Name: 在子宫内的电穿孔其次原发性神经文化为研究基因的功能在皮层神经元的一个子集 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 了解子宫内电穿孔技术用于研究大鼠胚胎皮层神经元基因功能的方法。该技术可靶向特定神经祖细胞亚群，分析基因调控对神经突生长和分支的影响，为神经发育研究提供精确的体内实验手段。

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作者感谢 Joseph LoTurco 和 Dennis Selkoe 就本技术提供的有益讨论。作者感谢美国健康援助基金会的捐赠者对本研究的支持。

基础实验方案 在子宫内 电穿孔技术已在Kriegstein实验室发表的另一篇JoVE文章中有详细描述 1, 2该技术最初由Osumi实验室描述。 3 我们的方案基于LoTurco实验室开发的一种方法 4我们将概述本实验方案的 在子宫内 大鼠胚胎电穿孔，重点关注最关键的细节，随后介绍我们应用的方案 在子宫内 电穿孔技术在神经元突起生长过程中基因功能研究中的应用。
1. 在子宫内 电穿孔
<ol>
<li>制备DNA并装填针头 
第一步是 在子宫内 电穿孔实验的设计关键在于确定您希望注射的DNA构建体。该方法适用于目的基因的异位表达或基因敲低。如果您计划进行基因的异位表达或过表达，请务必选用在神经前体细胞中具有活性的启动子。我们推荐使用CAGGS启动子，它由鸡β-actin启动子和CMV增强子组成 5由于仅有一小部分细胞在转染后成功导入 在子宫内 电穿孔时，必须包含一种编码荧光蛋白（如GFP）的质粒，以便追踪成功转染的细胞。对于编码GFP的质粒，我们建议将DNA制备至以下浓度： 0.5 μg 每微升。对于shRNA载体，我们发现0.5-1.0 μG 每 μL 可实现目标基因的有效敲低。对于过表达或异位表达，我们使用1.0至1.5之间 3.0 μG 每微升，具体取决于基因大小及实验所需的表达水平。DNA 使用 Qiagen 无内毒素预提纯试剂盒制备，并用 1×PBS 稀释。我们注射约 0.5–1.0 μL 每个胚胎脑组织，因此，对于一窝动物，我们进行制备 10 μL 用于注射的DNA混合物。我们加入 1 μL 加入快绿（Fast Green）以便追踪注射的DNA。 
将针头拉制成正确形状是一个关键步骤。Walantus 等 使用不同的DNA递送系统，因此他们的针头制备方法也与我们的略有不同1,2您所使用的拉针仪参数设置取决于所用拉针仪的品牌。我们使用的是 David Kopf 公司的 Model 750 型号。我们采用的设置为：Heat 1: 9.0，Heat 2: 0，Solenoid: 0，Filament size 3.0 mm，Heater Proximity: 3 mm，Time: 10 sec。拉制完成后，我们使用剃刀刀片以约 45 度角切割针尖，使开口最宽处至针尖的距离为 11 mm。随后从针的后端装入 DNA。接着用玉米油填充针内剩余空间。进行 DNA 注射时，我们使用 Picospritzer III。根据每根针切割出的具体斜面角度不同，我们将 Picospritzer 的压力设定在 4.0 至 6.0 之间。通过脚踏开关控制加压空气的释放，将 DNA 从针中推出。</li>
<li> 手术前动物准备 
我们仅使用无病原体的Sprague Dawley大鼠进行这些手术。其他一些实验室也使用不同基因型的小鼠。本文中，我们展示了对E15大鼠胚胎进行电穿孔的实验方案，但 在子宫内 电穿孔通常在大鼠胚胎发育第13至18天（E13–E18）之间进行。早期阶段的电穿孔主要靶向大脑皮层的深层区域，而晚期阶段的电穿孔则主要靶向更表层的皮层区域。 
动物在手术开始前接受一次术前剂量的丁丙诺啡（0.05–0.1 mg/kg）。动物麻醉有多种可选方案。Walantus 等 采用异氟烷吸入麻醉，而我们常规使用腹腔注射氯胺酮（40-80 mg/kg）和赛拉嗪（5-10 mg/kg）1,2应始终进行足趾夹捏测试，以确保动物已完全麻醉且无反应。手术过程中，动物应始终保持在加热垫上。 
在切口区域剃除动物毛发，依次用乙醇清洗三次，再用碘液清洗三次。在皮肤中线外侧做一纵向切口，随后切开肌肉层。小心暴露子宫角，并用指尖轻柔地将其从体腔中分离出来。胚胎移出体腔后，需用无菌 PBS 保持其湿润。</li>
