利用邻近标记蛋白质组学表征神经元溶酶体相互作用组

溶酶体是细胞的垃圾处理系统。溶酶体活动具有高度动态性，极难捕获。在本研究中，我们开发了一种邻近标记蛋白质组学方法，用于解析活体人神经元中溶酶体的微环境。

该方法可捕获溶酶体膜蛋白及其与溶酶体和诱导多能干细胞来源神经元之间的稳定及瞬时相互作用。溶酶体功能障碍与多种脑部疾病密切相关。该技术可用于深入理解各类脑部疾病，并为设计新的治疗方法提供潜在的分子靶点。

开始邻近标记实验时，在显微镜下观察神经元，确保其存活且状态良好。从培养基中取出一半体积的培养液，与生物素苯酚混合后重新加入神经元培养物中，终浓度为500 µM，在37 °C培养箱中孵育30分钟。通过加入新配制的过氧化氢溶液启动标记反应，使其在神经元培养物中的终浓度为1 mM。

孵育1分钟后，吸除培养基，并用淬灭缓冲液冲洗培养物三次。倾斜培养板以吸除所有残留缓冲液。加入预冷的裂解缓冲液后，将细胞裂解物刮入预冷的1.5毫升离心管中。

将离心管置于冰水浴中，以超过100瓦的功率超声处理15分钟，采用40秒开启、20秒关闭的交替循环模式。细胞裂解后，向样品中加入-20摄氏度的冷丙酮，丙酮体积为细胞裂解液体积的4倍。短暂涡旋混匀，随后在-20摄氏度孵育3小时，以沉淀蛋白质并去除残留的生物素苯酚。

在2°C条件下，以16,500 × g离心细胞裂解液管10分钟，小心移除上清液，避免扰动蛋白质沉淀。随后，用1毫升预冷至-20°C的丙酮洗涤沉淀两次，每次均进行离心并去除上清液。接着，使用真空浓缩仪干燥蛋白质沉淀1分钟。

加入细胞裂解缓冲液，通过涡旋或超声处理彻底溶解沉淀。取20微升等分试样，采用DCA法测定总蛋白浓度。将剩余的细胞溶液于-80摄氏度保存。

从-80摄氏度冰箱中取出蛋白裂解液样品，将样品管超声处理30秒以快速解冻。涡旋混匀后，用台式小型离心机短暂离心，并将样品管置于冰上。接下来，将250微升链霉亲和素磁珠悬液转移至每个1.5毫升离心管中。

将这些离心管置于磁力架上静置一分钟，用一毫升 2% 十二烷基硫酸钠溶液洗涤磁珠三次，并去除残留的缓冲液。根据细胞裂解液的总蛋白浓度以及磁珠滴定实验结果，加入计算所需量的蛋白样品，以达到 250 微升链霉亲和素磁珠悬液的用量。然后，向磁珠-裂解液混合物中加入细胞裂解缓冲液，使总体积达到一毫升，并在 4 摄氏度下旋转孵育过夜。

第二天，将样品管在台式微量离心机上短暂离心，然后将管子置于磁力架上一分钟以去除上清液。随后，使用一毫升洗涤缓冲液A，在室温下旋转五分钟后洗涤磁珠两次。接着依次使用缓冲液B、缓冲液C和缓冲液D，在4°C条件下重复上述洗涤步骤，每种缓冲液各洗涤两次。

将离心管置于磁力架上静置一分钟，移除上清液。随后，将磁珠重悬于100微升含5毫摩尔TCEP的50毫摩尔Tris缓冲液中，在37摄氏度的恒温混匀仪中孵育30分钟，接着加入15毫摩尔IAA，避光反应30分钟，再加入5毫摩尔TCEP反应5分钟以淬灭残余的IAA。将样品管在微量离心机中短暂离心，然后置于磁力架上静置一分钟，移除上清液。

