Name: 伯氏疏螺旋体（Borrelia）伯氏疏螺旋体外转录测定的基本成分 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-22T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: 学习伯氏疏螺旋体体外转录测定技术，通过纯化RNA聚合酶和分析转录因子，研究基因调控机制。该方法为莱姆病药物筛选提供重要工具，助力微生物学与基因调控研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本研究由克瑞顿大学健康科学战略投资基金教师发展资助项目支持。B. burgdorferi RpoC-His10X 菌株由蒙大拿大学 D. Scott Samuels 博士惠赠。携带编码麦芽糖结合蛋白标记的 rpoD 等位基因的 pMAL-C5X 质粒的大肠杆菌（E. coli）菌株由美国国立卫生研究院（NIH）下属国家过敏与传染病研究所（NIAID）落基山实验室 Frank Gherardini 博士惠赠。

1. RNA聚合酶的纯化及RNA聚合酶储备液的制备
<ol>
	<li>根据先前描述的细胞收集方案28,29，从2-4 L在微需氧环境（34 °C，5% CO2，3% O2）中培养至密度为2-4 × 107 cells/mL的B. burgdorferi RpoC-His10X（BSKII培养基）中收集细胞沉淀。使用500 mL离心瓶在4 °C下以10,000 × g离心30分钟，并倾去上清液。</li>
	<li>将细胞重悬于30 mL预冷的HN缓冲液（10 mM HEPES，10 mM NaCl，pH 8.0）中。使用50 mL离心管重复上述离心步骤，并倾去上清液。 
	注意：此为可暂停步骤。可将细胞沉淀在−80 °C冷冻保存，最长可保存2周，或立即进行细胞裂解。</li>
	<li>除非进行冷冻，否则将细胞、裂解液和纯化蛋白保持在4 °C或冰上。通过在本方案所用的每种缓冲液中添加新鲜配制的DTT（终浓度为2 mM），使RNA聚合酶处于还原环境中，并维持pH 8.0。</li>
	<li>按照商品化细菌裂解试剂盒说明书，使用该试剂盒从B. burgdorferi细胞沉淀中制备裂解液。将沉淀重悬于10-15 mL室温（RT）B-PER溶液中（不含蛋白酶抑制剂），并在冰上裂解5分钟。裂解体积应根据细胞沉淀大小，参照试剂盒说明书确定。</li>
	<li>向裂解液中加入蛋白酶抑制剂混合物，随后进行三轮超声处理，具体操作见代表性结果部分。 
	注意：也可选择使用高压破碎仪（French pressure cell）裂解细胞，方法如前所述24。此时跳过步骤1.4和步骤1.5。</li>
	<li>使用50 mL离心管通过离心和过滤澄清细胞裂解液。向溶液中加入钴柱上样缓冲液（表1），使总体积至少达到30 mL。在20,000 × g下离心30分钟，沉淀细胞碎片。</li>
	<li>使用0.45 µm针头滤器过滤上清液。</li>
	<li>用钴柱上样缓冲液（表1）对裂解液进行1:10的最终稀释比例稀释。</li>
	<li>按照制造商说明书，使用钴柱或镍柱对澄清后的细胞裂解液上清液进行亲和层析。代表性结果部分提供了示例。使用表1中列出的缓冲液。收集穿流液、洗涤液和洗脱液样品用于分析。</li>
	<li>立即使用缓冲液置换柱，按照制造商说明书将洗脱液中的RNA聚合酶置换至RNA聚合酶储存缓冲液（表1）中。</li>
	<li>使用10 kDa截留分子量的离心过滤装置浓缩RNA聚合酶，通过分光光度法测定浓度（A280nm，不校正消光系数[1 Abs在1 cm光程下 = 1 mg·mL−1]），调整至0.2-0.4 mg/mL，制备冻存样品。</li>
	<li>将RNA聚合酶冻存液分装至PCR管中，每管20-50 µL，于−80 °C保存。</li>
	<li>通过SDS-PAGE评估亲和层析纯化质量，并通过分光光度法或BCA法测定总蛋白得率。为获得良好的SDS-PAGE分辨率，以120 V电压在7.5%聚丙烯酰胺凝胶上电泳50分钟。</li>
</ol>
2. 重组RpoD的纯化及RpoD储备液的制备
<ol>
	<li>培养并诱导表达麦芽糖结合蛋白标签重组蛋白 B. burgdorferi BL21::MBP-RpoD 中的 RpoD (MBP-RpoD)Bb，如所列蛋白质融合与纯化系统说明书所述 材料表，通过离心收集细胞。 
	注意：此为暂停点。将细胞沉淀在 −80 °C 冻存，可保存细胞长达 2 周，或立即进行细胞裂解。</li>
	<li>使用商用细菌细胞裂解试剂盒或法式加压细胞破碎仪进行裂解。参见示例裂解缓冲液 表1.</li>
	<li>通过离心和过滤澄清细胞裂解液。通过在 20,000 x g 条件下离心沉淀细胞碎片。 g 30分钟。使用0.45 µm滤器过滤上清液。</li>
	<li>使用适用于表达系统的蛋白质提取方案提取MBP-RpoD。示例实施细节及结果参见代表性结果部分。</li>