<li>注射DNA与电穿孔 
当你刚开始进行此类手术时，最难的部分是熟悉需要将DNA注射到哪个位置才能充满侧脑室，以及适应进针的深度以准确到达目标区域。通过手指轻柔地触碰胚胎，可以确定头部的位置；仔细观察时，能够看到颅骨的中线缝合线。该中线可作为通用解剖标志，用于判断侧脑室的大致位置。我们通过子宫壁将DNA注射至侧脑室中，并使用脚踏开关控制DNA的注射——通过多次脉冲注射，直至侧脑室完全充满DNA与染料的混合液。随后，将电极板置于胚胎头部两侧，并使用另一个脚踏开关对胚胎头部施加电脉冲。电极的放置位置对于确定大脑皮层中被电穿孔的区域至关重要。由于DNA带负电荷，在电极间施加电流后，DNA会向正极电极方向迁移。根据电极放置位置的不同，可靶向转染不同亚群的细胞。我们通常将正极电极置于大脑半球背侧-内侧区域。然而，LoTurco实验室的研究清晰表明，若将电极置于大脑半球更靠腹侧和外侧的区域，则可靶向皮层-纹状体边界处的细胞，并转染外侧皮层流的细胞。 6每个胚胎均可进行电穿孔，并可在每个胚胎中使用不同组合的DNA构建体。</li>
<li>缝合与术后护理 
所有胚胎电穿孔后，将子宫角小心放回体腔，并缝合肌肉层和皮肤。该操作技术详见 Walantus 等1,2动物需持续监测直至从麻醉中恢复，并每8-12小时给予镇痛剂布托啡诺（0.05-0.1 mg/kg）。</li>
</ol>
2. 培养电穿孔的皮层神经元
<ol>
<li> 收获电穿孔后的大脑并分离电穿孔区域 
对于 体内 分析步骤如下 在子宫内 电穿孔后，动物可在电穿孔后24小时至出生早期乃至成年期的任意时间点处死取材。然而，在培养原代神经元时，我们通常在胚胎16天（E16）电穿孔后24小时进行收获。此时，经电穿孔的胚胎已表达可检测水平的GFP。 
动物通过吸入二氧化碳并快速断头处死。将胚胎从子宫中解剖取出，并置于含二价阳离子的HBSS中，注意记录各胚胎所电穿孔导入的DNA质粒类型。解剖过程中必须使用过滤的HBSS、无菌管和培养皿，以及经高压灭菌的器械。在生物安全柜内的显微镜下解剖分离大脑皮层，并去除脑膜。随后在具备观察GFP能力的解剖显微镜下检查这些皮层组织，识别出GFP阳性区域，并使用Vanna剪将皮层中的GFP阳性区域剪下。将剪下的组织置于不含二价阳离子的HBSS中，放入15 ml锥形管内。</li>
<li>解离与接种神经元 
所有GFP阳性区域解剖完毕后，弃去HBSS，加入0.25%胰蛋白酶，37摄氏度孵育5分钟。去除胰蛋白酶，加入铺板培养基（DMEM + 5% FBS + 青霉素/链霉素 + 谷氨酰胺），吹打5–7次以解离细胞。所用体积根据组织量而定。解离后的细胞接种于CC2包被的双孔腔载玻片上。对于两个双孔腔载玻片，每孔接种200,000–350,000个细胞，接种体积为1.5 mL铺板培养基。4小时后，吸除铺板培养基，每孔更换为1.5 mL神经元培养基（Neurobasal培养基 + B27添加剂 + GlutaMax + 庆大霉素）。</li>
</ol>
3. 分析神经元突起生长
<ol>
<li>固定与免疫染色培养物 
为了检测对这些细胞进行遗传操作后的短期效应，我们在三天后收获原代神经元 体外若需对原代神经元进行更长时间的培养以进行后续分析，应每隔三天更换一半培养基。对于培养物的固定，我们先吸除腔室中的培养基，随后用4%多聚甲醛固定神经元15分钟。固定后，细胞用PBS洗涤两次，每次洗涤后置于封闭液（含2%驴血清和0.1% Triton X-100的PBS）中孵育1小时。接着将细胞与一抗在室温下孵育1小时。为分析神经元突起的生长情况，我们使用抗-beta tubulin抗体标记神经元——beta II tubulin免疫染色可标记神经元胞体、树突和轴突。随后，细胞在PBS中洗涤三次，每次5分钟，再与Cy3标记的抗小鼠二抗室温孵育1小时，之后再进行三次PBS洗涤，用DAPI复染细胞核，最后封片。</li>
<li>测量神经突长度 
在配备MC100相机系统的蔡司Axioskop显微镜上采集GFP阳性、β-III微管蛋白阳性神经元的图像。可对这些GFP阳性细胞中的多个变量进行检测，包括所有神经突的总长度、最长神经突的长度、神经突的分支情况、胞体大小等。我们已采用该方法分析与神经发育和神经退行性疾病相关基因的敲低或过表达对神经突向外生长的影响，重点关注神经突长度的变化。为测量神经突的生长情况，我们使用蔡司Axiovision LE 4.4软件。该软件中提供“轮廓”工具选项，利用此工具可通过计算机鼠标逐条追踪每个神经突的长度。为获得准确的神经突长度测量值，必须明确定义所使用的物镜倍数。在这些分析中，我们通常使用20倍物镜。</li>
