Name: 在胚胎第7.5天通过子宫内纳米注射（NEPTUNE）靶向小鼠神经板 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-14T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 了解NEPTUNE子宫内纳米注射技术，用于小鼠胚胎神经板的靶向基因操作。该方法通过超声引导在E7.5天进行慢病毒注射，实现神经板的高效转导，为神经科学和发育生物学研究提供快速灵活的基因敲低与谱系追踪模型构建方案。

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感谢Bettina Semsch和Jia Sun（Infinigene）对小鼠的精心护理；感谢Biomedicum影像核心设施（BIC）的Florian Salomons和Göran Månsson在图像采集和咨询方面提供的帮助。资助：我们感谢以下机构对本项目的支持：瑞典研究理事会、卡罗林斯卡学院（KI基金会、职业发展资助、博士生KID资助、SFO StratNeuro资助、创新医学中心）、Ollie和Elof Ericssons基金会、Tornspiran基金会、Jeansssons基金会、Sven和Ebba-Christina Hagbergs奖项及研究资助、Knut和Alice Wallenberg项目资助、Fredrik和Ingrid Thurings基金会、Lars Hiertas Minne、瑞典儿童癌症基金会（Barncancerfonden）、Åhlen基金会、Åke Wiberg基金会、Tore Nilssons基金会，以及授予ERA的瑞典基金会启动资助。图4D、E使用BioRender.com制作。

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作者声明无竞争利益。

本方案中有多个步骤会影响胚胎存活率、注射质量和实验结果。胚胎的孕龄定义为：过夜交配后，以发现阴道栓当天中午为 E0.5。在 E6.5 下午晚些时候或傍晚进行超声妊娠检查，可确保胚胎发育到足以通过超声识别的阶段。该检查具有以下作用：（1）可预先筛选出实际怀孕的栓阳性小鼠数量；（2）避免在栓阳性小鼠未怀孕的情况下解冻病毒，造成不必要的浪费；（3）减少对小鼠的不必要干预（避免对未怀孕雌鼠进行手术）。
在E7.5时期，胚胎对外力非常敏感，应小心操作。例如，牵拉子宫角或挤压蜕膜可导致胚胎被吸收。当子宫组织暴露于雌性腹部外时，应始终保持其湿润，以防组织干燥。大部分蜕膜应保留在雌性腹部内，仅暴露3-4个用于注射。针头的锋利程度是影响注射成功与否的另一个关键因素。钝化或破损的针尖会导致对蜕膜反复穿刺，或在进入羊膜腔前压迫建模黏土，从而增加胚胎吸收率。因此，应始终妥善保存研磨良好且锋利的针头，并在最多使用2只雌性动物后及时更换。
本方案描述了如何通过一次慢病毒注射靶向神经板。此外，该方法可调节转导效率，从而实现从单细胞克隆到全脑范围的表达。然而，该方法也会靶向其他非神经组织，包括皮肤和口腔上皮。同时，所有细胞类型（包括前体细胞和分化细胞）均会被转导，使得该方法效率较高但缺乏特异性。在病毒载体中使用MiniPromoters可实现外源基因在神经元或星形胶质细胞中的特异性表达15。这种方法的优势在于无需使用特定的转基因Cre动物模型，从而减少了工作量（品系维持和基因型鉴定）以及相关成本。
NEPTUNE 技术的局限性包括操作技术难度较高、难以以可预测且稳定的速度获得妊娠雌性动物，以及获取专用仪器的成本较高。此外，慢病毒对细胞的非特异性靶向作用既可被视为该技术的优势，也可被视为其局限性之一。向动脉管腔内注射较大体积的液体可导致露脑畸形。13，尽管采用本文所述的体积可避免脑部畸形和露脑畸形15因此，对大脑发育产生负面影响是一种潜在风险 在子宫内 纳米注射需谨慎操作，应根据胚胎发育阶段和心腔（AC）大小注入适量的液体，避免过量。
未来对该技术的改进可能聚焦于病毒嗜性。腺相关病毒（AAVs）具有不同的血清型，已被证明可有效靶向中枢神经系统中的不同细胞类型。17,26然而，腺相关病毒（AAV）不会整合到宿主细胞基因组中，因此在分裂速率较高的细胞中可能会丢失。尽管有多种方法可提高NEPTUNE的特异性，但在基因操作领域，转基因动物仍然是金标准。 体内Cas9 小鼠和编码 sgRNA 的慢病毒已用于胚胎表皮中的遗传筛选27 也可适用于发育中的中枢神经系统。
在E7.5时期向AC注射可高效靶向神经管形成开始前的神经外胚层细胞，且对发育中脑组织的靶向效率高于 在子宫内 电穿孔。这使得能够从更早的时间点研究对大脑发育重要的遗传信号。与经典的遗传小鼠模型相比，NEPTUNE 提供了一种灵活的功能基因分析方法。相较于需要数月甚至数年的传统模型，NEPTUNE 可在数天至数周内观察基因过表达或基因敲除后的表型。通过注射多种病毒载体，可在单个胚胎内同时操控多个基因，避免了构建双敲除或三敲除动物模型的需要。因此，NEPTUNE 不仅节省了时间，还能减少科研中动物的使用数量。

