol>
		<li>去除表层1 cm的土壤，然后使用铁铲从每个采样点采集5–10 cm深度的土壤。 
		注意：采样地点应选择山区、森林或人口稀少的区域，以避免人工喷洒的虫生真菌（EPF）菌株污染。确保土壤采样区域地表覆盖有杂草。干燥或过湿的土壤均不适用于本实验。</li>
		<li>记录每个采样点的详细信息，包括 GPS、海拔、田地类型、年均温度、年降水量、采集时间（季节）、土壤类型和 pH 值。</li>
		<li>将100 g土壤样品收集到塑料袋中，若需在3小时内于实验室进行真菌分离实验，则在室温下保存。 
		注意：如果样品在3小时内无法使用，请将土壤在室温下避光保存。若实验不能立即进行，土壤样品可保存于 4 °C 持续1周，直至方案开始18,19.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用面包虫诱捕并分离内生真菌Tenebrio molitor)
	<ol>
		<li>将100 g土壤样品放入塑料杯中（杯口直径 = 8.5 cm，高 = 12.5 cm），然后在室温避光条件下，将5只黄粉虫置于土壤表面，培养2周。 
		注意：也可使用其他类型的塑料杯容器。如果土壤过于干燥（出现裂缝或呈沙质），可喷洒灭菌的 ddH₂O2O（约5-10 mL）于土壤中。体长约为2.5 cm（14th 龄期）的 T. molitor 幼虫有助于真菌分离物筛选20.</li>
		<li>每日观察并记录幼虫的死亡率和真菌感染情况；将死亡的幼虫保留在杯中直至2周，以便进行真菌分离。 
		注意：在上述过程中，土壤样品中的真菌分生孢子会附着于粉虫幼虫体表。随着菌丝从节间膜处生长而出，可观察到真菌感染引起的真菌病症状，随后整个虫体将被菌丝体覆盖。接种7天后开始产孢，真菌感染部位的颜色将逐渐转变为分生孢子团的颜色。</li>
		<li>将死亡的昆虫转移至洁净工作台，用无菌牙签收集分生孢子，并在实验室中将其划线接种于四分之一强度沙氏葡萄糖琼脂培养基（¼ SDA）平板（55 mm）上21. 将培养板置于培养箱中孵育 25 °C 培养7天以获得真菌的原代培养物。 
		注意：¼ SDA 平板的制备方法如下：将 1.5 g 沙氏葡萄糖肉汤和 3 g 琼脂溶于 200 mL H₂O 中2O，然后灭菌20分钟。在凝固前将¼ SDA分装至每个55 mm培养皿中。凝固后的¼ SDA平板储存于 4 °C 直至使用。</li>
		<li>在超净工作台中，将每种原始培养的真菌重新划线接种至一个55 mm的¼ SDA平板上，并将培养平板置于 25 °C 培养7天以获得真菌的单菌落。</li>
		<li>重复此再分离步骤约2-3次，并在光学显微镜下观察，以获得单一且形态纯的真菌菌落。 
		注意：使用以下方法分离所有EPF T. molitor- 按照下节所述进行诱集和保存。后续各节中必须在层流环境中进行分离、保存、纯培养及划线接种。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>保存EPF菌株
	<ol>
		<li>用打孔器从每个分离的纯真菌培养平板边缘切下3块5 mm的琼脂块，放入1.5 mL微量离心管中作为一次重复。 
		注意：建议每种真菌分离物设置三个重复，用于EPF菌株在2次传代后的保存nd 毒力试验。如果储存空间有限，也建议进行分子鉴定。</li>
		<li>添加 250 µL 0.03% 表面活性剂溶液材料清单）和 250 µL 使用移液器将60%甘油加入1.5 mL微量离心管中，然后涡旋振荡10秒。</li>
		<li>用石蜡膜密封1.5 mL 微型离心管，并在 -20 °C 冰箱中冷藏24小时。然后，将预冷的真菌菌种转移至-80 °C 用于冷冻保存的冰箱。 
		注意：第1.4节中使用了额外的高纯度真菌培养平板（除冷冻保存的样品外）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1st 真菌分离株致病性筛选
	<ol>
		<li>放置五个 T. molitor 将幼虫直接置于各纯真菌培养皿的表面 25 °C.</li>
		<li>观察并记录10天内的真菌感染情况和死亡率。选取真菌分离株进行进一步分析。 
		注意：选择导致100%死亡率的真菌分离物用于2nd 毒力测试以确认它们对 T. molitor 幼虫。或者，研究人员可根据自身研究需要调整标准。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2nd 真菌分离株的毒力检测 
	注意：根据第1条st 致病性筛选，从 -80℃ 保存条件中复苏所选的真菌分离株80 °C 2 的nd 毒力试验。该2nd 毒力试验旨在对所选真菌分离株的致病性进行定量分析，以评估其在感染过程中的致病能力。st 筛选轮次
	<ol>
		<li>通过涡旋振荡1分钟收集每种真菌分离物的分生孢子，并使用血细胞计数板对分生孢子数量进行计数。</li>
		<li>将分生孢子悬液调整至浓度为 1 x 107 分生孢子/毫升，在0.03%表面活性剂溶液中（材料清单).</li>
		<li>铺展 10 µL 将真菌悬液接种至55 mm的¼ SDA平板上，在25°C下培养7天 25 °C 在暗处。</li>
		<li>放置五个 T. molitor 将幼虫直接放置于每块纯真菌培养平板表面（约 6 x 10）7 分生孢子）。用石蜡膜密封培养皿，并在 25 °C 在暗处。</li>
		<li>观察并记录10天内的真菌感染情况和死亡率。</li>
