伯氏疏螺旋体（Borrelia）伯氏疏螺旋体外转录测定的基本成分

伯氏疏螺旋体的体外转录测定系统为研究人员研究控制RNA聚合酶酶活性的基因调控机制和因子提供了一种生化工具。该系统使我们能够测试转录因子、辅助因子、盐浓度和pH值如何影响伯氏疏螺旋体RNA聚合酶功能，这有助于我们全面了解基因调控机制。这种强大的技术还可以让我们筛选选择性抑制RNA聚合酶的药物，为开发治疗莱姆疏螺旋体病的新药打开大门。

首先，从两到四升伯氏疏螺旋体RpoC-His10X中收集细胞沉淀，该细胞沉淀在微需氧环境中培养在BSKII培养基中，密度为每毫升2至4倍10常数。在500毫升离心瓶中以10，000倍G在4摄氏度下沉淀细胞30分钟，并弃去上清液。然后，将细胞重悬于30毫升冰冷的HN缓冲液中，重复离心步骤，并倒出上清液。

工作时，将细胞、裂解物和纯化的蛋白质保持在 4 摄氏度或冰上，除非冷冻。通过向所使用的每个缓冲液中加入浓度为2毫摩尔的新鲜制备的二硫苏糖醇，将RNA聚合酶保持在还原环境中，并保持pH值8.0。使用商业细菌裂解试剂盒从伯氏疏螺旋体细胞沉淀中制备裂解物。

将沉淀重悬于10至15毫升不含蛋白酶抑制剂的B-PER溶液中，并在冰上进行裂解五分钟。向裂解溶液中加入蛋白酶抑制剂混合物，并进行三轮超声处理。现在通过使用50毫升离心管离心和过滤来澄清细胞裂解物。

向溶液中加入钴柱上样缓冲液，使总体积达到30毫升。通过以20， 000倍G离心30分钟来沉淀细胞碎片。之后，使用0.45微米注射器过滤器过滤上清液，并将裂解物和钴柱上样缓冲液稀释至最终稀释比例为1:10。

按照制造商的说明，使用钴或镍树脂柱对澄清的细胞裂解物上清液进行亲和色谱。保存流通、洗涤和洗脱样品进行分析。按照制造商的说明，立即使用缓冲液交换柱将RNA聚合酶溶液缓冲溶液与储存缓冲溶液交换。

然后，使用10千道尔顿截止离心过滤装置将RNA聚合酶浓缩至0.2至0.4毫克/毫升的浓度。通过分光光度计确定浓度并制备冷冻储备液。将 20 至 50 微升体积的 RNA 聚合酶等分装在 PCR 管中冷冻原液，并将 RNA 聚合酶储存在零下 80 摄氏度。

准备工作表面，包括辐射工作台，以减少辐射污染。在冰上解冻新鲜的RNA聚合酶和RpoD储备液，并在移液前彻底混合所有解冻的冷冻储液根据实验要求在单独的NTP混合物中制备用于放射性标记核苷酸的主反应混合物。将实验组中的对照反应分配到PCR管中。

将水、反应混合物、RNA 聚合酶和 RpoD 分配到指定的 PCR 管中后，通过移液混合试剂。将制备的材料转移到辐射工作台上，将α-32P标记的ATP加入NTP中，并通过轻轻移液混合。将NTP添加到含有体外转录反应混合物的试管中，并通过添加DNA模板开始体外转录反应。

通过轻轻移液混合反应体积，并将试管在37摄氏度下在热循环仪或加热块中孵育五分钟。从热循环仪或加热块中取出反应，并通过向反应混合物中加入等体积含有50%甲酰胺的2X RNA上样染料来停止体外转录反应。通过在65摄氏度下在热循环仪或加热块中孵育反应五分钟来使酶变性。

使用凝胶电泳，在180伏的10%至15%TBE尿素聚丙烯酰胺凝胶中分离体外转录的RNA，持续30至45分钟。去除含有未掺入放射性标记ATP的凝胶的任何部分后，将凝胶暴露于磷酸化筛选过夜，并使用磷酸化屏幕成像仪对放射性标记的RNA进行成像。SDS-PAGE显示对应于RNA聚合酶复合物的三种肽RpoC，RpoB和RpoA的三个条带。

还观察到与MBP标记的重组伯氏疏螺旋体RpoD的大小相匹配的115千道尔顿肽。蛋白质混合物与因子XA蛋白酶的切割导致产生两种重要产物RpoD和MBP。伯氏疏螺旋体FLGB的启动子位点由PCR生成。

RpoD浓度的两倍稀释导致累积的RNA产物水平降低。低RNA聚合酶浓度在RpoD浓度范围内产生的RNA产物较少。密度测量信号表明，在两个实验中，反应中存在的RpoD量之间存在线性关系。

RNA聚合酶的酶活性在纯化、储存和实验过程中对多种因素都很敏感。新鲜的酶和试剂，以及良好的计划，为该方案提供了最大的成功机会。