大脑和脊髓是胚胎发生过程中最早开始形成的器官之一1,2。尽管与神经发育障碍相关的基因正在被陆续鉴定，但对这些遗传变异的功能研究仍相对滞后3,4。由于构建条件性基因敲除小鼠模型通常需要数月甚至数年时间，因此人们迫切需要一种能够快速研究发育中大脑基因功能的替代技术。在小鼠胚胎中，神经管形成（neurulation）——即神经板转变为神经管并最终发育为中枢神经系统（CNS）的形态发生过程——发生在受孕后第8至10天5。在神经管形成开始之前，作为外胚层一部分的神经板由单层柱状细胞构成，这些细胞将增殖并分化为中枢神经系统中的多种神经元和胶质细胞类型6,7。因此，若要在实验上对中枢神经系统中的基因表达进行持久性调控，靶向神经板具有明显优势，其中包括所有前体细胞均易于被操作的特点。
在神经科学领域，鸡胚的 in ovo 电穿孔8,9 以及小鼠胚胎的病毒转导已被用于调控胚胎中枢神经系统（CNS）的基因表达。由于鸡胚在蛋内易于接触，且基因表达操作简便，发育中的鸡胚已成为研究脊髓发育过程中基因功能的首选模型。特别是 in ovo 质粒电穿孔技术，可在每只鸡胚的脊髓中同时建立实验组和对照组条件。电穿孔通过在胚胎两侧施加电脉冲，利用两个电极使细胞膜通透性增加，并将带负电荷的 DNA 从阴极（负极）推向阳极（正极）。在小鼠中，in utero 电穿孔通常仅限于神经管形成已完成的胚胎阶段，此时脑或脊髓已形成多层细胞结构，导致电穿孔效率较低10。质粒电穿孔仅产生短暂的基因表达，且通常只能靶向少数细胞。
超声引导下 在子宫内 显微注射已被用于操控多种胚胎结构，例如皮肤和脑11,12,13,14然而，针对发育中鼠类中枢神经系统的注射方法显示出较低的有效性，或对胚胎存活产生负面影响12,13,14因此，开发了一种改进的方案，用于在E7.5时将高滴度慢病毒递送至羊膜腔（AC），该方案被命名为NEPTUNE。 ne乌拉尔 p晚期 t靶向 在子宫内&#160;n肛门注射e作用15注射实现了持久的靶向效果 &#62;在E13.5时期，覆盖了整个大脑的95%。此外，在超声验证妊娠阶段引入了一个分期步骤，以根据发育阶段对雌性动物和妊娠情况进行分类，从而减少对实验动物的不必要操作，并提高注射成功率。注射效率和胚胎存活率与羊膜腔（AC）尺寸的增加密切相关。因此，本文描述了在注射前如何测量羊膜腔尺寸，以确定注入羊膜腔的适宜体积，避免导致胚胎吸收。NEPTUNE是一种对现有方法的可靠替代方案 在子宫内 方法可适用于多种用途，包括但不限于基因功能获得与缺失研究、谱系示踪或筛选实验15,16.