		<li>对每种真菌分离物重复进行三次测试（从步骤 1.51 到 1.5.5）。 
		注意：选择导致100%死亡率的真菌分离物用于后续实验rd 毒力测试以确认其对靶标害虫的致病性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3rd 靶标害虫真菌分离物的毒力测定斜纹夜蛾 （例如）
	<ol>
		<li>重复步骤 1.5.2 至 1.5.6，对来自 2 的选定分离株进行操作nd 毒力，用于测试对目标害虫的毒力。</li>
		<li>计算 LT50 每种真菌分离株22. 
		注意：LT50 使用 R studio（版本 3.4.1）通过广义线性模型（GLMs）计算每种真菌分离物的比率；可采用准二项式误差分布和对数链接函数以校正过度离散。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. EPF的分子鉴定
<ol>
	<li>真菌基因组DNA提取
	<ol>
		<li>收集约 1 cm2 7天¼SDA平板上的EPF</li>
		<li>提取真菌基因组DNA 使用一种真菌 根据制造商说明书使用基因组DNA提取试剂盒23 (材料表).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR 扩增与 DNA 测序
	<ol>
		<li>通过PCR扩增DNA样本中的真菌ITS区域21 使用 PCR Master Mix (2x) 及 ITS1F/ITS4R 引物组24 (表1）采用以下PCR程序： 94 °C 1 分钟，随后进行 35 个循环的 94 °C 30 秒， 55 °C 30 秒，以及 72 °C 1 分钟，随后在 72 °C 下延伸 7 分钟 72 °C. 
		注意：ITS1F/ITS4R 引物组用于属水平的鉴定。</li>
		<li>通过商业测序服务对PCR产物进行测序。</li>
		<li>利用 NCBI BLAST 在 NCBI 数据库中搜索相似的真菌，并选择相关的真菌模式种用于系统发育分析。 
		注意：属于属的真菌物种 Metarhizium 或 球孢白僵菌 应使用tef-983F/tef-2218R引物组进一步鉴定至物种水平25 （重复步骤 2.1.1 至 2.2.3）。对于不属于以下属的真菌 绿僵菌属 或 球孢白僵菌， 其他分子标记也可用于鉴定物种，包括 DNA 裂解酶 (APN2), β微管蛋白 (BTUB), RNA聚合酶II最大亚基 (RPB1), RNA聚合酶II第二大亚基 (RPB2），以及 翻译延伸因子1α的3'端部分 (TEF)25,26.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>系统发育分析
	<ol>
		<li>使用 ClustalX 2.1 软件27 对步骤 2.2.2 和 2.2.3 中获得的多序列进行比对，使用 GeneDoc 手动截取保守序列区域28.</li>
		<li>使用 MEGA7 软件进行系统发育分析29 基于最小进化（ME）、邻接法（NJ）和最大似然法（ML）方法。 
		注意：采用全部三种方法有助于确认并准确得出分类地位。通过1筛选的真菌分离株st 致病性筛选用于属水平的分子鉴定。通过2进行筛选的真菌分离株nd 毒力试验用于物种水平的分子和形态学鉴定。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 虫生真菌的形态学鉴定
<ol>
	<li>真菌菌落形态的观察
	<ol>
		<li>使用相机连续7天拍摄真菌培养物的菌落生长情况，记录菌落的生长状况、形态（如绒毛状、坚实）及颜色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>观察分生孢子与分生孢子梗
	<ol>
		<li>用接种环从纯培养的真菌菌落上刮取分生孢子，并将孢子转移至含有0.1% Tween 80溶液的载玻片上。随后加盖盖玻片，用于光学显微镜下观察分生孢子。</li>
		<li>使用解剖刀切割一段5 mm2 将真菌菌落边缘的菌丝带所在的琼脂块转移到载玻片上。</li>
		<li>清洁操作按以下步骤进行：用塑料滴管将0.1% Tween 80溶液滴加到琼脂块上，用镊子洗去大部分多余的分生孢子，然后加盖盖玻片，用于光学显微镜观察。 
		注意：0.1% Tween 80 可替换为另一种更强效的表面活性剂（材料表）取决于真菌种类及其疏水性。</li>
		<li>测量并记录分生孢子和分生孢子梗的宽度与长度，以比较不同真菌分离株之间的差异。</li>
		<li>使用 R Studio（版本 3.4.1）对各菌株的分生孢子宽度和长度进行 Welch's ANOVA 检验，并采用 Games-Howell 检验（事后检验）进行分析。 
		注意：形态特征的数据分析可根据具体情况调整。使用3筛选出的真菌分离株rd 毒力试验用于第4和第5节中的生理学表征及ECN排序。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 分生孢子产量与耐热性的研究
<ol>
	<li>分生孢子产生能力检测
	<ol>
		<li>将选定的真菌分离株在¼ SDA培养基上于25 ± 1 °C避光条件下培养10天。</li>
		<li>用0.03%表面活性剂溶液制备1 mL真菌分离株的分生孢子悬浮液，并按上述方法调整浓度至1 × 107 个分生孢子/mL。</li>
		<li>在¼ SDA培养基上滴加三滴，每滴10 µL分生孢子悬浮液，分别于25 °C避光培养7、10和14天，以计数真菌的产孢情况。 
