在胚胎第7.5天通过子宫内纳米注射（NEPTUNE）靶向小鼠神经板
February 14th, 2022
在该协议中，我们描述了如何在E7.5处用慢病毒注射小鼠羊膜腔，导致整个神经板的均匀转导，对存活或胚胎发育的不利影响最小。
NEPTUNE允许从胚胎第7.5天开始对小鼠胚胎神经系统进行靶向和遗传操作，并能够在几天内生成敲低或谱系追踪模型。该协议适应性强、灵活且快速。我们可以提供shRNA，cdRNA或条形码病毒库，以在几天而不是几个月或几年内解决不同的问题。
我们预计海王星将提供神经科学方面的见解，但它也可以适应其他器官系统。识别羊膜腔可能非常具有挑战性，因此请花点时间查看超声图像，并可能手头有教科书或其他解剖学资源。要开始装载针头，请将玻璃针滑到金属柱塞上，保持连接，但略微松动。
然后，将毛细管针与金属柱塞一起推过前垫圈，直到到达垫片。按 Empty 将柱塞推入针中并从针尖排出油。然后按 Fill 以创建一个气泡，将油和溶液分开。
最后，放下针头，将尖端浸入溶液中，然后再次按Fill以加载针头。将具有理想大小羊膜腔的麻醉雌性小鼠固定在加热台上后，将眼凝胶涂在双眼以防止角膜干燥并皮下注射止痛药。然后，用浸有每毫升0.5毫克氯己定溶液的布擦拭下腹部并擦干皮肤，从而对下腹部进行消毒。
接下来，使用手术剪刀，在下腹部做一个 1.5 到 2 厘米的垂直中线皮肤切口。然后轻轻提起皮肤，将其从切口点周围约一厘米的底层肌肉层中解放出来，以方便手术后的缝合。接下来，在肌肉层中做一个一厘米的垂直中线切口。
使用一对镊子，抬起皮肤和肌肉层的一侧，用另一对镊子寻找子宫角。然后，使用镊子将组织固定在胚胎之间，并小心地从腹部拉出两个子宫角。对两侧的胚胎进行计数和编号，无论是从卵巢到子宫颈还是从子宫颈到卵巢。
接下来，用湿棉签轻轻地将所有胚胎推回腹腔，除了前三个要注射的胚胎。然后，将一滴PBS放在粘在市售改良培养皿的圆形中央开口上的弹性膜上，并将其保持在胚胎上方。将闭合的镊子插入松紧带的切口，然后松开镊子以打开弹性切口，将液体滴到胚胎上。
使用镊子，将对应于三个胚胎的子宫部分拉过松紧带，然后将培养皿轻轻地栖息在小鼠的腹部。使用四个粘土脚，将培养皿固定并固定在腹部上方，以减轻对小鼠的压力，并降低成像对小鼠呼吸和心跳的敏感性。接下来，使用镊子和湿棉签，调整子宫和弹性，以确保弹性密封在小鼠皮肤周围，防止PBS泄漏。
接下来，要固定子宫，将造型粘土圆柱体向下按压到胚胎或子宫的右侧，并将PBS添加到培养皿中，直到胚胎和子宫完全被PBS覆盖。为了便于记录注射，将超声探头浸入PBS并调整小鼠或手术台，使第一个胚胎与超声探头对齐。扫描所有三个胚胎并检查羊膜腔。
然后，使用超声机测量羊膜腔的直径以确定适当的注射量。使用注射控制器，将确定的注射量和注射速度设置为慢速，注射速率为每秒 23 纳升。将针头放入PBS后，使用导轨系统上的主轮，按纳米注射器控制器上的Empty，直到液体到达针尖。
然后，将针头从PBS中取出并按Inject以验证是否排出了近似所需体积的一滴。再次将针头放入PBS，并用显微操纵器上的Y平面轮移动纳米注射器，以使针头与超声探头和胚胎对齐。用注射角度轮调整针头角度，以确保相对于子宫壁的注射角度接近垂直。
然后，使用显微操纵器上的注射轮，将针头一次性插入羊膜腔。如果针尖从超声图像中消失，请向前或向后移动探头以使针头重新聚焦。然后，按 注入 适当的次数注入所需的体积。
注射所需体积后，等待 5 到 10 秒，然后轻轻地缩回针头。将载物台移至下一个胚胎，并如图所示对其他两个胚胎重复注射。接下来，使用显微操纵器将超声探头和针头从PBS中取出，将针头远离操作员以避免损坏和伤害。
使用镊子，将第一个和第二个胚胎轻轻推入松紧带，将它们放回腹部。然后，轻轻抓住与第三个胚胎相邻的组织，并将子宫拉向弹性切口的上端。用镊子轻轻拉起第四到第六个胚胎，让第三个胚胎重新进入腹部。
注射所有具有最佳羊膜腔的胚胎后，轻轻地将胚胎和子宫推回小鼠的腹部。神经板的成功转导导致胚胎在大脑和其他外胚层衍生组织（如皮肤）中强烈表达荧光报告基因。注射量过大可能导致神经管缺陷，例如脑畸形。
在胚胎第7.5天成功注射导致从前脑到后脑的均匀转导，包括脉络丛。低滴度的注射导致单细胞克隆的转导，而高滴度病毒几乎100%地转导整个大脑。通过胚胎第13.5天的冠状切片显示眼睛，晶状体，角膜和间充质的神经组织高度和均匀的转导。
在胚胎第9.5天注射后，唾液腺和导管在胚胎第11.5天左右从口腔上皮发育。舌头的舌上皮转导良好，而下面的间充质为阴性。此外，舌上皮内的阳性簇由负切片隔开，提示表面的转导。
在胚胎第7.5天注射导致胚胎第13.5天舌间充质的广泛转导，这表明早期注射靶向神经嵴细胞，有助于舌头中的间充质。慢病毒注射还导致广泛靶向中枢和周围神经系统，转导脊髓中的神经元和祖细胞，以及背根神经节。良好的准备是必不可少的。
确保没有泄漏并且胚胎固定良好，以便您可以完全专注于注射到大鼠腔中。海王星后，可以通过多种方法进行分析，例如大脑的免疫荧光分析，单细胞RNA测序，或允许注射的胚胎出生以进行行为分析。
概述
本协议概述了在胚胎第7.5天向小鼠羊膜腔注射慢病毒的方法，促进神经板均匀转导，同时对胚胎发育的不良影响最小化。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 基因操作
背景
- NEPTUNE能够实现对小鼠胚胎神经系统的基因操作。
- 它允许快速生成敲低或谱系追踪模型。
- 该协议可适应各种实验需求。
- 确定羊膜腔可能具有挑战性，需要仔细的超声成像。
研究目的
- 提供一种高效向神经板输送病毒的方法。
- 增强对胚胎神经系统发育的理解。
- 促进基因研究中的快速实验时间表。
使用的方法
- 向小鼠胚胎的羊膜腔注射慢病毒。
- 使用超声在注射过程中进行引导。
- 准备手术部位和胚胎以便注射。
- 注射后监测胚胎的发育。
主要结果
- 观察到神经板的成功转导。
- 在大脑和外胚层衍生组织中观察到荧光报告基因的强表达。
- 对胚胎生存和发育的不良影响最小化。
- 过量注射体积可能导致神经管缺陷的潜在风险。
结论
- NEPTUNE协议对早期小鼠胚胎的基因操作有效。
- 它提供了一种研究胚胎发育的快速方法。
- 进一步的应用可能扩展到其他器官系统。
常见问题
Executive Industry Relevance
NEPTUNE enables early-stage genetic manipulation of the mouse neural plate at E7.5, providing a rapid, scalable approach for target validation and functional genomics in neuroscience. By achieving >95% transduction of neural plate and neural crest derivatives, the method supports mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses in prenatal neurodevelopment. This reduces animal usage and accelerates lead identification pipelines for CNS-targeted therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in neural plate-derived tissues including brain, spinal cord, and peripheral nervous system.