	<li>通过 SDS-PAGE 确定亲和层析过程及洗脱的质量，并通过分光光度法（A280 nm 无需消光系数校正 [1 吸光度在 1 cm 光程 = 1 mg·mL⁻¹]−1使用10%聚丙烯酰胺凝胶，在200 V电压下电泳30分钟进行SDS-PAGE分离。</li>
	<li>使用10 kDa截留分子量的离心过滤器将MBP-RpoD浓缩至指定浓度 &#62;2 mg/mL（通过分光光度法测定）</li>
	<li>在Factor Xa切割位点将MBP从RpoD上切割下来。加入CaCl₂。2 向含有浓度为 2 mM 的 MBP-RpoD 的亲和层析洗脱组分中加入每 30 mg 纯化蛋白 200 µg 的 Xa 因子蛋白酶。在室温下孵育过夜。</li>
	<li>通过SDS-PAGE确认MBP从RpoD的完全切割。SDS-PAGE分离时使用10%聚丙烯酰胺凝胶，200 V电泳30分钟。</li>
	<li>用肝素结合缓冲液以1:10的比例稀释含有MBP和RpoD的溶液。</li>
	<li>通过FPLC在肝素柱上分离MBP和RpoD。参见 表2 用于FPLC设置。</li>
	<li>通过 SDS-PAGE 分析亲和层析产物的质量，并通过分光光度法测定蛋白质得率。SDS-PAGE 分离时使用 10% 聚丙烯酰胺凝胶，200 V 电压下电泳 30 分钟。</li>
	<li>使用截留分子量为10 kDa的离心过滤器将含有RpoD的洗脱组分浓缩至终体积为2–3 mL。</li>
	<li>使用凝胶过滤柱将浓缩的RpoD洗脱组分置换至储存缓冲液中。</li>
	<li>使用10 kDa截留分子量的离心过滤器浓缩RpoD储备液，通过分光光度法测定浓度至0.2–0.8 mg/mL。</li>
	<li>将RpoD储存液分装至PCR管中，每管20-50 µL，于−80 °C保存。</li>
</ol>
3. DNA模板储备液的制备
<ol>
	<li>使用200 µL反应体系（表3），从 B. burgdorferi 基因组DNA中PCR扩增RpoD驱动启动子位点周围500 bp的区域。</li>
	<li>使用商品化的PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物，用分子生物学级H2O洗脱DNA。</li>
	<li>将PCR扩增得到的DNA模板用分子生物学级H2O稀释，调整其摩尔浓度至100 nM。</li>
</ol>
4. 执行 体外 掺入放射性标记核苷酸的转录
<ol>
	<li>制备一种 体外 转录实验方案。确定RNA聚合酶、RpoD和DNA模板的浓度。确定反应管中各组分的分装体积及加样顺序。参见 表4 和 图1 例如。 
	注意：在实验设计中应包含对照组，例如不加RNA聚合酶的反应、使用替代聚合酶的反应、无模板的反应或使用替代模板的反应。</li>
	<li>计算α-的体积32实验所需P-ATP。将其纳入实验方案中。通常每份加入2 µCi的放射活性 体外 用于磷屏检测的转录反应。</li>
	<li>准备操作台面，包括辐射工作台，以降低辐射污染风险。</li>
	<li>在冰上解冻RNA聚合酶、Rpo、5x缓冲液NTP和模板储备液的新鲜分装样品。移液前充分混匀所有已解冻的储备液。</li>
	<li>根据实验方案，配制主反应混合液以及用于放射性标记核苷酸的独立NTP混合液。</li>
	<li>将对照反应和实验组分装至PCR管中，以准备在反应中加入放射性标记。轻柔地分装H2将反应主混合液、RNA聚合酶和RpoD加入指定的PCR管中，用移液器混匀。</li>
	<li>将准备好的材料转移至辐射工作台。</li>
	<li>加入α-32将P-ATP转换为NTP，并通过轻柔吹打混匀。 
	警告：操作放射性物质时，应使用适用于放射性同位素的适当防护设备和操作规程。</li>
	<li>向含有模板的试管中加入 NTP 体外 第4.6步的转录反应混合物</li>
	<li>开始 体外 加入DNA模板进行转录反应。通过轻柔吹打混匀反应体系。</li>
	<li>将试管置于37 °C的PCR仪或加热块中孵育5分钟。</li>
	<li>从PCR仪或加热块中取出反应体系，加入等体积的含50%甲酰胺的2×RNA上样染料以终止反应 体外 转录反应。</li>
	<li>通过在热循环仪或加热块中于 65 °C 孵育 5 分钟使酶变性。</li>
	<li>分离RNA中的 体外 使用10%-15% TBE尿素聚丙烯酰胺凝胶，在180 V条件下电泳30-45分钟，通过凝胶电泳分析转录反应混合物。 
	注意：根据凝胶电泳条件的不同，缓冲液可能被放射性标记的核苷酸污染，或凝胶中可能含有大部分或全部放射性标记的核苷酸。应妥善规划放射性物质的储存或处置。</li>
	<li>使用磷屏成像放射性标记的RNA，在成像前去除凝胶中含未掺入放射性标记ATP的部分。将凝胶暴露于磷屏过夜（16 h），然后使用磷屏成像仪（分辨率100 µm，PMT管电压700 V）进行成像。</li>
	<li>使用密度测定法分析数据24.</li>
</ol>