		注：10 µL为最佳滴加体积，可在真菌生长7–14天后获得均匀产孢的5 mm菌块。</li>
		<li>在各时间点使用打孔器从菌落中心切取5 mm琼脂块，转移至含有1 mL 0.03%表面活性剂溶液（材料表）的1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>在室温下以3,000 rpm涡旋振荡15分钟，使用血细胞计数板计数分生孢子数量。 
		注：计数公式为每25个最小方格（面积 = 0.025 mm2；计数室深度 = 0.1 mm）内的分生孢子数： 
		5个方格内分生孢子总数 ÷ 80 × (4 × 106)</li>
		<li>每种分离株重复三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>耐热性检测
	<ol>
		<li>将选定的真菌分离株在¼ SDA培养基上于25 ± 1 °C避光条件下培养10天。</li>
		<li>用0.03%表面活性剂溶液制备1 mL真菌分离株的分生孢子悬浮液，并按上述方法调整浓度至1 × 107 个分生孢子/mL。</li>
		<li>涡旋混匀分生孢子悬浮液后，置于45 °C干浴中加热0、30、60、90和120分钟。每次加热后，在55 mm的¼ SDA培养基上滴加三滴，每滴5 µL分生孢子悬浮液，并于25 ± 1 °C培养18小时。 
		注：避免摊开真菌液滴，以便更清晰地观察特定区域。</li>
		<li>在200倍光学显微镜下随机选取五个视野，计数萌发的分生孢子数量，以确定萌发率。</li>
		<li>每种分离株进行三次重复实验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 有效分生孢子数（ECN）排序
<ol>
	<li>ECN 计算 
	注意：在计算总 ECN 值之前，需先获得每种潜在真菌菌株的分生孢子产量和耐热性数据21。
	<ol>
		<li>计算每个时间点分生孢子产量的倍数变化（FC）： 
		<img alt="瞬态吸收公式；符号方程，光谱学研究示意图。" src="/files/ftp_upload/62882/62882eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"> 
		其中，x = 数据采集时间点；ncp = 每天生长后的分生孢子数量；I = 接种的初始分生孢子数量。</li>
		<li>使用以下公式计算每个时间点胁迫处理下的分生孢子数量： 
		<img alt="ECN 计算公式：ECNy = I × FCx × TT0 × 胁迫系数(TTz)。" src="/files/ftp_upload/62882/62882eq02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 2"> 
		其中，y = 处理条件下该时间点的 ECN 值；TT0 = 未受热胁迫分生孢子的萌发率（即 0 分钟热处理的萌发率）；TTz = 胁迫系数，表示不同热处理时间（z）下分生孢子的萌发率。</li>
		<li>使用以下公式计算总 ECN： 
		<img alt="静态平衡方程，ΣECNy = I × FGx × TTo × 胁迫系数(TTz)，公式示意图。" src="/files/ftp_upload/62882/62882eq03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 3"></li>
		<li>比较各真菌菌株的 ECN 值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>真菌菌株的主成分分析（PCA） 
	注意：PCA 分析可验证 ECN 的排序结果，并有助于理解各生理特征值之间的相关性。比较 ECN 值，筛选出 ECN 值较高的昆虫病原真菌（EPF）分离株。</li>
	<li>使用 R 软件通过编码创建 PCA： 
	#输入 PCA 数据文件 
	​a = read.table("PCA.csv",sep=',',header=T)
	<ol>
		<li>#处理样本数据 
		row.names(a) &lt;- c("NCHU-9","NCHU-11", "NCHU-64", "NCHU-69", "NCHU-95", "NCHU-113") 
		X=row.names(a) 
		df&lt;- a[2:11]</li>
		<li>#PCA 计算 
		pca &lt;- prcomp(df, center = TRUE, scale = TRUE) 
		vars &lt;- (pca$sdev)^2 
		pc1_percent = vars[1] / sum(vars) 
		pc2_percent = vars[2] / sum(vars) 
		value = pca$x</li>
		<li>#输出 PCA 可视化文件 
		png(file = 'pca.png', height = 2000, width = 2000, res = 300) 
		注意：使用 7 至 14 天的分生孢子产量数据以及全部耐热性数据进行主成分分析（PCA），以确认 ECN 排序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据 ECN 或 PCA 结果选择表现最优的真菌菌株，并对目标害虫开展毒力测试，用于后续研究。</li>