<table><tbody><tr><td>1 mL 注射器</td><td>BD Bioscience</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>27 G 针头</td><td>BD Bioscience</td><td>300635</td><td></td></tr><tr><td>3.5英寸毛细管</td><td>Drummond Scientific</td><td>3000203G/X</td><td>用于自制玻璃毛细管针的拉制</td></tr><tr><td>70 MHz MS系列换能器</td><td>Visual Sonics</td><td>MS700</td><td></td></tr><tr><td>Aquasonic 清澈超声波凝胶</td><td>Parker Laboratories</td><td>3月50日</td><td></td></tr><tr><td>Autoclip Applier 9 mm</td><td>Angthos</td><td>12020-09</td><td></td></tr><tr><td>CD1小鼠</td><td>查尔斯河实验室，德国</td><td>Crl:CD1(ICR)</td><td>雌性：8 周龄以上&lt;br/&gt; 雄性：从12周龄开始</td></tr><tr><td>棉签</td><td>OneMed Sverige AB</td><td>120788</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>精细直型手术镊 13 cm</td><td>Agnthos</td><td>08-032-130</td><td></td></tr><tr><td>EG-400 Narishige 微量移液器研磨仪</td><td>Narishige</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>EZ夹子 9 mm</td><td>Angthos</td><td>59027</td><td>夹子</td></tr><tr><td>虹膜剪，超锐型，直剪，9 cm</td><td>Agnthos</td><td>307-336-090</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Baxter Medical AB</td><td>EAN: 50085412586613</td><td>瑞典药店购买</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clarke</td><td>7557</td><td></td></tr><tr><td>膜带</td><td>Visual Sonics</td><td>SA-11053</td><td></td></tr><tr><td>微移液管拉制仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>黏土模型</td><td>正义链 AB</td><td>10209</td><td></td></tr><tr><td>小鼠操作表</td><td>Visual Sonics</td><td>50249</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II 自动注射仪套装</td><td>Drummond</td><td>3-000-205A</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>贝米斯</td><td>HS234526C</td><td></td></tr><tr><td>带中央开口的培养皿（低壁）</td><td>Visual Sonics</td><td>SA-11620</td><td></td></tr><tr><td>培养皿，（&amp;Oslash;xH)：92 × 16 毫米</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472.001</td><td></td></tr><tr><td>Rely+On Virkon</td><td>DuPont</td><td>130000132037</td><td>消毒剂</td></tr><tr><td>硅胶膜</td><td>Visual Sonics</td><td>SA-11054</td><td></td></tr><tr><td>Steri 250 热珠灭菌器</td><td>Angthos</td><td>31100</td><td></td></tr><tr><td>手术胶带（1.25 cm × 9.14 m）</td><td>Medicarrier</td><td>67034</td><td></td></tr><tr><td>Vevo Compact Dual（Med. Air &amp;amp; O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;麻醉系统</td><td>Visual Sonics</td><td>VS-12055</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 成像系统 2</td><td>Visual Sonics</td><td>VS-11983</td><td></td></tr><tr><td>Vevo2100</td><td>Visual Sonics</td><td>VS-20047</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 6-0；C-3 针头，45 cm 紫色缝线</td><td>Agnthos</td><td>J384H</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠胚胎7.5天在体纳米注射靶向神经板（neptune）技术