</ol>
4. 代表性结果
我们发现，Sprague Dawley 大鼠的每窝胚胎数量在 6 到 14 个之间。我们通常对所有胚胎进行电穿孔。每个胚胎可以使用不同的 DNA 组合进行电穿孔。然而，我们通常至少对四个大脑施加相同的实验条件，并在解离和接种前将这些大脑组织合并。
我们发现，利用该技术，约75%的电转染大脑能够准确靶向目标皮层区域，无论是背内侧还是腹外侧皮层（图1）。此外，我们在E13-14时期进行的早期电转染主要靶向深层神经元，例如Tbr1阳性的第VI层神经元；而在较晚时期进行的电转染则靶向CTIP2阳性、TBR1阴性的第V层细胞，更晚时期的电转染则靶向Brn2阳性的第II/III层细胞。关于皮层中不同标记物及神经元亚型特化的详细描述，可参考Moleneaux等人发表的文章7。图2展示了在胚胎期15.5天或17.5天进行电转染，并在出生后第5天取材的大脑冠状切片，其中红色显示Oct6的免疫染色结果。您可在体外培养中对标志物进行免疫染色，以确认所靶向的细胞层群。我们发现，同一批次中每个胚胎所靶向的细胞层群基本一致（即靶向性主要取决于胚胎发育的时间点，而非其他技术性差异）。
在培养过程中，GFP阳性细胞所占百分比可能因解剖GFP阳性区域时操作的保守程度不同而有很大差异（图3）。然而，即使操作非常保守，仅分离出GFP阳性的细胞区域，我们观察到的最高比例也仅为5-10%——尽管你解剖的是已进行电转染的皮层区域，但只有某一特定层的细胞会被靶向。这种较低的转染效率有助于识别你正在分析的电转染细胞所对应的突起结构。以较高密度接种细胞有助于获得更健康的培养状态，但在此情况下，难以分辨GFP阴性细胞中各个突起结构所属的细胞胞体（图3）。
如果难以观察到电穿孔细胞的所有细微结构，可以增加电穿孔时使用的GFP DNA浓度以增强GFP表达，或者使用抗GFP抗体（来自Invitrogen）对解离的细胞进行免疫染色，并结合Cy2二抗进行检测。
<img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig1.jpg" alt="显示绿色荧光蛋白基因表达的脑切片荧光显微镜图像。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 图1. E15.5天的Sprague-Dawley大鼠通过电穿孔导入GFP质粒，并在三天后处死取材。根据电极放置位置的不同，可靶向大脑皮层的不同区域。A-F显示了完整大脑中的GFP荧光。
<img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig2.jpg" alt="显微镜结果；E15.5 和 E17.5 时期的电穿孔，神经细胞中荧光蛋白表达。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 图 2. E15.5 (A) 或 E17.5 (B) 时期的 Sprague-Dawley 大鼠通过 GFP 质粒进行电穿孔，并在出生后第 5 天取材。脑组织经固定后，使用振动切片机进行冠状面切片（厚度为 100 µm），并用 Oct6 抗体进行免疫染色（红色）。A 和 B 显示了免疫染色切片的共聚焦显微图像。
<img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig3.jpg" alt="神经元网络分析；荧光显微镜图像显示神经元连接及测量结果。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 图3. E15.5天的Sprague-Dawley大鼠通过电穿孔导入GFP质粒。电穿孔后24小时，取出大脑，按照视频中所述方法分离并解离出表达GFP的电穿孔区域组织。体外培养3天后，细胞经固定，并使用bIII-微管蛋白抗体进行免疫染色（红色），细胞核用DAPI染色（蓝色）（A，C）。使用Axiovision软件测量最长神经突的长度（B，D）。