</ol>

作者声明本工作中不存在利益冲突。

昆虫病原真菌（EPF）已被用于昆虫防治。目前已有多种方法用于分离、筛选和鉴定EPF30,31,32。在比较不同类型的昆虫诱饵方法时，Beauveria bassiana 和 Metarhizium anisopliae 常在昆虫诱饵中被发现6,12,13,14。在这些昆虫诱饵中，Galleria mellonella 和 Tenebrio molitor 对 Beauveria 和 Metarhizium 属真菌的回收率较高。事实上，利用黄粉虫（T. molitor）作为诱饵...

目前，昆虫病原真菌（EPF）已广泛应用于农林及园艺害虫的微生物防治。EPF具有宿主范围广、环境适应性强、生态友好等优点，并可与其他化学药剂联合使用，产生协同效应，助力有害生物综合治理1,2。作为害虫防治制剂的应用，有必要从感病昆虫或自然环境中分离获得大量EPF。
从宿主中采集这些生物有助于了解虫生真菌（EPF）在自然宿主中的地理分布和流行率3,4,5。然而，感染真菌的昆虫采集通常受限于野外的环境因素和昆虫种群数量4。考虑到昆虫宿主在感染虫生真菌后会死亡并落入土壤，因此从土壤样品中分离虫生真菌可能是一种稳定的资源3,6。例如，已知腐生真菌可利用死亡的宿主作为其生长的营养来源。土壤诱饵法和选择性培养基系统已被广泛用于从土壤中检测和分离虫生真菌3,4,7,8,9,10。
在选择性培养基方法中，将稀释的土壤溶液接种到含有广谱抗生素（如氯霉素、四环素或链霉素）的培养基上，以抑制细菌的生长2,3,9,11。然而，已有报道指出，该方法可能会扭曲菌株的多样性和密度，并导致对许多微生物群落的过高或过低估计6。此外，在分离过程中，所获得的菌株致病性较弱，并且会与腐生菌发生竞争。从稀释的土壤溶液中分离胞外致病真菌（EPF）较为困难3。相比之下，土壤诱饵法通过从被感染的死亡昆虫中分离EPF，可将诱饵样本保存2-3周，从而提供一种更为高效且标准化的EPF分离方法3,4,7,6。由于该方法操作简便，可在低成本条件下分离出多种致病菌株4，因此被众多研究人员广泛采用。
在比较不同类型的昆虫诱饵系统后发现，Beauveria bassiana 和 Metarhizium anisopliae 是在半翅目、鳞翅目、小蠊属和鞘翅目昆虫中发现的最常见虫生真菌（EPF）种类6,12,13,14。在这些昆虫诱饵中，与其它昆虫相比，大蜡螟（Galleria mellonella，鳞翅目）和黄粉虫（Tenebrio molitor，鞘翅目）&#160;对 Beauveria 和 Metarhizium 属真菌的回收率更高。因此，G. mellonella 和 T. molitor 常被用于昆虫诱捕法。多年来，美国农业部（USDA）已建立了一个虫生真菌菌种库（农业研究服务局虫生真菌培养物收藏，ARSEF），其中包含多种真菌种类，包括 4081 株 Beauveria 属、18 株 Clonostachys 属、878 株 Cordyceps 属、2473 株 Metarhizium 属、226 株 Purpureocillium 属以及 13 株 Pochonia 属等15。另一个虫生真菌菌种库由美国佛蒙特大学的昆虫学研究实验室（ERL）历时约 30 年建立，包含来自美国、欧洲、亚洲、非洲和中东地区的 1345 株虫生真菌菌株16。
为了控制中国台湾地区的本地或入侵性害虫，需要分离和筛选本土的昆虫病原真菌（EPF）。因此，在本实验方案中，我们改进并描述了土壤诱捕法的操作流程，并将其与昆虫诱捕（黄粉虫，Tenebrio molitor）系统相结合17。基于该方案，建立了EPF菌株库。对初步获得的EPF分离株进行了两轮筛选（接种量定量），筛选出对昆虫具有致病性的EPF分离株。对有潜力的菌株进一步进行形态学和分子生物学鉴定，并通过耐热性及分生孢子产量测定进行深入分析。此外，本文还提出了有效分生孢子数（ECN）的概念。利用ECN公式和主成分分析（PCA），在模拟环境压力条件下对潜在菌株进行分析，从而完成EPF菌株库的构建与筛选流程。随后，对有前景的EPF菌株针对目标害虫（例如，Spodoptera litura）进行了致病性验证。本方案将耐热性和分生孢子产量数据整合至ECN公式与PCA分析中，可作为EPF相关研究的标准化排序体系。

<table><tbody><tr><td>细菌学级琼脂</td><td>BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.</td><td>AGR001</td><td>适用于大多数细胞培养/分子生物学应用。</td></tr><tr><td>琼脂糖，生物技术级</td><td>BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.</td><td>AGA001</td><td>用于DNA电泳。</td></tr><tr><td>BioGreen Safe DNA凝胶缓冲液</td><td>BIOMAN</td><td>SDB001T</td><td></td></tr><tr><td>黄铜打孔器</td><td>Dogger</td><td>D89A-44001</td><td></td></tr><tr><td>Canon kiss x2</td><td>Canon</td><td>EOS 450D</td><td>用于记录菌株菌落形态</td></tr><tr><td>恒温培养箱</td><td>Yihder Co., Ltd.</td><td>LE-509RD</td><td>真菌保藏。