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

操控发育中小鼠大脑中的基因表达 在子宫内 在功能遗传学研究中具有巨大潜力。然而，该技术此前主要局限于神经管形成后的胚胎阶段操作。本研究建立了一种在胚胎第7.5天（E7.5）向羊膜腔注射慢病毒的实验方案，所用慢病毒编码靶向特定基因的cDNA或shRNA &gt;95%的神经板和神经嵴细胞，这些细胞将参与形成未来的脑、脊髓以及周围神经系统。本方案描述了实现成功转导所需的各个步骤，包括玻璃毛细注射针的打磨、妊娠确认、利用超声成像进行胚胎发育分期，以及根据胚胎发育阶段确定最佳注射体积。 
采用本方案，可通过高滴度慢病毒实现对发育中脑组织超过&gt;95%的转导，从而进行全脑范围的遗传操作。相比之下，使用较低病毒滴度则可实现嵌合式转导，适用于遗传筛选或谱系示踪研究。在胚胎7.5天（E7.5）注射还可靶向参与眼球、舌部及周围神经系统不同结构形成的外胚层和神经嵴细胞。因此，该技术能够在小鼠神经板及外胚层来源组织的神经发生前期阶段操控基因表达，同时有助于减少实验所需小鼠数量。

在E7.5时期注射hPGK-H2B-GFP慢病毒11,12的胚胎于E13.5时期收集，并在荧光解剖显微镜下观察（图5A）。神经板成功转导的胚胎主要在脑部，以及皮肤等其他外胚层来源组织中表现出强烈的荧光报告基因表达（图5A、B）。若注射体积过大（超过本方案推荐体积，例如≥500 nL），会增加羊膜腔（AC）内压力，可能导致胚胎完全吸收（数据未显示）或出现神经管缺陷，如露脑畸形（图5A）。在E7.5时期成功注射的胚胎，其前脑至后脑区域呈现均匀的转导效果（图5C–J）。
约 2 × 1010 感染单位（IFU）的慢病毒滴度可实现超过 95% 的靶向效率，而约 1 × 109 IFU 的滴度则可达到 15% 的靶向效率15。此外，以往使用电穿孔难以靶向的结构，如脉络丛17,18，也可被有效靶向（图 5 E,F）。通过调整注入前脑室（AC）的病毒滴度，可调节转导效率。低滴度注射可实现单细胞克隆的转导（图 5C、图 5E 和 图 5G,H），而高滴度病毒则几乎可转导全脑近 100% 的细胞（图 5D、图 5F、图 5H 和 图 5J）。因此，NEPTUNE 技术既可用于克隆转导、谱系示踪和遗传筛选研究，也可用于研究基因在全脑范围内过表达或下调所产生的整体效应。
哺乳动物眼睛的发育是胚胎外胚层三个衍生物之间有序通讯的结果：神经视网膜（NR）和视网膜色素上皮（RPE）来源于前脑腹侧的神经上皮，而表面外胚层则发育为晶状体和角膜上皮。然而，角膜的另外两层——中央基质层和后部内皮层——则起源于眼周间充质的神经嵴细胞19,20。对E7.5时注射高滴度慢病毒的E13.5胚胎进行冠状切片观察，结果显示，与大脑类似，眼部的神经组织、晶状体、角膜以及间充质均实现了高效且均匀的转导（图5K）。随着神经管的进一步发育，在E8.5和E9.5注射后，晶状体和角膜上皮仍能持续被靶向（图5L 和 图5N），而起源于神经外胚层的眼部组织在E8.5时的转导效率较低（图5L,M），在E9.5时则几乎未被靶向（图5N）。
尽管大多数病毒颗粒在注射后会感染暴露的组织，但部分颗粒可转导后期发育的非外胚层来源组织。图6A）。唾液腺及其导管在E11.5左右从口腔上皮发育而来21 并以NEPTUNE为靶向（图6B）。在E9.5注射后，舌部的舌上皮可实现良好转导；然而，其下方的间充质呈阴性（图6C；方括号表示转导的细胞；星号表示未转导细胞的自发荧光信号）。此外，舌上皮内存在阳性簇状区域，由阴性区段分隔（图6C，白色箭头所示），提示乳头表面发生了转导。已有关于神经嵴细胞存在于舌部下方间充质及舌上皮内的描述，这些细胞参与味觉乳头和味蕾的发育过程22的确，在 E7.5 时期注射可在 E13.5 时期实现舌间充质的广泛转导（图6D，表明早期注射靶向神经嵴细胞，这些细胞有助于舌部间充质的形成。
在脊椎动物中，背根神经节（DRGs）是外周神经系统（PNS）的核心组成部分，因为来自身体外周的所有躯体感觉输入（如温度、疼痛、压力）均通过激活背根神经节神经元传递至大脑23背根神经节中的神经元和胶质细胞均起源于躯干神经嵴细胞24. 慢病毒注射使用普遍性hPGK启动子控制荧光报告基因的表达，可实现对中枢和外周神经系统广泛靶向图7A），在脊髓中转导神经元和前体细胞图 7B)，以及背根神经节（DRG）图7C). 使用 doublecortin 的 MiniPromoter25 使其能够将GFP表达限制在神经元中15 和 图7D，E).