<ol><li>Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics of Borrelia burgdorferi.</a> Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).</li>
<li>Kingry, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveillance+for+and+discovery+of+Borrelia+Species+in+US+patients+suspected+of+tickborne+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Surveillance for and discovery of Borrelia Species in US patients suspected of tickborne illness.</a> Clinical Infectious Diseases. 66 (12), 1864-1871 (2018).</li>
<li>Cutler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relapsing+fever+Borreliae%3A+A+global+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Relapsing fever Borreliae: A global review.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 35 (4), 847-865 (2015).</li>
<li>Barbour, A. G., Hayes, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+Borrelia+species%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biology of Borrelia species.</a> Microbiological Reviews. 50 (4), 381-400 (1986).</li>
<li>Tilly, K., Rosa, P. A., Stewart, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+infection+with+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Infectious+Disease+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Biology of infection with Borrelia burgdorferi.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 217-234 (2008).</li>
<li>Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+ticks%2C+mice+and+men%3A+understanding+the+dual-host+lifestyle+of+Lyme+disease+spirochaetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).</li>
<li>Caimano, M. J., Drecktrah, D., Kung, F., Samuels, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+the+Lyme+disease+spirochete+with+its+tick+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interaction of the Lyme disease spirochete with its tick vector.</a> Cellular Microbiology. 18 (7), 919-927 (2016).</li>
<li>Dulebohn, D. P., Richards, C. L., Su, H., Lawrence, K. A., Gherardini, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Weak+organic+acids+decrease+Borrelia+burgdorferi+cytoplasmic+pH%2C+eliciting+an+acid+stress+response+and+impacting+RpoN-+and+RpoS-dependent+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Weak organic acids decrease Borrelia burgdorferi cytoplasmic pH, eliciting an acid stress response and impacting RpoN- and RpoS-dependent gene expression.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1734(2017).</li>
<li>Bontemps-Gallo, S., Lawrence, K., Gherardini, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+different+virulence-related+regulatory+pathways+in+Borrelia+burgdorferi+are+directly+affected+by+osmotic+fluxes+in+the+blood+meal+of+feeding+ixodes+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Two different virulence-related regulatory pathways in Borrelia burgdorferi are directly affected by osmotic fluxes in the blood meal of feeding ixodes ticks.</a> PLoS Pathogens. 12 (8), 1005791(2016).</li>
<li>Bugrysheva, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+RelBbu+Regulon+in+Borrelia+burgdorferi+reveals+modulation+of+glycerol+metabolism+by+%28p%29ppGpp%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of the RelBbu Regulon in Borrelia burgdorferi reveals modulation of glycerol metabolism by (p)ppGpp.</a> PLoS One. 10 (2), 0118063(2015).</li>
<li>Carroll, J. A., Garon, C. F., Schwan, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+environmental+pH+on+membrane+proteins+in+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Effects of environmental pH on membrane proteins in Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 67 (7), 3181-3187 (1999).</li>
<li>Drecktrah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Borrelia+burgdorferi+RelA%2FSpoT+homolog+and+stringent+response+regulate+survival+in+the+tick+vector+and+global+gene+expression+during+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The Borrelia burgdorferi RelA/SpoT homolog and stringent response regulate survival in the tick vector and global gene expression during starvation.</a> PLoS Pathogens. 11 (9), 1005160(2015).</li>
<li>Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Borrelia+burgdorferi+alters+its+gene+expression+and+antigenic+profile+in+response+to+CO2+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels.</a> Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).</li>
<li>Lin, Y. H., Chen, Y., Smith, T. C., Karna, S. L. R., Seshu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-chain+fatty+acids+alter+metabolic+and+virulence+attributes+of+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Short-chain fatty acids alter metabolic and virulence attributes of Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 86 (9), 00217-00218 (2018).</li>
<li>Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissolved+oxygen+levels+alter+gene+expression+and+antigen+profiles+in+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).</li>
<li>Stevenson, B., Schwan, T. G., Rosa, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-related+differential+expression+of+antigens+in+the+Lyme+disease+spirochete%2C+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Temperature-related differential expression of antigens in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 63 (11), 4535-4539 (1995).</li>
<li>Troxell, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese+and+zinc+regulate+virulence+determinants+in+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Manganese and zinc regulate virulence determinants in Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 81 (8), 2743-2752 (2013).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interdependence+of+environmental+factors+influencing+reciprocal+patterns+of+gene+expression+in+virulent+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interdependence of environmental factors influencing reciprocal patterns of gene expression in virulent Borrelia burgdorferi.</a> Molecular Microbiology. 37 (6), 1470-1479 (2000).</li>
<li>Samuels, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+and+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Issues+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene regulation and transcriptomics.</a> Current Issues in Molecular Biology. 42, 223-266 (2021).</li>
<li>Fraser, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+sequence+of+a+Lyme+disease+spirochaete%2C+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi.</a> Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).</li>
<li>Iyer, R., Schwartz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+comparative+genomic+and+transcriptome+analysis+of+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays%22%5BJournal%5D)">Microarray-based comparative genomic and transcriptome analysis of Borrelia burgdorferi.</a> Microarrays. 5 (2), 9(2016).</li>