</td></tr><tr><td>cubee迷你离心机</td><td>GeneReach</td><td>MC-CUBEE</td><td></td></tr><tr><td>DigiGel 10数字凝胶成像系统</td><td>TOPBIO</td><td>DGIS-12S</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 0.2至2 &amp;micro;L移液器</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642010</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 1至10 &amp;micro;L移液器</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642030</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 10至100 &amp;micro;L移液器</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642070</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 100至1000 &amp;micro;L移液器</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642090</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 2至20 &amp;micro;L移液器</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642060</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 20至200 &amp;micro;L移液器</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642080</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td>Applied Biosystems</td><td>4342718</td><td></td></tr><tr><td>GenepHlow凝胶/PCR纯化试剂盒</td><td>Geneaid</td><td>DFH100</td><td></td></tr><tr><td>Genius干浴恒温孵育器</td><td>Major Science</td><td>MD-01N</td><td></td></tr><tr><td>定制A型量筒 100 mL</td><td>SIBATA</td><td>SABP-1195906</td><td>用于测量试剂体积。</td></tr><tr><td>手持计数器</td><td>SDI</td><td>NO.1055</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>bioman</td><td>AP-0650010</td><td>用于计算孢子数量</td></tr><tr><td>接种环</td><td>Dogger</td><td>D8GA-23000</td><td></td></tr><tr><td>盖子</td><td>IDEAHOUSE</td><td>RS92004</td><td></td></tr><tr><td>显微盖玻片</td><td>MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD</td><td>24241</td><td></td></tr><tr><td>显微成像系统</td><td>SAGE VISION CO.,LTD</td><td>SGHD-3.6C</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>DOGGER</td><td>DG75001-07105</td><td></td></tr><tr><td>Mupid-2plus DNA凝胶电泳仪</td><td>ADVANCE</td><td>AD110</td><td></td></tr><tr><td>尼康光学显微镜</td><td>SAGE VISION CO.,LTD</td><td>Eclipse CI-L</td><td></td></tr><tr><td>塑料杯</td><td>IDEAHOUSE</td><td>CS60016</td><td></td></tr><tr><td>Presto Mini gDNA酵母基因组DNA提取试剂盒</td><td>Geneaid</td><td>GYBY300</td><td>真菌基因组DNA提取试剂盒</td></tr><tr><td>沙氏葡萄糖肉汤（沙氏液体培养基）</td><td>HiMedia Leading BioSciences Company</td><td>M033</td><td>用于酵母、霉菌及耐酸微生物的培养。