<img alt="E13.5 脑组织 GFP-DAPI 成像，前脑，后脑克隆转导，全脑操作" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5：使用NEPTUNE实现高效或克隆型转导。 (A在解剖显微镜下观察，采用标准照明（左图）和 GFP 荧光照明（右图）的 E13.5 胚胎。最左侧为未注射胚胎，最右侧为成功注射胚胎，脑部显示阳性信号（最右侧胚胎）。中间胚胎因注射体积过大导致露脑畸形。B) E7.5 注射实现皮肤和脑靶向。比例尺 = 50 µm. (C, DE13.5 期前脑低克隆转导的共聚焦图像C）或高效转导（D). (C、E、G、I) 脑内不同区域的克隆转导。D、F、H、J) 高效转导大脑不同区域。比例尺 = 200 µm. 不同的转导效率代表了中枢神经系统其他区域的情况。E, F脉络丛靶向，克隆性E）或具有高效率（F。比例尺 = 200 µm. (G, H克隆靶向G）和高效（H)针对后脑的定位，在（中放大I, J。比例尺 = 200 µm. (K) E13.5 时眼睛中 GFP 报告基因的表达情况 在子宫内 E7.5 时注射L, M) E15.5 时眼睛中 GFP 报告基因的表达 在子宫内 E8.5 时注射L），框选区域在（M），或在E9.5（N）。自体荧光血管用白色星号标记。比例尺 = 100 µm缩写：NEPTUNE = ne乌拉尔 p晚期 t靶向 在子宫内 n肛门注射eC = 角膜；LE = 晶状体上皮；LF = 晶状体纤维；M = 间充质；NR = 神经视网膜；ON = 视神经；RPE = 视网膜色素上皮；GFP = green fluorescent protein；CNS = central nervous system <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠胚胎舌组织，DAPI/RFP染色，唾液导管，上皮分析，荧光显微镜观察" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6: 在子宫内 非神经组织的转导 (AE15.5 口腔腔隙的共聚焦图像。胚胎在 E9.5 时注射了荧光报告病毒慢病毒。比例尺 = 200 µm. (B, C) (B) 插图放大图；经病毒转导的唾液腺导管上皮。C) 插图放大；转导了GFP报告病毒的背侧舌上皮（白色括号）。源自神经嵴细胞的下方间充质呈阴性。白色箭头指示出被病毒转导的上皮细胞包围的乳头结构，其中神经嵴细胞为阴性（自体荧光的血细胞/血管以白色星号标记）。比例尺 = 50 µm. (D) E7.5 时注射荧光报告病毒后 E13.5 舌间充质的示意图与共聚焦图像。比例尺 = 50 µm缩写：D = 背侧；M = 间充质；N = 鼻咽部；SLD = 舌下管；SMD = 颌下管；T = 舌；V = 腹侧；GFP = green fluorescent protein。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠胚胎注射示意图；神经分化，E13.5 脊髓，GFP，SOX2，NeuN 标记物" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图7"> 
图7神经嵴来源的背根神经节细胞的转导 (A) NEPTUNE 在 E7.5 时期靶向可同时作用于中枢神经系统和外周神经系统。 (BE13.5 脊髓和DRG注射后的共聚焦图像 hPGK-H2B-GFP 报告慢病毒在E7.5时显示对SOX2的转导+ 神经前体细胞和 NeuN+ 神经元。比例尺 = 100 µm. (CB图中框选区域显示DRG中SOX2的GFP表达+ （白色箭头）和 NeuN+ （白色箭头）细胞群体。比例尺 = 20 µm. (DE13.5 脊髓和DRG注射后的共聚焦图像 DCX-H2B-GFP 在E7.5阶段靶向DCX的慢病毒+ 细胞。比例尺 = 100 µm. (E) 方框所示区域 D 显示DRG中GFP表达局限于DCX+ 神经元（白色箭头）。DCX- 细胞GFP染色呈阴性（白色箭头）。比例尺 = 20 µm缩写：NEPTUNE = ne乌拉尔 p晚期 t靶向 在子宫内 n肛门注射e作用；CNS = 中枢神经系统；PNS = 外周神经系统；DRGs = 背根神经节；GFP = 绿色荧光蛋白。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