<li>Iyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+global+alterations+in+the+transcriptomes+of+Lyme+disease+spirochetes+during+tick+feeding+and+following+mammalian+host+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Stage-specific global alterations in the transcriptomes of Lyme disease spirochetes during tick feeding and following mammalian host adaptation.</a> Molecular Microbiology. 95 (3), 509-538 (2015).</li>
<li>Boyle, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DksA-dependent+regulation+of+RpoS+contributes+to+Borrelia+burgdorferi+tick-borne+transmission+and+mammalian+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">DksA-dependent regulation of RpoS contributes to Borrelia burgdorferi tick-borne transmission and mammalian infectivity.</a> PLoS Pathogen. 17 (2), 1009072(2021).</li>
<li>Boyle, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+in+vitro+RNA+polymerase+transcription+system%3A+a+new+tool+to+study+transcriptional+activation+in+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Establishment of an in vitro RNA polymerase transcription system: a new tool to study transcriptional activation in Borrelia burgdorferi.</a> Scientific Reports. 10 (1), 8246(2020).</li>
<li>Silar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+in+vitro+transcription+system+for+analysis+of+Corynebacterium+glutamicum+promoters+recognized+by+two+sigma+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of in vitro transcription system for analysis of Corynebacterium glutamicum promoters recognized by two sigma factors.</a> Current Microbiology. 73 (3), 401-408 (2016).</li>
<li>Maciag, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+transcription+profiling+of+the+sigmaS+subunit+of+bacterial+RNA+polymerase%3A+re-definition+of+the+sigmaS+regulon+and+identification+of+sigmaS-specific+promoter+sequence+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro transcription profiling of the sigmaS subunit of bacterial RNA polymerase: re-definition of the sigmaS regulon and identification of sigmaS-specific promoter sequence elements.</a> Nucleic Acids Research. 39 (13), 5338-5355 (2011).</li>
<li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRENDA%2C+the+ELIXIR+core+data+resource+in+2021%3A+New+developments+and+updates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">BRENDA, the ELIXIR core data resource in 2021: New developments and updates.</a> Nucleic Acids Research. 49, 498-508 (2021).</li>
<li>Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+and+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation and complementation.</a> Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).</li>
<li>Hyde, J. A., Weening, E. H., Skare, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Borrelia burgdorferi.</a> Current Protocols in Microbiology. 20, 1-17 (2011).</li>
<li>Ge, Y., Old, I. G., Saint Girons, I., Charon, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+a+large+Borrelia+burgdorferi+motility+operon+which+is+initiated+by+a+consensus+sigma70+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of a large Borrelia burgdorferi motility operon which is initiated by a consensus sigma70 promoter.</a> Journal of Bacteriology. 179 (7), 2289-2299 (1997).</li>
<li>Ozaki, M., Wada, A., Fujita, N., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+phase-dependent+modification+of+RNA+polymerase+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Growth phase-dependent modification of RNA polymerase in Escherichia coli.</a> Molecular Genetics and Genomics. 230 (1-2), 17-23 (1991).</li>
<li>Jasinski, D. L., Schwartz, C. T., Haque, F., Guo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+purification+of+RNA+nanoparticles+by+preparative+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Large scale purification of RNA nanoparticles by preparative ultracentrifugation.</a> Methods in Molecular Biology. 1297, 67-82 (2015).</li>
<li>Gierl, A., Zillig, W., Stetter, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+components+sigma+and+y+of+the+DNA-dependent+RNA+polymerase+of+Lactobacillus+curvatus+in+promotor+selection%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The role of the components sigma and y of the DNA-dependent RNA polymerase of Lactobacillus curvatus in promotor selection.</a> European Journal of Biochemistry. 125 (1), 41-47 (1982).</li>
<li>Stetter, K. O., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+in+lactobacillaceae.+DNA-dependent+RNA+polymerase+from+Lactobacillus+curvatus%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Transcription in lactobacillaceae. DNA-dependent RNA polymerase from Lactobacillus curvatus.</a> European Journal of Biochemistry. 48 (2), 527-540 (1974).</li>
<li>Borbley, G., Schneider, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Cyanobacteria.</a> Methods in Enzymology. 167, 3(1988).</li>
<li>Svetlov, V., Artsimovitch, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+bacterial+RNA+polymerase%3A+Tools+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Purification of bacterial RNA polymerase: Tools and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1276, 13-29 (2015).</li>
<li>Shimada, T., Yamazaki, Y., Tanaka, K., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+whole+set+of+constitutive+promoters+recognized+by+RNA+polymerase+RpoD+holoenzyme+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The whole set of constitutive promoters recognized by RNA polymerase RpoD holoenzyme of Escherichia coli.</a> PLoS One. 9 (3), 90447(2014).</li>
<li>Daubendiek, S. L., Ryan, K., Kool, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rolling-circle+RNA+synthesis%3A+Circular+oligonucleotides+as+efficient+substrates+for+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Rolling-circle RNA synthesis: Circular oligonucleotides as efficient substrates for T7 RNA polymerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 117 (29), 7818-7819 (1995).</li>
<li>Marras, S. A., Gold, B., Kramer, F. R., Smith, I., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurement+of+in+vitro+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Real-time measurement of in vitro transcription.</a> Nucleic Acids Research. 32 (9), 72(2004).</li>
<li>Chamberlin, M. J., Nierman, W. C., Wiggs, J., Neff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+assay+for+bacterial+RNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A quantitative assay for bacterial RNA polymerases.</a> Journal of Biological Chemistry. 254 (20), 10061-10069 (1979).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