<ol><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E16+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70 (4-5), 155-1562 (2002).</li>
<li>Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+reveals+doublecortin+is+required+for+radial+migration+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex.</a> Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).</li>
<li>Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cells+in+the+developing+nervous+system+with+retrovirus+expressing+modified+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein.</a> Exp Neurol. 156 (2), 394-406 (1999).</li>
<li>Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+DCX+and+LIS1+in+migration+through+the+lateral+cortical+stream+of+developing+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain.</a> Dev Neurosci. , 144-156 (2008).</li>
<li>Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtype+specification+in+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtype specification in the cerebral cortex.</a> Nat Rev Neurosci. , 427-437 (2007).</li>
<li>Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Function+for+-Amyloid+Precursor+Protein+in+Neuronal+Migration+Revealed+by+In+Utero+RNA+Interference%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference.</a> J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).</li>
<li>Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+APP+regulates+the+function+of+full-length+APP+in+neurite+outgrowth+through+interaction+with+integrin+beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Develop%22%5BJournal%5D)">Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1.</a> Neural Develop. 3, 15-15 (2008).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

体外培养原代神经元可用于对神经突生长进行定量分析。为了研究基因改变如何影响神经元突起的生长，可通过化学转染或病毒转导的方式将shRNA或过表达载体导入原代神经元。然而，使用这些方法转染原代皮层细胞时，会同时转染多种类型的细胞（包括来自不同皮层层的谷氨酸能神经元、抑制性神经元以及胶质细胞）。利用在体电穿孔技术将DNA载体导入胚胎啮齿类动物的皮层，可实现对特定细胞亚群的靶向：在胚胎发育早期对皮层进行电穿孔主要靶向皮层深部层次，而在胚胎发育晚期进行电穿孔则主要靶向皮层较浅的层次。此外，通过在单个胚胎头部的不同位置放置电极，可选择性地靶向皮层的背内侧区域或腹外侧区域。
特定层的靶向：
当将DNA注射到侧脑室并进行电穿孔时，只有紧邻侧脑室的细胞会被靶向：这些细胞是新皮层的放射状胶质前体细胞，以及刚刚完成终末有丝分裂的细胞。有趣的是，在电穿孔后的数天内观察发现，被靶向的细胞与出生日期标记的细胞模式相吻合。换句话说，那些“出生”的细胞，即在电穿孔当天完成终末有丝分裂的细胞，正是被靶向的细胞。由于放射状胶质细...

