小鼠胚胎7.5天在体纳米注射靶向神经板（NEPTUNE）技术

NEPTUNE 技术可从胚胎第 7.5 天起对小鼠胚胎神经系统进行靶向遗传操作，并可在数天内建立基因敲低或谱系示踪模型。该方案具有可适应性强、灵活性高和操作快速的特点。我们可在数天内递送 shRNA、cdRNA 或带有条形码的病毒文库，以解决不同的科学问题，而无需耗费数月或数年时间。

我们预期NEPTUNE技术将为神经科学领域提供新的见解，但也可适用于其他器官系统。识别羊膜腔可能具有较大挑战性，因此请仔细观察超声图像，必要时可参考教科书或其他解剖学资料。开始装载针头时，将玻璃针头套在金属推杆上，保持卡箍连接但略微松开。

然后，推动毛细管针和金属推杆穿过前端垫圈，直至到达间隔器。按“排空”以将推杆推入针内，并从针尖排出油。然后按“填充”以产生一个气泡，将油和溶液分隔开。

最后，降低针头，将针尖浸入溶液中，再次按下填充键以装填针管。将一只子宫内羊膜腔大小合适且已麻醉的雌性小鼠固定在加热台上后，向双眼涂抹眼用凝胶以防止角膜干燥，并皮下注射镇痛剂。随后，用浸有0.5毫克/毫升氯己定溶液的纱布擦拭小鼠下腹部进行消毒，再将皮肤擦干。

接下来，使用手术剪在下腹部做一条1.5至2厘米长的垂直正中皮肤切口。然后轻轻提起皮肤，并在切口周围约1厘米范围内将其与下方的肌肉层分离，以便术后缝合。接着，在肌肉层做一条1厘米长的垂直正中切口。

用一把镊子提起一侧的皮肤和肌肉层，用另一把镊子寻找子宫角。然后用镊子夹住胚胎之间的组织，小心地将两侧子宫角从腹腔中拉出。从两侧的卵巢向子宫颈或从子宫颈向卵巢方向，对胚胎进行计数并编号。

接下来，用湿润的棉签轻轻将所有胚胎推回腹腔，仅留下待注射的前三个胚胎。然后，在已粘附于市售改良培养皿圆形中央开口处的弹性膜上滴加一滴 PBS，并立即将其置于胚胎上方。将闭合的镊子插入弹性膜的切口内，随后松开镊子以撑开弹性膜切口，使液体滴落到胚胎上。

用镊子将子宫中对应三个胚胎的部分穿过弹性膜，并轻轻将培养皿置于小鼠腹部上方。使用四个黏土支脚将培养皿固定在腹部上方，以减少对小鼠的压力，同时降低成像对小鼠呼吸和心跳的敏感性。接着，用镊子和湿润的棉签调整子宫和弹性膜的位置，确保弹性膜与小鼠皮肤紧密贴合，防止 PBS 渗漏。

接下来，为了固定子宫，将塑形黏土圆柱体压在胚胎或子宫的右侧，并向培养皿中加入 PBS，直至胚胎和子宫完全被 PBS 覆盖。为了便于记录注射过程，将超声探头浸入 PBS 中，并调整小鼠或手术台的位置，使第一个胚胎与超声探头对齐。依次扫描全部三个胚胎，并检查羊膜腔。

然后，使用超声波仪器测量羊膜腔的直径，以确定合适的注射体积。使用注射控制器，设定已确定的注射体积，并将注射速度设为慢速，注射速率为每秒23纳升。将针头插入PBS溶液后，通过轨道系统上的主控旋钮，按压纳米注射控制器上的“排空”按钮，直至液体到达针尖。

然后，将针头从 PBS 中提起，按下“Inject”以确认释放出一滴体积接近所需量的液体。再次将针头插入 PBS 中，并使用显微操作器的 Y 平面轮移动纳米注射仪，使针头与超声探头及胚胎对齐。通过调节注射角度轮来调整针头角度，确保针头相对于子宫壁接近垂直注射。

然后，使用显微操作仪上的注射转轮，将针头一次性插入羊膜腔。如果针尖在超声图像中消失，可前后移动探头，使针尖重新回到焦点范围内。随后，按压“注射”按钮相应次数，注入所需体积的液体。

注射完所需体积后，轻柔地等待5到10秒，然后以一次轻柔的动作拔出针头。移动载物台至下一个胚胎，按照演示方法对另外两个胚胎重复注射操作。接下来，使用显微操作器将超声探头和针头从PBS中提起，同时将针头转向远离操作者的方向，以避免损坏和造成伤害。

使用镊子将第一和第二枚胚胎轻轻通过弹性切口推回腹腔。然后，用镊子轻轻夹住第三枚胚胎附近的组织，将子宫向上拉至弹性切口的上端。用镊子轻轻提起第四至第六枚胚胎，使第三枚胚胎自然回纳入腹腔。

在完成所有具有理想羊膜腔的胚胎注射后，轻柔地将胚胎和子宫推回小鼠腹腔内。神经板成功转导的胚胎会在脑部及其他外胚层来源的组织（如皮肤）中表现出强烈的荧光报告基因表达。注射过大的体积可能导致神经管缺陷，例如露脑畸形。

在胚胎第7.5天成功注射后，可实现从端脑到后脑的广泛且均匀的转导，包括脉络丛。低滴度病毒注射可导致单细胞克隆的转导，而高滴度病毒则几乎可转导整个大脑近100%的区域。对胚胎第13.5天的冠状切片观察显示，眼部、晶状体、角膜以及间充质的神经组织均表现出高效且均匀的转导。

在胚胎第9.5天注射后，唾液腺及导管于胚胎第11.5天左右从口腔上皮发育而来。舌部上皮组织转导效果良好，而其下方的间充质则呈阴性。此外，舌上皮内阳性细胞簇之间被阴性区域分隔，提示乳头表面发生了转导。

在胚胎第7.5天进行注射，可在胚胎第13.5天观察到舌部间充质中广泛的转导现象，表明早期注射靶向的是神经嵴细胞，这些细胞对舌部间充质的形成具有贡献。慢病毒注射还可广泛靶向中枢和周围神经系统，转导脊髓中的神经元及其前体细胞，以及背根神经节。良好的实验准备至关重要。

确保无泄漏且胚胎固定良好，以便完全专注于向大鼠体腔内注射。NEPTUNE 操作后，可通过多种方法进行分析，例如脑组织的免疫荧光分析、单细胞 RNA 测序，或让注射后的胚胎出生以进行行为学分析。