在子宫内的电穿孔其次原发性神经文化为研究基因的功能在皮层神经元的一个子集

以下实验的总体目标是检查新皮层神经元祖细胞的特定亚群中基因敲低或过表达的发育影响。这是通过将 DNA 体内电穿孔到大鼠胚胎中以转染新皮质祖细胞来实现的。作为第二步，解剖电穿孔区域以富集转染细胞。

接下来，将这些细胞解离并接种在腔室载玻片中并培养。为了检查内在遗传改变和外源因子应用的影响，根据使用 avision 软件的定量测量，获得的结果显示对神经突生长和分支的影响。与其他技术相比，该技术的主要优势（例如基于脂质的原代神经元培养物转染）是我们可以靶向神经元祖细胞的特定亚群。

例如，使用这种方法只会转染谷氨酸能神经元。此外，我们可以在早期胚胎阶段进行电击祈祷，以早期出生的深层神经元为目标，或者我们可以在发育的后期阶段进行电解质，并以注定要进入皮层更浅层的晚生神经元为目标。这种方法可以帮助回答神经发育领域的关键问题。

例如，内在和外在因素如何相互作用以影响神经生长和分支？虽然这种方法可以深入了解神经元过程的生长，但它也可以应用于其他神经发育过程，例如突触生成、细胞增殖和硫酸盐测定。按照随附文本中的说明准备注射针。

避免气泡用表达 GFP 的 DNA 回填针头，目标基因包括快速绿色为了可视化注射，请在针头中的剩余空间填充玉米油。将 pico spritzer 连接到加载的针头上以控制注射。如前所述，暴露麻醉的怀孕喷雾门鼠的子宫角。

在本视频随附的文本中，显示了 E 15 胚胎的注射。通过用鹅颈灯照亮胚胎来确定注射部位。轻轻作一个胚胎以找到头部的位置并找到中线缝合线。

以此为标志，找到侧脑室。通过子宫壁将 DNA 注射到侧脑室中。将多个脉冲注入心室，直到心室充满 DNA。

由电极位置确定的矢量对于确定新皮层的哪个区域被电穿孔至关重要。在这里，正电极放置在大脑背侧内侧位置附近，以针对前脑的这个区域。电极的交替放置将针对皮层的其他区域，包括外侧皮质流。

注射并电穿孔每个胚胎。反过来，将子宫角放回体腔并关闭切口。监测动物从麻醉中恢复。

在这里，在电穿孔后 24 小时收获动物进行培养，以便可检测到 GFP。从安乐死大鼠的子宫中取出胚胎，并将它们放入装有冰冷的 HBSS 和二价阳离子的培养皿中，在层流罩中。在荧光解剖显微镜下，使用 dumont 5 号镊子。

解剖皮层。使用 dumont 尺寸的三号镊子去除脑膜，使用一把 val 剪刀打开荧光。切掉组织的 GFP 阳性区域。

将这些碎片转移到装满冰冷的 HBSS 的 50 ml 锥形管中，不含二价阳离子。收集管中的所有 GFP 阳性片段。从试管中取出 HBSS，用 1 毫升 0.25% tripsin EDTA 溶液替换，该溶液在 37 摄氏度的倒置培养箱中轻轻混合 5 分钟。

去除 tripsin 溶液。根据 GFP 阳性组织的数量，用 1 到 5 毫升的电镀培养基替换它。使用 2 ml 条纹移液管进食 5 到 7 次以解离细胞。

使用血细胞计数器对细胞进行计数，用铺板培养基稀释至浓度为 2 至 3.5 倍的 10 至 10 个细胞，每 1.5 毫升培养基板在 CC 双涂层室的每个腔室中为 1.5 毫升。滑。将细胞在 37 摄氏度下孵育 4 小时，以使细胞粘附在载玻片上。吸出电镀培养基，每个腔室培养物含有 1.5 mL 神经元培养基。

细胞在 37 摄氏度下达到所需阶段，然后再进行免疫染色。用于测量神经元过程。生长时间培养在 24 小时到 7 天之间变化。

在通风橱中，从每个培养室中吸出培养基。用 4% 甲醛固定细胞 15 分钟。在封闭和免疫之前，用一次 PBS 快速洗涤两次，如随附文本中所述，用荧光封固剂和盖玻片固定培养物。

在荧光显微镜下以 20 x 观察培养物。记录 GFP 阳性神经元的图像以供分析。我们发现，通过这种技术，大约 75% 的电穿孔大脑靶向皮层的所需区域，无论是背侧内侧皮层还是腹侧外侧皮层。

我们发现 E 13 到 14 的早期电穿孔靶向深层神经元，例如 TBR，一个阳性层，六个神经元，而后来的电穿孔靶点 CT IP 两个阳性 TBR，一个阴性层，五个细胞，再后来电穿孔靶点 BRN，两个阳性层 2 个斜线 3 个细胞。在这里，我们显示了在胚胎第 15.5 天或第 17.5 天电穿孔并在出生后第 5 天收获的大脑冠状切片。在培养中，A GFP 阳性的细胞百分比范围很广，具体取决于您在解剖 GFP 阳性区域时的保守程度。

然而，即使我们非常保守，只解剖出 GFP 阳性细胞斑块，我们观察到的最高百分比也是 5% 到 10%这种低转染效率有助于识别哪些过程属于您正在分析的电穿孔细胞。以这种更高的密度铺板细胞有助于获得更健康的培养物。然而，在 GFP 阴性细胞中，很难辨别哪个过程属于哪个细胞体。

在此程序之后，可以对几种不同的标志物进行免疫染色，以回答有关增殖、突触发生和硫酸盐测定的问题。在尝试此程序时，重要的是要记住使用无菌试剂和工具，以防止污染和感染一旦掌握。如果执行得当，该技术的每个方面都可以在两到三个小时内完成。

就是这样。感谢观看。祝你的实验好运。