<table><tbody><tr><td>10X Hanks&amp;rsquo; 平衡盐溶液（HBSS）（无 Ca&lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt; /Mg &lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt;）</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>10X Hanks&amp;rsquo; 平衡盐溶液（HBSS）（含 Ca&lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt; /Mg &lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt;）</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES，pH 7.4</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>100 × 15 mm 培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>60 × 15 mm 培养皿</td><td>BD Biosciences</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>62-547-205</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>62-554-205</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>标准镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11273-20</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Reichert Bright-Line 血细胞计数板</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>手持式计数器</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z169021</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良伊格尔培养基（D-MEM）</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11960-051</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>NEUROBASAL 培养基</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 无血清添加剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I 添加剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素试剂溶液</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>驴血清</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>beta-III 微管蛋白抗体</td><td>Chemicon International</td><td>MAB1637</td><td></td></tr><tr><td>MAP2 抗体</td><td>Chemicon International</td><td>AB15452</td><td></td></tr><tr><td>驴源 Cy3 标记抗小鼠抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-166-151</td><td></td></tr><tr><td>驴源 Cy2 标记抗鸡抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-226-155</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>CC2 涂层双室载玻片</td><td>Lab-Tek</td><td>154852</td><td></td></tr><tr><td>荧光封片剂</td><td>KPL Inc</td><td>71-00-16</td><td></td></tr><tr><td>24 × 60 mm 显微盖玻片</td><td>VWR international</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>透明指甲油</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Henry Schein</td><td>4015809TV</td><td></td></tr><tr><td>丁丙诺啡</td><td>Henry Schein</td><td>1118217</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BTX 方波电穿孔仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>BTXECM830</td><td></td></tr><tr><td>Tweezertrodes，7 mm，铂金</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450488</td><td></td></tr></tbody></table>

在子宫内 电穿孔联合原代神经元培养用于研究皮层神经元亚群中的基因功能

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

体外 原代神经元培养的研究可实现对神经突生长的定量分析。为了研究基因改变如何影响神经元突起的生长，可通过化学转染或病毒转导将shRNA或cDNA载体导入原代神经元。然而，使用这些方法转染原代皮层细胞时，会同时转染多种类型的细胞（包括来自不同皮层层次的谷氨酸能神经元、抑制性神经元以及胶质细胞）。因此，采用 在子宫内 电穿孔法将DNA构建体导入胚胎啮齿类动物大脑皮层，可实现对特定细胞亚群的靶向：早期胚胎皮层电穿孔主要靶向皮层深部层次，而晚期胚胎电穿孔则靶向更表浅的皮层层次。此外，通过在单个胚胎头部差异性放置电极，可实现对皮层背内侧区与腹外侧区的选择性靶向。电穿孔后，可将转染细胞分离、解离并接种培养 体外 用于神经突生长的定量分析。本文中，我们提供了一种逐步方法，用于定量测量皮层细胞亚群中神经元突起的生长。
基本实验方案 在子宫内 电穿孔技术已在Kriegstein实验室发表的另外两篇JoVE文章中进行了详细描述 1, 2我们将概述我们的实验方案 在子宫内 电穿孔，重点关注最重要的细节，随后介绍我们应用的方案 在子宫内 电穿孔技术在神经元突起生长过程中基因功能研究中的应用