- Operational Value: Supports rapid generation of knockdown or lineage tracing models in days rather than months.
- Strategic Value: Facilitates target confidence through uniform transduction of >95% of developing brain with high-titer lentivirus.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Allows mosaic transduction with low-titer virus for genetic screening and clonal analysis.
- Operational Value: Enables preparation of validated biological systems for downstream assays like immunofluorescent imaging and scRNA-seq.
- Strategic Value: Enhances screening readiness by providing quantitative, reproducible transduction metrics.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Targets ectoderm and neural crest contributing to eye, tongue, and PNS, enabling disease-relevant system modeling.
- Operational Value: Provides continuity from preneurulation stages through embryonic day 13.5 analysis.
- Strategic Value: Supports predictive de-risking by linking early genetic manipulation to phenotypic outcomes in neural and peripheral tissues.
Pipeline & Workflow Integration
NEPTUNE fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, enabling early functional validation of genes in neurodevelopmental pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via inducible shRNA or cDNA delivery to neural plate.
- Screening: Enables assay-ready models with uniform or mosaic transduction for compound or genetic library screening.
- Analytics: Generates quantitative readouts such as fluorescent reporter expression and scRNA-seq data for condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through transduction of neural crest-derived tissues like dorsal root ganglia and tongue mesenchyme.
- Enterprise Reuse: Adaptable platform for delivering shRNA, cDNA, or barcoded libraries across organ systems beyond neuroscience.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through early, widespread neural plate transduction.
- Operational Value: Standardized, reproducible injection protocol guided by ultrasound imaging.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk via early mechanistic de-risking in embryogenesis.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on prenatal phenotypic consequences.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse embryology, ultrasound guidance, and microsurgical techniques.
- Dependent on nanoinjector systems, glass capillary preparation, and sterile surgical setup.
- Necessitates cross-team standardization for embryo staging, injection volume calibration, and postoperative care.
- Adaptation across model systems requires validation of amniotic cavity access and viral tropism.
- Practical limitations include sensitivity to injection volume, with excessive volumes risking neural tube defects like exencephaly.