在本实验方案中，我们描述了如何在E7.5时期向小鼠羊膜腔注射慢病毒，从而实现整个神经板的均匀转导，同时对胚胎存活率或发育过程造成极小的不利影响。

小鼠胚胎7.5天在体纳米注射靶向神经板（NEPTUNE）技术

在子宫内操控小鼠发育中大脑的基因表达，对于功能遗传学研究具有巨大潜力。然而，此前……

NEPTUNE 技术可从胚胎第 7.5 天起对小鼠胚胎神经系统进行靶向遗传操作，并可在数天内建立基因敲低或谱系示踪模型。该方案具有可适应性强、灵活性高和操作快速的特点。我们可在数天内递送 shRNA、cdRNA 或带有条形码的病毒文库，以解决不同的科学问题，而无需耗费数月或数年时间。我们预期NEPTUNE技术将为神经科学领域提供新的见解，但也可适用于其他器官系统。识别羊膜腔可能具有较大挑战性，因此请仔细观察超声图像，必要时可参考教科书或其他解剖学资料。开始装载针头时，将玻璃针头套在金属推杆上，保持卡箍连接但略微松开。然后，推动毛细管针和金属推杆穿过前端垫圈，直至到达间隔器。按“排空”以将推杆推入针内，并从针尖排出油。然后按“填充”以产生一个气泡，将油和溶液分隔开。最后，降低针头，将针尖浸入溶液中，再次按下填充键以装填针管。将一只子宫内羊膜腔大小合适且已麻醉的雌性小鼠固定在加热台上后，向双眼涂抹眼用凝胶以防止角膜干燥，并皮下注射镇痛剂。随后，用浸有0.5毫克/毫升氯己定溶液的纱布擦拭小鼠下腹部进行消毒，再将皮肤擦干。接下来，使用手术剪在下腹部做一条1.5至2厘米长的垂直正中皮肤切口。然后轻轻提起皮肤，并在切口周围约1厘米范围内将其与下方的肌肉层分离，以便术后缝合。接着，在肌肉层做一条1厘米长的垂直正中切口。用一把镊子提起一侧的皮肤和肌肉层，用另一把镊子寻找子宫角。然后用镊子夹住胚胎之间的组织，小心地将两侧子宫角从腹腔中拉出。从两侧的卵巢向子宫颈或从子宫颈向卵巢方向，对胚胎进行计数并编号。接下来，用湿润的棉签轻轻将所有胚胎推回腹腔，仅留下待注射的前三个胚胎。然后，在已粘附于市售改良培养皿圆形中央开口处的弹性膜上滴加一滴 PBS，并立即将其置于胚胎上方。将闭合的镊子插入弹性膜的切口内，随后松开镊子以撑开弹性膜切口，使液体滴落到胚胎上。用镊子将子宫中对应三个胚胎的部分穿过弹性膜，并轻轻将培养皿置于小鼠腹部上方。使用四个黏土支脚将培养皿固定在腹部上方，以减少对小鼠的压力，同时降低成像对小鼠呼吸和心跳的敏感性。接着，用镊子和湿润的棉签调整子宫和弹性膜的位置，确保弹性膜与小鼠皮肤紧密贴合，防止 PBS 渗漏。接下来，为了固定子宫，将塑形黏土圆柱体压在胚胎或子宫的右侧，并向培养皿中加入 PBS，直至胚胎和子宫完全被 PBS 覆盖。为了便于记录注射过程，将超声探头浸入 PBS 中，并调整小鼠或手术台的位置，使第一个胚胎与超声探头对齐。依次扫描全部三个胚胎，并检查羊膜腔。