</td></tr><tr><td>23号手术刀片</td><td>Swann-Morton</td><td>310</td><td></td></tr><tr><td>4号手术刀柄</td><td>AGARWAL SURGICALS</td><td>SSS -FOR-01-91</td><td></td></tr><tr><td>铲子</td><td>Save &amp; Safe</td><td>A&amp;nbsp;-1580242&amp;nbsp;-00</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>bioman(phytotech)</td><td>S7777</td><td>表面活性剂</td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 17微量离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002403</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢镊子</td><td>SIPEL ELECTRONIC SA</td><td>GG-SA</td><td></td></tr><tr><td>无菌培养皿</td><td>BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.</td><td>1621</td><td>带盖的浅圆柱形容器，专用于微生物学或细胞培养。</td></tr><tr><td>ThermoCell MixingBlock</td><td>BIOER</td><td>MB-101</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>164-21775</td><td></td></tr><tr><td>TwinGuard超低温冰箱</td><td>Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd.</td><td>MDF-DU302VX</td><td>用于-80&amp;deg;C样品储存。</td></tr><tr><td>立式落地型操作柜</td><td>Chih Chin</td><td>BSC-3</td><td>用于真菌操作与培养。</td></tr><tr><td>Vortex Genie II涡旋振荡器</td><td>Scientific</td><td>SIG560</td><td></td></tr><tr><td>拉链式储存袋</td><td>Save &amp; Safe</td><td>A&amp;nbsp;-1248915&amp;nbsp;-00</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>Geneaid</td><td>DL007</td><td></td></tr><tr><td>-20&amp;deg;C冰箱</td><td>FRIGIDAIRE</td><td>Frigidaire FFFU21M1QW</td><td>用于-20&amp;deg;C样品及实验试剂储存。</td></tr><tr><td>2X SuperRed PCR预混液</td><td>TOOLS</td><td>TE-SR01</td><td></td></tr><tr><td>50X TAE缓冲液</td><td>BIOMAN</td><td>TAE501000</td><td></td></tr></tbody></table>

从土壤样品中分离与筛选昆虫病原真菌及其对害虫的致病力评估

Isolation and Selection of Entomopathogenic Fungi from Soil Samples and Evaluation of Fungal Virulence against Insect Pests

昆虫病原真菌（EPF）是用于综合害虫管理的微生物防治剂之一。为了防控本地或入侵性害虫，分离和筛选本土来源的EPF至关重要。因此，本研究采用了一些改进的土壤诱饵法结合昆虫诱饵（黄粉虫，Tenebrio molitor）系统。分离得到的EPF随后进行了对农业害虫斜纹夜蛾（Spodoptera litura）的毒力测定。此外，对具有潜力的EPF菌株进行了形态学和分子生物学鉴定。同时，对有前景的EPF菌株开展了分生孢子产量和耐热性测定，并进行比较；这些数据进一步代入有效分生孢子数（ECN）公式中进行实验室等级排序。通过更换昆虫种类并整合更多胁迫因子，可进一步优化土壤诱饵-黄粉虫系统及ECN公式，以评估其商业化和田间应用潜力。本实验方案为EPF的筛选提供了一种快速高效的方法，将有助于推动生物防治剂的研究进展。

分离与 选择潜在的昆虫病原真菌（EPF） 
通过使用 Tenebrio molitor介导的昆虫病原真菌（EPF）文库构建方法可排除无杀虫活性的真菌数量，从而显著提高EPF的分离效率与筛选效果。在该方法应用过程中，记录了采样地点、土壤样品及真菌萌发率等信息。表 2）。根据我们之前的数据，从172份土壤样本中共分离得到101株真菌，表明分离效率较高，达64%。在101株真菌分离物中，有26株对昆虫表现出杀虫活性 T. molitor （100% 死亡率）在第 1 天后st 致病性筛选，因此淘汰的真菌分离株为26/101 = 25.7%。在2nd 毒力测试，26株真菌分离物对 T. molitor 进一步证明，其中12种对 T. molitor 幼虫（接种后5天死亡率为100%）图 2A）。这些用于评估对农业害虫的毒力试验。根据...

