从土壤样品中分离与筛选昆虫病原真菌及其对害虫的致病力评估

昆虫病原真菌的分离方法对于开发生物防治剂具有重要意义。本方案可用于从土壤样品中分离并筛选出高毒力的昆虫病原真菌菌株。该技术包含三方面的致病性筛选，并结合耐热性与分生孢子产量测定，以实现有效分生孢子数量的排序。

该方法有助于筛选出高毒力且具有应用前景的昆虫病原真菌新菌株，用于商业化开发。本实验方案侧重于生物防治，也可用于发现昆虫病原真菌菌株，以研究害虫与昆虫病原真菌之间的相互作用。演示该实验操作的将是本实验室的硕士研究生 Liu Yao-Chia 和 Ni Nian-Tong。

首先，通过铲去表层1厘米的土壤，然后从每个采样点深度5至10厘米处采集土壤样品。记录每个采样点的详细信息后，将100克土壤样品收集并保存于塑料袋中，在室温下存放，并在三小时内进行真菌分离实验。为分离潜在的昆虫病原真菌（EPF），将100克土壤样品放入塑料杯中，在土壤表面放置五只Tenebrio molitor幼虫，于室温避光条件下培养两周，每天观察并记录幼虫的死亡率和真菌感染情况。

将死亡的幼虫保留在杯中长达两周，用于真菌分离。两周后，将死亡的昆虫转移至洁净台，使用无菌牙签采集分生孢子。为获得真菌的初代培养物，将采集的分生孢子划线接种于55毫米培养皿中的四分之一强度沙氏葡萄糖琼脂培养基（Sabouraud dextrose agar medium 或 SDA）上，在25°C条件下培养七天。

第8天，在超净工作台中将每种原始培养的真菌重新划线接种至一个55毫米的四分之一强度SDA培养皿上，随后于25 °C培养7天，以获得真菌的单菌落。在首次致病性筛选实验中，将5只Tenebrio molitor幼虫直接放置于每块纯真菌培养皿表面，于25 °C条件下培养。持续观察并记录10天内的真菌感染情况及幼虫死亡率，随后选择真菌分离株进行后续分析。

为了进行第二次毒力测定，通过涡旋振荡一分钟收集每种真菌分离物的分生孢子，并使用血细胞计数板对分生孢子数量进行计数。完成后，将分生孢子悬浮液用含0.03%表面活性剂的溶液调整至浓度为1×10⁷个分生孢子/毫升，然后取10 µL真菌悬浮液接种于直径55毫米的四分之一强度SDA平板上，在25°C黑暗条件下培养7天。第8天时，将5只Tenebrio molitor幼虫直接放置于每块纯培养真菌平板表面，并用Parafilm封口膜密封平板，在培养过程中观察其真菌感染情况和死亡率，观察方法同前。

在对每种真菌分离物重复进行三次第二轮毒力测定后，选择用于对目标害虫（如斜纹夜蛾 Spodoptera litura）开展第三轮毒力测定的分离物。从培养七天的四分之一强度 SDA 平板上采集约一平方毫米的虫生真菌（EPF），使用真菌基因组 DNA 提取试剂盒提取真菌基因组 DNA。随后，根据文本稿件中描述的 PCR 程序，通过 PCR 扩增 DNA 样本的真菌内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）区域。

通过商业测序服务对PCR扩增产物进行测序后，使用NCBI BLAST在NCBI数据库中搜索相似的真菌，并选择相应的真菌物种用于系统发育分析。使用GeneDoc手动比对多序列并修剪保守序列区域。基于最小进化法、邻接法和最大似然法进行系统发育分析。

为了研究真菌的形态，使用相机连续七天记录真菌培养物菌落的生长情况，并观察记录菌落的生长状况、形态（疏松或致密）以及颜色。为了观察分生孢子梗上的分生孢子，用接种环从纯培养的菌落上刮取分生孢子，并将孢子转移至含有0.1% Tween 80溶液的载玻片上。使用解剖刀切取真菌菌落的琼脂块，然后将琼脂块转移至载玻片上，加入0.1% Tween 80溶液以洗去琼脂表面大部分多余的分生孢子。

接下来，将载玻片加盖盖玻片，用于在光学显微镜下观察分生孢子。测量并记录分生孢子及分生孢子梗的宽度和长度，以比较不同真菌分离株之间的差异。通过将选定的真菌分离株接种于四分之一强度的SDA培养基上，在约25°C黑暗条件下培养10天，进行分生孢子产孢实验。

然后，将真菌分离物在1 mL含0.03%表面活性剂的溶液中制备成孢子悬液，并按前述方法将浓度调整至每毫升1×10⁷个分生孢子。在四分之一强度的SDA平板上加入3滴、每滴10 µL的孢子悬液后，于25°C避光培养7、10和14天，以计数真菌的产孢情况。在每个时间点，用打孔器从菌落中心切取一个直径5 mm的琼脂块，转移至含有1 mL 0.03%表面活性剂溶液的1.5 mL微量离心管中。

将试管在室温下以每分钟3,000转的速度涡旋振荡15分钟后，使用血细胞计数板对分生孢子数量进行计数。进行耐热性检测时，培养选定的真菌分离株，并制备浓度为每毫升1×10⁷个分生孢子的悬浮液，制备方法如前所述。涡旋振荡后，将分生孢子悬浮液置于干浴器中，在45 °C下加热不同时间间隔。

热处理后，在每个时间点将三滴每滴5微升的分生孢子悬液接种至直径55毫米的四分之一强度SDA平板上，随后将平板在约25°C条件下培养18小时。为测定萌发率，在光学显微镜下以200倍放大倍数随机选取五个视野，计数已萌发的分生孢子数量。根据公式计算总有效分生孢子数（ECN），然后按照文中所述方法计算真菌菌株的主成分分析（PCA）。

根据ECN或PCA选择对目标害虫表现出最佳效果的真菌菌株，以进行毒力测试。在第二次毒力测试中，评估了26株真菌分离物对黄粉虫（Tenebrio molitor）的毒力。从中选取12株高致病性的真菌分离物，用于对斜纹夜蛾（Spodoptera litura）进行毒力测试。

为了更好地了解真菌的分类地位，对首次致病性筛选获得的26株分离物进行了基于ITS区的分子分析。通过真菌形态学观察的清洗方法，使用0.1% Tween 80溶液可清晰观察到分生孢子梗的结构。通过显微镜观察分生孢子菌落，研究了分生孢子的颜色、形状及排列方式。

ECN 结合了每种虫生真菌（EPF）的分生孢子产量和耐热性数据。当 ECN 值较高时，可观察到菌株具有较高的存活能力。此外，PCA 与 ECN 之间表现出良好的一致性，表明 ECN 可用于评估与存活能力相关参数的优先级。

在该实验流程中，致病性筛选、提取真菌DNA以及培养真菌分离物至关重要。通过使用ECN计算公式，可筛选出理想的内生致病真菌。结合使用不同昆虫种类（如大蜡螟和黄粉虫）共同作为诱饵，从土壤样品中诱集虫生真菌，可能增加虫生真菌的多样性。

在本实验方案操作过程中，土壤微生物多样性是一个非常有趣的研究主题。未来也可通过该方案进一步深入研究。