然后，使用超声波仪器测量羊膜腔的直径，以确定合适的注射体积。使用注射控制器，设定已确定的注射体积，并将注射速度设为慢速，注射速率为每秒23纳升。将针头插入PBS溶液后，通过轨道系统上的主控旋钮，按压纳米注射控制器上的“排空”按钮，直至液体到达针尖。然后，将针头从 PBS 中提起，按下“Inject”以确认释放出一滴体积接近所需量的液体。再次将针头插入 PBS 中，并使用显微操作器的 Y 平面轮移动纳米注射仪，使针头与超声探头及胚胎对齐。通过调节注射角度轮来调整针头角度，确保针头相对于子宫壁接近垂直注射。然后，使用显微操作仪上的注射转轮，将针头一次性插入羊膜腔。如果针尖在超声图像中消失，可前后移动探头，使针尖重新回到焦点范围内。随后，按压“注射”按钮相应次数，注入所需体积的液体。注射完所需体积后，轻柔地等待5到10秒，然后以一次轻柔的动作拔出针头。移动载物台至下一个胚胎，按照演示方法对另外两个胚胎重复注射操作。接下来，使用显微操作器将超声探头和针头从PBS中提起，同时将针头转向远离操作者的方向，以避免损坏和造成伤害。使用镊子将第一和第二枚胚胎轻轻通过弹性切口推回腹腔。然后，用镊子轻轻夹住第三枚胚胎附近的组织，将子宫向上拉至弹性切口的上端。用镊子轻轻提起第四至第六枚胚胎，使第三枚胚胎自然回纳入腹腔。在完成所有具有理想羊膜腔的胚胎注射后，轻柔地将胚胎和子宫推回小鼠腹腔内。神经板成功转导的胚胎会在脑部及其他外胚层来源的组织（如皮肤）中表现出强烈的荧光报告基因表达。注射过大的体积可能导致神经管缺陷，例如露脑畸形。在胚胎第7.5天成功注射后，可实现从端脑到后脑的广泛且均匀的转导，包括脉络丛。低滴度病毒注射可导致单细胞克隆的转导，而高滴度病毒则几乎可转导整个大脑近100%的区域。对胚胎第13.5天的冠状切片观察显示，眼部、晶状体、角膜以及间充质的神经组织均表现出高效且均匀的转导。 在胚胎第9.5天注射后，唾液腺及导管于胚胎第11.5天左右从口腔上皮发育而来。舌部上皮组织转导效果良好，而其下方的间充质则呈阴性。此外，舌上皮内阳性细胞簇之间被阴性区域分隔，提示乳头表面发生了转导。在胚胎第7.5天进行注射，可在胚胎第13.5天观察到舌部间充质中广泛的转导现象，表明早期注射靶向的是神经嵴细胞，这些细胞对舌部间充质的形成具有贡献。慢病毒注射还可广泛靶向中枢和周围神经系统，转导脊髓中的神经元及其前体细胞，以及背根神经节。良好的实验准备至关重要。确保无泄漏且胚胎固定良好，以便完全专注于向大鼠体腔内注射。NEPTUNE 操作后，可通过多种方法进行分析，例如脑组织的免疫荧光分析、单细胞 RNA 测序，或让注射后的胚胎出生以进行行为学分析。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