本文介绍了一种基于&#160;黄粉虫（Tenebrio molitor）诱饵系统从土壤样品中分离和筛选昆虫病原真菌（EPF）的实验方案。通过有效分生孢子数（ECN）公式，结合生理特性筛选出具有高抗逆性的EPF，用于田间害虫的微生物防治。

昆虫病原真菌（EPF）是用于综合害虫管理的微生物防治剂之一。为了控制本地或入侵性害虫，至关重要的是……

昆虫病原真菌的分离方法对于开发生物防治剂具有重要意义。本方案可用于从土壤样品中分离并筛选出高毒力的昆虫病原真菌菌株。该技术包含三方面的致病性筛选，并结合耐热性与分生孢子产量测定，以实现有效分生孢子数量的排序。该方法有助于筛选出高毒力且具有应用前景的昆虫病原真菌新菌株，用于商业化开发。本实验方案侧重于生物防治，也可用于发现昆虫病原真菌菌株，以研究害虫与昆虫病原真菌之间的相互作用。演示该实验操作的将是本实验室的硕士研究生 Liu Yao-Chia 和 Ni Nian-Tong。首先，通过铲去表层1厘米的土壤，然后从每个采样点深度5至10厘米处采集土壤样品。记录每个采样点的详细信息后，将100克土壤样品收集并保存于塑料袋中，在室温下存放，并在三小时内进行真菌分离实验。为分离潜在的昆虫病原真菌（EPF），将100克土壤样品放入塑料杯中，在土壤表面放置五只Tenebrio molitor幼虫，于室温避光条件下培养两周，每天观察并记录幼虫的死亡率和真菌感染情况。将死亡的幼虫保留在杯中长达两周，用于真菌分离。两周后，将死亡的昆虫转移至洁净台，使用无菌牙签采集分生孢子。为获得真菌的初代培养物，将采集的分生孢子划线接种于55毫米培养皿中的四分之一强度沙氏葡萄糖琼脂培养基（Sabouraud dextrose agar medium 或 SDA）上，在25°C条件下培养七天。第8天，在超净工作台中将每种原始培养的真菌重新划线接种至一个55毫米的四分之一强度SDA培养皿上，随后于25 °C培养7天，以获得真菌的单菌落。在首次致病性筛选实验中，将5只Tenebrio molitor幼虫直接放置于每块纯真菌培养皿表面，于25 °C条件下培养。持续观察并记录10天内的真菌感染情况及幼虫死亡率，随后选择真菌分离株进行后续分析。为了进行第二次毒力测定，通过涡旋振荡一分钟收集每种真菌分离物的分生孢子，并使用血细胞计数板对分生孢子数量进行计数。完成后，将分生孢子悬浮液用含0.03%表面活性剂的溶液调整至浓度为1×10⁷个分生孢子/毫升，然后取10 µL真菌悬浮液接种于直径55毫米的四分之一强度SDA平板上，在25°C黑暗条件下培养7天。第8天时，将5只Tenebrio molitor幼虫直接放置于每块纯培养真菌平板表面，并用Parafilm封口膜密封平板，在培养过程中观察其真菌感染情况和死亡率，观察方法同前。在对每种真菌分离物重复进行三次第二轮毒力测定后，选择用于对目标害虫（如斜纹夜蛾 Spodoptera litura）开展第三轮毒力测定的分离物。从培养七天的四分之一强度 SDA 平板上采集约一平方毫米的虫生真菌（EPF），使用真菌基因组 DNA 提取试剂盒提取真菌基因组 DNA。随后，根据文本稿件中描述的 PCR 程序，通过 PCR 扩增 DNA 样本的真菌内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）区域。通过商业测序服务对PCR扩增产物进行测序后，使用NCBI BLAST在NCBI数据库中搜索相似的真菌，并选择相应的真菌物种用于系统发育分析。使用GeneDoc手动比对多序列并修剪保守序列区域。基于最小进化法、邻接法和最大似然法进行系统发育分析。为了研究真菌的形态，使用相机连续七天记录真菌培养物菌落的生长情况，并观察记录菌落的生长状况、形态（疏松或致密）以及颜色。