一种用于研究神经元-胶质细胞相互作用的间接神经元-星形胶质细胞共培养技术

从多孔板开始，该板包含涂有聚-D-赖氨酸的可渗透膜插入物。

星形胶质细胞生长培养基添加到孔中，并将星形胶质细胞（一种特殊的神经胶质细胞）接种到插入物中。

孵育以允许细胞通过静电相互作用粘附在聚-D-赖氨酸上并形成单层。

神经元培养基替换星形胶质细胞培养基。

将该插入片段转移到含有粘附的原代小鼠胚胎神经元的多孔板中，覆盖在聚合物涂层的盖玻片上。

育以建立间接神经元-星形胶质细胞共培养，其中两种细胞类型在物理上分离但共享相同的培养基。

星形胶质细胞分泌神经元存活和生长所必需的各种神经营养因子。

这些因子通过可渗透的支撑迁移并与初级神经元相互作用。这促进了它们的分化并形成神经元投射。

这些投射拉长并在神经元之间建立突触连接，表明神经元-神经胶质相互作用。

每个插入物上涂上每毫升 10 微克的聚-D-赖氨酸，并孵育一小时。一小时后，用PBS洗涤插入物两次。

同时，吸出星形胶质细胞培养基并用10毫升PBS洗涤培养物一次，以确保去除残留血清。接下来，将 3 毫升 0.05% 胰蛋白酶 EDTA 加入烧瓶中，并将细胞孵育以进行胰蛋白酶消化约 10 分钟。然后，将细胞轻轻重悬于 7 毫升星形胶质细胞培养基中。

细胞悬液转移到 15 毫升管中，并以 216 倍 g 离心 5 分钟。然后，小心地吸出上清液并将细胞沉淀重悬于 1 毫升星形胶质细胞培养基中。使用计数室对细胞进行计数。随后，每孔用 500 微升星形胶质细胞培养基填充 24 孔板。吸出PBS并将500微升星形胶质细胞培养基中的25,000个细胞转移到每个单独的插入物中，并在37摄氏度下孵育培养物。

要解剖海马体，请准备三个装有制备培养基的 10 厘米培养皿和一个装有 1 毫升制备培养基的 2 毫升管。从皮质部分解剖海马体，并将它们收集在装满制备培养基的 2 毫升管中。

海马来说，从中枢神经系统的其他区域分离出没有任何相邻组织至关重要。因此，在切除海马体后，必须额外去除外来污染组织。

解剖后，将管子转移到无菌层流台上。小心地取出制备培养基，用1毫升含有木瓜蛋白酶的消化液消化海马组织。消化 15 分钟后，用移液管轻轻抽吸小心地取出消化液。

由于神经元的高灵敏度，小心地研磨海马体以避免气泡并获得最佳研磨强度至关重要。

神经元培养基洗涤海马体三次，每个洗涤周期添加并小心吸出1毫升新鲜培养基。最后一个洗涤步骤后，在1毫升神经元培养基中小心地研磨组织。然后，使用计数室对细胞进行计数。将 35,000 个细胞接种在 24 孔板的每孔 500 微升神经元培养基中，并将神经元在 37 摄氏度下孵育一小时。

现在，将准备好的插入物从培养箱中取出，这些插入物已用汇合的星形胶质细胞单层接种。通过吸出星形胶质细胞培养基并用500微升新鲜神经元培养基代替来交换培养基。

然后，使用无菌镊子小心地将含有星形胶质细胞的插入物放入包含神经元培养物的孔中。随后，将产生的间接神经元星形胶质细胞共培养物放回培养箱中，直到实验。