在子宫内 电穿孔是一种用于转染神经前体细胞的有效方法 体内根据电极的位置和电穿孔的发育时间点，可以选择性地靶向特定的皮层细胞亚群。随后可对这些靶向细胞进行分析 体内 或 体外 用于研究基因修饰的影响。

原代神经元培养的体外研究可对神经突生长进行定量分析。为了研究基因改变如何影响……

以下实验的总体目标是研究在新皮层特定神经前体细胞亚群中基因敲低或过表达的发育效应。该目标通过将DNA体内电穿孔转入大鼠胚胎，以转染新皮层前体细胞来实现。第二步，分离电穿孔区域，以富集转染的细胞。接下来，将这些细胞解离后接种于培养板腔室中进行培养。为了研究内在遗传改变以及外源因子作用的影响，通过使用avision软件进行定量测量，获得了有关神经突生长和分支情况的结果。该技术相较于其他方法（如基于脂质体的原代神经元培养转染）的主要优势在于，我们能够靶向特定的神经前体细胞亚群。例如，使用此方法仅能转染谷氨酸能神经元。此外，我们可以在胚胎发育的较早阶段进行电穿孔，以靶向较早生成的深层神经元；或者在发育的较晚阶段进行电穿孔，以靶向较晚生成、 destined for 皮层更表层的神经元。该方法有助于回答神经发育领域中的关键科学问题。例如，内在因素和外在因素如何相互作用以影响神经突起的生长和分支？尽管该方法可为神经元突起的生长提供见解，但也可应用于其他神经发育过程，如突触形成、细胞增殖和硫酸盐测定。按照随附文本所述制备注射针。避免产生气泡，用表达GFP和目的基因的DNA以及快绿染料回填注射针；为便于观察注射过程，将注射针剩余空间用玉米油填充。将充满液体的注射针连接至皮升注射仪以控制注射。按照先前所述方法，暴露已麻醉的妊娠Sprague Dawley大鼠的子宫角。本视频配套文字中展示了E15胚胎的注射过程。使用鹅颈灯照射胚胎以确定注射位点。轻柔地移动一个胚胎，找到头部位置，并定位中线缝合线。以此作为定位侧脑室的解剖标志。通过子宫壁将DNA注入侧脑室。向脑室内注射多个脉冲，直至侧脑室充满DNA。电极放置所决定的向量对于确定新皮层的哪个区域被电穿孔至关重要。在此方法中，将正极电极置于大脑半球背侧中线附近，以靶向前脑的这一区域。若改变电极的位置，则可靶向皮层的其他区域，包括外侧皮层区域。对每只胚胎进行显微注射并电穿孔。随后将子宫角放回体腔，并缝合切口。在动物从麻醉中恢复期间对其进行密切观察。此处动物在电穿孔后24小时取材用于培养，以确保可检测到GFP。在层流罩中，将安乐死大鼠的胚胎从子宫中取出，并置于含有二价阳离子的冰上预冷的HBSS中。在荧光解剖显微镜下，使用Dumont 5号镊子。分离皮层组织。使用Dumont 3号镊子去除脑膜，打开荧光，用Vannas剪刀剪下GFP阳性组织区域。将这些组织块转移至一个含有冰冷的无双价阳离子 HBSS 的 50 毫升锥形管中。收集所有 GFP 阳性的组织块至管中。移除管中的 HBSS，并加入 1 毫升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 溶液，轻轻颠倒混匀后，于 37 摄氏度培养箱中孵育 5 分钟。吸除胰蛋白酶溶液。根据GFP阳性组织的量，加入一至五毫升的铺板培养基。使用2毫升移液器吹打五到七次，以解离细胞。使用血细胞计数板对细胞进行计数，用铺

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神经科学

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在子宫内电穿孔联合原代神经元培养用于研究皮层神经元亚群中的基因功能

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