体外转录实验通过本方案构建后，最近已被用于研究转录因子在 B. burgdorferi 中的作用，并可推广应用至其他转录因子、σ因子及分子的类似实验23。一旦获得具有活性的 B. burgdorferi RNA 聚合酶并检测到其活性，即可对体外转录实验中的组分和条件进行调整。该实验具有高度灵活性和可修改性。反应体系采用模块化设计，由冷冻储备液配制而成，选定实验参数后所需准备时间极短。若有充足的试剂储备，可在一天内完成多个实验。
获得有活性的RNA聚合酶是最重要的环节 体外 转录反应的制备。我们建议按照本方案所述，从处于对数生长中期的细胞中收获RNA聚合酶。在从任何细菌中纯化RNA聚合酶时，生长速率已被证明是影响活性RNA聚合酶纯化效果的重要因素。在生长停滞期，RNA聚合酶可能发生翻译后修饰，并可能与抑制性转录因子结合31我们尚未成功从 B. burgdorferi 对数期培养物。与...

莱姆病和回归热由Borrelia和Borreliella属的螺旋体病原体引起1,2,3。莱姆病是北美地区一种重要的虫媒传染病，因此Borreliella burgdorferi成为研究螺旋体生物学的重要模式生物4,5。对B. burgdorferi转录调控机制的研究旨在更深入地理解其在蜱媒介与哺乳动物宿主之间循环时，对环境变化所作出的适应性反应6,7。pH、温度、渗透压、营养物质可利用性、短链脂肪酸、有机酸以及溶解氧和二氧化碳水平的变化，均可调节一系列基因的表达，这些基因对B. burgdorferi在节肢动物媒介中存活以及感染动物至关重要8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18。将这些应答反应与相应的调控机制相联系，一直是B. burgdorferi研究的重要方向19。
转录因子和σ因子调控执行细胞过程的基因的转录。莱姆病和回归热螺旋体含有相对较少的转录因子和替代σ因子。尽管如此，B. burgdorferi 在应对环境变化时仍存在复杂的转录调控变化20,21,22。然而，B. burgdorferi 在响应环境变化时驱动转录变化的具体机制仍不明确。体外转录实验是采用生物化学方法研究转录因子和σ因子功能及其调控机制的有力工具23,24,25,26。
最近建立了一种使用 B. burgdorferi RNA 聚合酶的 体外 转录检测体系24。由于细菌通常具有独特的细胞生理特性，不同物种和属的RNA聚合酶对酶纯化、酶储存以及反应缓冲液条件的响应各不相同27。B. burgdorferi 在遗传上也与许多已研究过RNA聚合酶的细菌物种相距较远20。酶制备过程中的多个因素，如裂解、洗涤和洗脱缓冲液条件、储存缓冲液、体外 转录反应缓冲液以及检测体系的构建方法，均可能影响RNA聚合酶的活性。本文中，我们提供了一套用于纯化RNA聚合酶及σ因子RpoD、制备线性双链DNA模板以及构建体外转录检测体系的实验方案，以促进使用该系统的不同实验室之间的结果可重复性。我们详细描述了一个示例性反应，以展示RpoD依赖性转录的线性范围，并讨论了该方法的局限性及替代方案。