加入200微升含5毫摩尔TCEP的50毫摩尔Tris缓冲液以重悬珠子。每样品加入1微克胰蛋白酶/Lys-C混合酶，在1,200 RPM、37摄氏度条件下孵育14小时。14小时后，再加入0.2微克胰蛋白酶/Lys-C混合酶继续孵育3小时，离心样品管，并置于磁力架上静置1分钟。

然后，将肽上清液转移至洁净的离心管中。接着，用50微升含50毫摩尔Tris缓冲液重悬磁珠，振荡洗涤5分钟，合并肽上清液，并向管中加入30微升10%三氟乙酸，将pH值降至3以下。随后进行肽段脱盐和干燥处理。

将肽样品在液相色谱缓冲液中重新悬浮，用于液相色谱-质谱分析。将上清液转移至液相色谱样品瓶中，用于纳米液相色谱-质谱分析。在液相色谱-质谱方法文件中，添加自定义的液相色谱-质谱排除列表，排除特定质荷比和保留时间范围内的高丰度污染物肽峰，例如链霉亲和素、胰蛋白酶和Lys-C。

使用蛋白质组学数据分析软件分析LC-MC原始数据。包含两个FASTA数据库：Swiss-Prot Homo sapiens参考数据库，以及一个新构建的通用污染物FASTA数据库，其中污染物序列的UniProt ID带有污染物前缀。设置数据分析参数，蛋白质和肽段谱图匹配鉴定的错误发现率设为1%。选择胰蛋白酶消化，允许三个漏切位点，半胱氨酸的固定修饰为羧氨甲基化，甲硫氨酸的可变修饰为氧化，蛋白质末端选择乙酰化修饰。

对于无标记定量，将肽段一级质谱峰强度归一化至内源性生物素化的羧化酶 PCCA，以减少邻近标记实验中的变异。从蛋白质组学软件中导出蛋白质水平结果为 Excel 文件。在进行统计分析前，去除污染物蛋白质以及仅有一个肽段谱图匹配（PSM）或无定量结果的蛋白质。

在iPSC神经元分化的不同时间点，细胞形态学图像展示了为期三天分化过程中神经突的生长情况。在转接到聚-L-鸟氨酸包被的培养板并使用神经元培养基培养后，神经突在神经元之间形成网络，且经过两周成熟培养后，轴突延伸更加明显。在荧光成像中，生物素标记蛋白的LAMP1顶点活性通过链霉亲和素染色，并与神经元中LAMP1的染色信号共定位。

磁珠滴定实验的结果表明，随着链霉亲和素磁珠用量的增加，未被捕获的生物素化蛋白信号呈下降趋势。对于来自内源性LAMP1顶点样本的50微克输入蛋白，5微升链霉亲和素磁珠为最佳用量。与单独使用胰蛋白酶相比，使用胰蛋白酶/Lys-C混合酶进行磁珠上消化可获得更多的蛋白质和肽段鉴定结果，且漏切位点更少。

此外，发现使用 1 至 1.5 微克的胰蛋白酶/Lys-C 进行磁珠上消化效果最佳，可鉴定出最多数量的蛋白质，并使漏切位点百分比最低。与无顶点对照相比，LAMP1 顶点中的已知溶酶体膜蛋白有所增加。内源性生物素化蛋白质丰度较高，但其水平保持不变。

GO术语和蛋白质网络分析表明，LAMP1顶端蛋白质组学中富集了稳定的溶酶体膜蛋白以及与内溶酶体运输和转运相关的瞬时溶酶体相互作用蛋白。顶端邻近标记必须在精确达到一分钟时淬灭，以减少氧化应激和实验变异。我们近期开发了一种可切割的生物素方法，使我们能够富集生物素标记的蛋白质。

将该方法与我们现有的方法结合使用，可减少链霉亲和素及内源性生物素化蛋白带来的干扰。我们可将此方法应用于携带导致脑部疾病遗传变异的野生型和突变型神经元。这有助于我们理解基因突变如何以及为何影响人类神经元中溶酶体的微环境。