为了观察分生孢子梗上的分生孢子，用接种环从纯培养的菌落上刮取分生孢子，并将孢子转移至含有0.1% Tween 80溶液的载玻片上。使用解剖刀切取真菌菌落的琼脂块，然后将琼脂块转移至载玻片上，加入0.1% Tween 80溶液以洗去琼脂表面大部分多余的分生孢子。接下来，将载玻片加盖盖玻片，用于在光学显微镜下观察分生孢子。测量并记录分生孢子及分生孢子梗的宽度和长度，以比较不同真菌分离株之间的差异。通过将选定的真菌分离株接种于四分之一强度的SDA培养基上，在约25°C黑暗条件下培养10天，进行分生孢子产孢实验。然后，将真菌分离物在1 mL含0.03%表面活性剂的溶液中制备成孢子悬液，并按前述方法将浓度调整至每毫升1×10⁷个分生孢子。在四分之一强度的SDA平板上加入3滴、每滴10 µL的孢子悬液后，于25°C避光培养7、10和14天，以计数真菌的产孢情况。在每个时间点，用打孔器从菌落中心切取一个直径5 mm的琼脂块，转移至含有1 mL 0.03%表面活性剂溶液的1.5 mL微量离心管中。将试管在室温下以每分钟3,000转的速度涡旋振荡15分钟后，使用血细胞计数板对分生孢子数量进行计数。进行耐热性检测时，培养选定的真菌分离株，并制备浓度为每毫升1×10⁷个分生孢子的悬浮液，制备方法如前所述。涡旋振荡后，将分生孢子悬浮液置于干浴器中，在45 °C下加热不同时间间隔。热处理后，在每个时间点将三滴每滴5微升的分生孢子悬液接种至直径55毫米的四分之一强度SDA平板上，随后将平板在约25°C条件下培养18小时。为测定萌发率，在光学显微镜下以200倍放大倍数随机选取五个视野，计数已萌发的分生孢子数量。根据公式计算总有效分生孢子数（ECN），然后按照文中所述方法计算真菌菌株的主成分分析（PCA）。根据ECN或PCA选择对目标害虫表现出最佳效果的真菌菌株，以进行毒力测试。在第二次毒力测试中，评估了26株真菌分离物对黄粉虫（Tenebrio molitor）的毒力。从中选取12株高致病性的真菌分离物，用于对斜纹夜蛾（Spodoptera litura）进行毒力测试。为了更好地了解真菌的分类地位，对首次致病性筛选获得的26株分离物进行了基于ITS区的分子分析。通过真菌形态学观察的清洗方法，使用0.1% Tween 80溶液可清晰观察到分生孢子梗的结构。通过显微镜观察分生孢子菌落，研究了分生孢子的颜色、形状及排列方式。ECN 结合了每种虫生真菌（EPF）的分生孢子产量和耐热性数据。当 ECN 值较高时，可观察到菌株具有较高的存活能力。此外，PCA 与 ECN 之间表现出良好的一致性，表明 ECN 可用于评估与存活能力相关参数的优先级。在该实验流程中，致病性筛选、提取真菌DNA以及培养真菌分离物至关重要。通过使用ECN计算公式，可筛选出理想的内生致病真菌。结合使用不同昆虫种类（如大蜡螟和黄粉虫）共同作为诱饵，从土壤样品中诱集虫生真菌，可能增加虫生真菌的多样性。在本实验方案操作过程中，土壤微生物多样性是一个非常有趣的研究主题。未来也可通过该方案进一步深入研究。

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半翅目昆虫肠道中植物病毒与昆虫媒介蛋白的免疫荧光标记

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昆虫病原真菌 Metarhizium robertsii 和 Metarhizium pinghaense 的大规模生产及其在防治害虫中的商业应用

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