<table><tbody><tr><td>0.45 微米注射器滤器</td><td>Thermo Scientific</td><td>726-2545</td><td>步骤 1.7 和 2.3</td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管</td><td>MidSci</td><td>C50B</td><td>步骤 1.3 及后续步骤</td></tr><tr><td>50 mL 高速离心管</td><td>Thermo Scientific</td><td>3119-0050PK</td><td>步骤 1.2</td></tr><tr><td>500 mL 离心瓶</td><td>Thermo Scientific</td><td>3120-9500PK</td><td>步骤 1.1</td></tr><tr><td>B-PER 及其使用说明书</td><td>Thermo Scientific</td><td>78248</td><td>步骤 1.4 和 2.2</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Fisher Scientific</td><td>10035-04-8</td><td>步骤 2.6</td></tr><tr><td>截留分子量为 10 Kd 的离心过滤器</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC8010</td><td>步骤 1.11 和 2.11</td></tr><tr><td>钴树脂及其使用说明书</td><td>Thermo Scientific</td><td>89969</td><td>步骤 1.9</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Acros Organics</td><td>426380500</td><td>步骤 1.4 及后续步骤</td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶（核酸酶）</td><td>Millipore Sigma</td><td>70746</td><td>步骤 1.4 和 2.2</td></tr><tr><td>Factor Xa 蛋白酶&amp;nbsp;</td><td>Haematologic Technologies</td><td>HCXA-0060</td><td>步骤 2.6</td></tr><tr><td>GE Typhoon 5 磷酸成像仪</td><td>GE lifesciences</td><td>Multiple</td><td>步骤 4.15</td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>Bio-Rad</td><td>Mutiple</td><td>步骤 1.13 及后续蛋白质质量检测步骤</td></tr><tr><td>用于体外转录的 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>7732-18-5</td><td>步骤 3.2 和 3.3</td></tr><tr><td>高保真 PCR 试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td>步骤 3.1</td></tr><tr><td>高速离心机</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>步骤 1.1 及后续步骤</td></tr><tr><td>HiTrap 肝素 HP 5 x 1 mL</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>17040601</td><td>步骤 2.8</td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56750-100G</td><td>步骤 1.9</td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Thermo Scientific</td><td>90082</td><td>步骤 1.4 和 2.2</td></tr><tr><td>氯化镁&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25401</td><td>步骤 4.1</td></tr><tr><td>氯化锰</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25418</td><td>步骤 4.1</td></tr><tr><td>Mini Protean 四通道电泳槽</td><td>Bio-Rad</td><td>Mutiple</td><td>步骤 1.13 及后续蛋白质质量检测步骤</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Thermo Scientific</td><td>85124</td><td>步骤 4.1</td></tr><tr><td>NTP 混合物</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0481</td><td>步骤 4.1</td></tr><tr><td>PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28506</td><td>步骤 3.2</td></tr><tr><td>PCR 管</td><td>MidSci</td><td>PR-PCR28ACF</td><td>步骤 1.12</td></tr><tr><td>PD-10 Sephadex 脱盐柱及其使用说明书</td><td>Cytiva</td><td>17085101</td><td>步骤 1.10 和 2.10（凝胶过滤柱）</td></tr><tr><td>pMAL 蛋白融合&lt;br/&gt; 与纯化系统使用说明书</td><td>New England Biolabs</td><td>E8200S</td><td>步骤 2.1</td></tr><tr><td>聚丙烯酰胺凝胶 AnyKD</td><td>Bio-Rad</td><td>456-8125</td><td>步骤 1.13 及后续蛋白质质量检测步骤</td></tr><tr><td>谷氨酸钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1251</td><td>步骤 4.1</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂</td><td>Thermo Scientific</td><td>78425</td><td>步骤 1.4 和 2.2</td></tr><tr><td>放射性标记 ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU503H</td><td>步骤 4.2</td></tr><tr><td>RNA 上样染料（2x）</td><td>New England Biolabs</td><td>B0363S</td><td>步骤 4.13</td></tr><tr><td>RNase 抑制剂</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td>步骤 4.1</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Biotek</td><td>Mutiple</td><td>步骤 1.13 及后续蛋白质质量检测步骤</td></tr><tr><td>10% TBE-尿素凝胶</td><td>Bio-Rad</td><td>4566033</td><td>步骤 4.14</td></tr></tbody></table>

borreliella（borrelia）burgdorferi 体外转录实验的关键组分

Essential Components of Borreliella (Borrelia) burgdorferi In Vitro Transcription Assays

