体内研究基于 TurboID 的邻近标记在黑腹果蝇中的应用

在这项研究中，基于 TurboID 的邻近标记用于绘制果蝇卵巢生殖系细胞中西葫芦蛋白的相互作用。确定了西葫芦的已知和新颖相互作用者。值得注意的是，发现几种新的相互作用物参与蛋白质折叠、膜组织和物理运输。在这项研究中，TurboID用于在动物组织中进行有效标记，同时控制背景生物素化。通过优化对照和胰蛋白酶消化后富集生物素化肽，可以增强标记特异性和蛋白质覆盖率。这种方法能够对蛋白质相互作用进行系统筛选，以揭示目标蛋白质的功能和分子机制。

[旁白]首先，将一勺实验室勺子通过将酵母粉溶解在三重蒸馏水中制备的光滑酵母糊涂在小瓶壁上。取另一个装有新孵化苍蝇的小瓶，轻轻敲击它以收集底部的苍蝇。将这个小瓶倒置到装有酵母糊的小瓶上，并对齐边缘以防止苍蝇逃逸。将两个小瓶一起敲击，将苍蝇转移到装有糊状物的小瓶底部。转移完成后，将棉帽牢固地放在两个小瓶上并等待三天。第三天，通过在三重蒸馏水中稀释一摩尔生物素储备液，制备100微摩尔生物素工作溶液。向溶液中加入 500 微升 0.5% 丙酸。将生物素溶液与干酵母粉混合并搅拌成糊状。将一勺实验室勺生物素酵母糊添加到生物素食品瓶的壁上。将苍蝇分成两组。将一组转移到装有正常食物的小瓶中作为对照。将另一组转移到补充有生物素酵母糊的生物素食品瓶中，以开始生物素兴奋。16 小时后，将苍蝇转移到装有正常食物的新小瓶中。对于果蝇卵巢采集，将一毫升冷的格蕾丝昆虫培养基移液到解剖培养皿上。使用细尖镊子，将雌性苍蝇放入解剖盘中并将其浸入培养基中。用一对镊子握住胸部，不要压碎身体。使用另一把镊子轻轻取出生殖器所在的后腹部尖端。用镊子慢慢挤出卵巢，从上腹部开始向下移动。去除肌肉网和周围组织，而不会损坏卵巢。使用镊子将干净的卵巢转移到 1.7 毫升的管子中，并将管子放在冰上。对于组织裂解，将500微升2%十二烷基硫酸钠加入补充有蛋白酶抑制剂混合物的尝试缓冲盐水中，加入含有卵巢的管中。等到细胞裂解并且溶液变得粘稠。使用屏幕上显示的条件进行超声处理。接下来，为了丙酮沉淀，将裂解物转移到五毫升低结合管中。将冷丙酮以样品体积的六倍加入管中。短暂涡旋管，然后将其加载到多旋转器中，并在零下 20 摄氏度下孵育过夜约 16 小时。通过在 4 摄氏度下以 15,000 G 离心 15 分钟来沉淀沉淀的蛋白质。现在，加入两毫升由 90% 冷丙酮和 10% 尝试缓冲盐水组成的混合溶液。通过上下移液混合沉淀和溶液。短暂涡旋管，然后再次将其加载到多旋转器中并在零下 20 摄氏度下孵育两个小时。通过在 4 摄氏度下以 15,000 G 离心 15 分钟来沉淀沉淀的蛋白质。丢弃上清液后，在四摄氏度下进行旋转。然后，打开管子，让沉淀风干 10 分钟。将蛋白质沉淀重新悬浮在 500 微升八摩尔尿素中。将溶液转移到含有自适应聚焦声学或 AFA 光纤的一毫升大小的毫管中。在进行二辛可宁酸或 BCASA 之前，使用前面显示的相同参数对试管进行超声处理，以确定蛋白质浓度。使用设置为 450 RPM 的热块在 37 摄氏度下使蛋白质变性一小时。将溶解在三重蒸馏水中的 5 微升一摩尔二硫苏糖醇加入管中，以达到 10 毫摩尔的终浓度。将试管再次放在 37 摄氏度的热块上一小时以减少蛋白质。现在将 55 微升 400 毫摩尔碘乙酰胺溶液加入样品管中，以达到 40 毫摩尔的终浓度，然后将试管放回热块中进行烷基化。 通过加入 50 毫摩尔碳酸氢铵溶液稀释样品，直至总体积达到 4 毫升。将四微升一摩尔氯化钙储备溶液加入管中，以达到一毫摩尔的终浓度。上下移液以均质溶液。接下来，向试管中加入 150 微升每毫升 1 毫克胰蛋白酶储备溶液，保持胰蛋白酶与样品的比例为 1 比 20。使用设置为 450 RPM 的热块在 37 摄氏度下消化蛋白质 16 小时。用一毫升两摩尔尿素在尝试缓冲盐水中洗涤每三毫克样品 150 微升链霉亲和素偶联磁珠。将一毫升消化的肽移液到装有珠子的管中并轻轻混合。将混合物与剩余的肽样品混合在五毫升低结合管中。孵育一小时后，将一毫升混合物转移到1.5毫升管中，并将其放在磁架上一分钟。用一毫升两摩尔尿素在50毫摩尔碳酸氢铵中洗涤珠子两次，用一毫升三蒸馏水洗涤一次，然后将试管放回磁架上再放置一分钟并丢弃缓冲液。接下来，将 100 微升 elucian 缓冲液移液到含有珠子的管中，轻轻混合，并使用设置为 300 RPM 的热块在 60 摄氏度下洗脱肽 5 分钟，然后再次将管放在磁架上。现在将洗脱液转移到新的 1.5 毫升管中，避免任何珠子。洗脱后的样品现在可以干燥并用于质谱分析。该图展示了西葫芦 V5 TurboID 的共聚焦成像和蛋白质组学相互作用分析，以识别近端和相互作用的蛋白质。共聚焦图像显示，生物素喂养处理后转基因和近端蛋白之间存在强烈重叠的表达，分别被 V5 抗体和链霉亲和素偶联的 Alexa Fluer 594 捕获。西葫芦 V5 TurboID 蛋白质组的基因本体分析揭示了富集的生物素化蛋白，参与伴侣介导的蛋白质折叠、内膜系统的组织以及从内质网到 GGI 装置的转运调节。