在胚胎第7.5天通过子宫内纳米注射（NEPTUNE）靶向小鼠神经板

超声引导下小鼠前脑微注射 子宫内 在E9.5时

在子宫内 电穿孔是一种用于转染神经前体细胞的有效方法 体内根据电极的位置和电穿孔的发育时间点，可以选择性地靶向特定的皮层细胞亚群。随后可对这些靶向细胞进行分析 体内 或 体外...

在子宫内 电穿孔联合原代神经元培养用于研究皮层神经元亚群中的基因功能

高效基因递送至中枢神经系统多个区域 在子宫内 电穿孔

本文介绍了一种利用独特手术方法和特殊形状电极将基因转入发育中 小鼠大脑...

小鼠 在子宫内 电穿孔：可控时空基因转染

介绍了一种在神经管形成期间直接对小鼠胚胎进行药理学操作的方法，该方法可绕过母体代谢。通过改变给药时间点和药理学试剂，该技术可适用于研究神经管形成的不同方面。...

小鼠全胚胎培养中的神经管闭合

来源：Mangold, K., H el. al., 胚胎发育第7.5天小鼠神经板靶向子宫内纳米注射（NEPTUNE）技术。J. Vis. Exp.

通过子宫内纳米注射在小鼠胚胎模型中操控神经板细胞

本实验方案旨在描述一种功能缺失和功能获得的方法，可用于鉴定新生素（neogenin）作为植入前小鼠胚胎中滋养外胚层和内细胞团分化的阶段特异性受体。...

利用功能缺失与功能获得方法研究小鼠着床前胚胎早期细胞命运决定因子

本文介绍了一种利用命运图和谱系示踪技术，将注射靶向至个体卵裂球的实验方案，这些卵裂球将发育为非洲爪蟾（Xenopus...

靶向显微注射技术用于发育中的 非洲爪蟾 肾脏

本文展示了如何利用小鼠胚胎后脑作为模型，通过完整器官和组织切片制备来研究发育性神经发生。...

小鼠后脑作为研究胚胎期神经发生的模型

神经干细胞/前体细胞表现出Notch信号通路组分的多种表达动态，从而导致细胞事件的不同结果。此类动态表达可通过高灵敏度的生物发光成像系统进行实时监测，而非静态分析，从而实现对基因表达快速变化的可视化观察。...

实时生物发光成像监测小鼠神经发生过程中Notch信号动态变化

本文介绍了一种利用子宫内电穿孔技术在雪貂胚胎脑中进行遗传操作的实验方案。该方法可在体内实现对新皮层中神经前体细胞的靶向操作。...

在体电穿孔靶向雪貂新皮层中的神经前体细胞

了解NEPTUNE子宫内纳米注射技术，用于小鼠胚胎神经板的靶向基因操作。该方法通过超声引导在E7.5天进行慢病毒注射，实现神经板的高效转导，为神经科学和发育生物学研究提供快速灵活的基因敲低与谱系追踪模型构建方案。

小鼠胚胎7.5天在体纳米注射靶向神经板（NEPTUNE）技术

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