Borreliella burgdorferi 是一种代谢和基因组功能均较为有限的细菌病原体。B. burgdorferi 在脊椎动物与蜱之间以细胞外形式传播，并在感染过程中显著重塑其转录谱，以适应不同环境并存活。目前对 B. burgdorferi 的研究重点之一是明确了解该细菌如何通过转录变化响应其所处环境。体外转录实验可对转录调控的基本机制进行生物化学层面的解析。本文提供了一项详细实验方案，描述了 B. burgdorferi RNA 聚合酶的纯化与保存、σ 因子的纯化、DNA 模板的制备以及 体外转录实验的具体步骤。该方案使用从 B. burgdorferi 5A4 RpoC-His（5A4-RpoC）菌株中纯化的 RNA 聚合酶。5A4-RpoC 是一种已发表的菌株，其 rpoC 基因编码 RNA 聚合酶最大亚基，并带有 10×His 标签。体外转录实验体系包括从 5A4-RpoC 菌株纯化的 RNA 聚合酶、持家型 σ 因子 RpoD 的重组蛋白，以及通过 PCR 生成的双链 DNA 模板。尽管蛋白纯化技术及 体外转录体系构建在概念上已被广泛理解且方法相对通用，但不同生物来源的 RNA 聚合酶在操作处理上常存在差异。本文所述方案专为 B. burgdorferi RNA 聚合酶的酶学研究而设计，也可根据需要进行调整，用于检测转录因子、启动子以及翻译后修饰对该酶活性的影响。

在一个 体外 转录反应中，若反应的限速步骤为σ因子介导的转录起始，则转录活性应随σ因子量的增加而呈线性增长。本文介绍了 体外 转录实验中测试了一系列RpoD浓度以及两种RNA聚合酶浓度，以观察放射性标记核苷酸掺入RNA产物后产生的不同信号。图中展示了RNA聚合酶、RpoD和双链DNA模板储备液制备的代表性结果。该代表性 体外 转录反应可作为可接受用于分析的RNA聚合酶活性水平的示例。
为纯化RNA聚合酶，将4 L的B. burgdorferi RpoC-His10X菌液在34 °C、微需氧条件（5% CO2、3% O2）下培养。通过暗视野显微镜密切监测螺旋体密度，并在菌体密度超过4 × 107 个螺旋体/mL之前收集菌体。细胞用B-PER裂解液重悬（表1）。菌体沉淀通过移液进行均质化，室温孵育5分钟，随后进行三轮、每轮3秒的超声处理。澄清的裂解液用钴柱上样缓冲液稀释，并加入5 mL钴树脂，总体积为180 mL。将...

体外转录实验可用于解析伯氏疏螺旋体（Borreliella burgdorferi）中转录调控的机制。本方案描述了纯化伯氏疏螺旋体（B. burgdorferi）RNA聚合酶并进行体外转录反应的步骤。使用体外转录实验的研究方法需要可靠地纯化并储存具有活性的RNA聚合酶。

Borreliella（Borrelia）burgdorferi 体外转录实验的关键组分

伯氏疏螺旋体（Borreliella burgdorferi）是一种代谢和基因组功能均较为有限的细菌性病原体。该菌在宿主间以外部环境为媒介进行传播……

伯氏疏螺旋体的体外转录检测系统为研究人员提供了一种生化工具，可用于研究基因调控机制以及调控RNA聚合酶酶活性的各种因素。该系统使我们能够检测转录因子、辅因子、盐浓度和pH值对伯氏疏螺旋体RNA聚合酶功能的影响，从而增进对基因调控机制的整体理解。这一强大技术还可用于筛选选择性抑制RNA聚合酶的药物，为开发治疗莱姆病的新药提供了可能。首先，从在微需氧环境中培养至浓度为每毫升2×10⁸至4×10⁸个细胞的2至4升BSKII培养基中的Borreliella burgdorferi RpoC-His10X中收集细胞沉淀。在4°C条件下，使用500毫升离心管以10,000 × g离心30分钟，收集细胞沉淀并弃去上清液。随后，将细胞沉淀重悬于30毫升预冷的HN缓冲液中，重复离心步骤，倾去上清液。操作过程中，除非进行冷冻，否则应将细胞、裂解液和纯化后的蛋白质置于4摄氏度或冰上保存。通过在所用的每种缓冲液中添加终浓度为2毫摩尔的 freshly prepared 二硫苏糖醇（dithiothreitol），使RNA聚合酶保持在还原性环境中，并维持pH值为8.0。使用商用细菌裂解试剂盒从伯氏疏螺旋体（Borreliella burgdorferi）细胞沉淀中制备裂解液。将沉淀重悬于10至15毫升不含蛋白酶抑制剂的B-PER溶液中，冰上裂解5分钟。向裂解液中加入蛋白酶抑制剂混合物，进行三轮超声处理。随后使用50毫升离心管，通过离心和过滤澄清细胞裂解液。加入钴柱上样缓冲液至溶液中，使总体积达到30毫升。在20,000 × g条件下离心30分钟，沉淀细胞碎片。随后，使用0.45微米针头滤器过滤上清液，并将裂解液与钴柱上样缓冲液稀释至最终稀释比例为1:10。根据制造商的说明，使用钴或镍树脂柱对澄清的细胞裂解液上清进行亲和层析。保留流穿液、洗涤液和洗脱液样品用于分析。根据制造商的说明，立即使用缓冲液置换柱将RNA聚合酶溶液的缓冲液置换为储存缓冲液。然后，使用截留分子量为10千道尔顿的离心过滤装置，将RNA聚合酶浓缩至浓度为0.2至0.4毫克/毫升。通过分光光度计测定浓度，并制备冻存液。将20至50微升的RNA聚合酶冻存液分装至PCR管中，于-80摄氏度保存RNA聚合酶。准备操作台面，包括辐射工作台，以减少放射性污染。将新鲜的RNA聚合酶和RpoD储备液置于冰上解冻，并在移液前充分混匀所有解冻的冻存液。根据实验需求，在单独的NTP混合液中配制含有放射性标记核苷酸的主反应混合液。将对照反应分装至PCR管中，组成实验组。将水、反应混合液、RNA聚合酶和RpoD加入指定的PCR管后，用移液器吹打混匀试剂。将制备好的材料转移至辐射操作台，向NTP中加入α-32P标记的ATP，并轻轻吹打混匀。将NTP加入含有体外转录反应混合液的PCR管中，再加入DNA模板以启动体外转录反应。轻轻吹打混匀反应体系，并

essential-components-borreliella-borrelia-burgdorferi-vitro

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

伯氏疏螺旋体（Borrelia）伯氏疏螺旋体外转录测定的基本成分

来源：Eggers, C. H. 噬菌体介导的莱姆病螺旋体Borrelia burgdorferi的遗传操作。J. Vis. Exp. (2022)本视频展示了经基因改造的伯氏疏螺旋体（Borrelia...

用于病毒颗粒生产的 Borrelia burgdorferi 培养物的制备与诱导

来源： Berthold, A., et al. 疏螺旋体属博氏疏螺旋体复合体及回归热疏螺旋体的培养方法。 J. Vis.

病原性螺旋体的培养以研究皮肤感染

莱姆病是北美地区报告最多的虫媒传播疾病。其致病菌为伯氏疏螺旋体（Borrelia...

莱姆病研究中用于传播和异体诊断的动物蜱虫喂养

巢式PCR是一种灵敏、特异且操作简便的技术，可用于检测蜱虫DNA提取物中的莱姆病病原体——伯氏疏螺旋体（Borrelia...

使用巢式 PCR 在蜱虫中检测莱姆病螺旋体 Borrelia burgdorferi

噬菌体在细菌细胞间转移DNA的能力使其成为对其宿主细菌进行遗传操作的有效工具。本文介绍了一种诱导、回收和使用φBB-1噬菌体的方法，该噬菌体是 Borrelia...

噬菌体介导的莱姆病螺旋体 Borrelia burgdorferi 遗传操作

体外 培养是一种直接检测活菌存在的方法。本方案描述了多种细菌的培养方法 伯氏疏螺旋体 螺旋体， 包括那些 Borrelia burgdorferi 广义复合体，回归热 伯氏疏螺旋体 物种，以及 Borrelia...

伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）复合体及回归热疏螺旋体的培养方法

采用三通道双报告荧光流式分析系统，建立了一种基于微球的多重免疫测定方法，可同时检测血清样本中针对多种引起欧洲和北美莱姆病的Borrelia物种抗原所产生的IgG和IgM抗体。...

多重血清学检测中不同抗体类别同时检测

本文介绍了一种同时定量和比较生物膜中三种细胞内及细胞外组分的实验方案。该方法涉及共聚焦激光扫描显微镜、生物膜结构分析与可视化软件以及统计分析软件的使用。...

生物膜中细胞与胞外组分的同时定量

中性粒细胞在感染部位与活化的血管内皮细胞黏附是宿主炎症反应的重要组成部分。本报告所述为一种中性粒细胞结合实验，可用于 体外...

定量 体外 测定中性粒细胞在静息条件下对活化的人原代微血管内皮细胞黏附的实验方法

检测抗体功能对于理解Plasmodium...

高产量纯化Plasmodium falciparum裂殖子用于调理抗体检测

学习伯氏疏螺旋体体外转录测定技术，通过纯化RNA聚合酶和分析转录因子，研究基因调控机制。该方法为莱姆病药物筛选提供重要工具，助力微生物学与基因调控研究。

Borreliella（Borrelia）burgdorferi 体外转录实验的关键组分

探索更多视频