儿童传染性单核细胞增多症外周血样本中免疫细胞亚群的分离

该方法将有助于表征患有传染性单核细胞增多症（IM）的个体在相同疾病状态下不同的免疫细胞，从而加深我们对EBV感染机制的理解。本次实验操作由本实验室的医生林林 Zhang 演示。首先，取先前分离的外周血单个核细胞（PBMCs），置于1.5毫升微量离心管中，在室温下以300 ×g离心10分钟。

弃去上清液，用80 µL预冷的缓冲液重悬细胞。接着，向细胞悬液中加入20 µL CD14磁珠，轻轻吹打混匀，冰上孵育15分钟。然后用1 mL缓冲液洗涤PBMCs，并在室温下以300 ×g离心10分钟。

弃去全部上清液，并用 500 微升缓冲液重悬细胞。进行磁性分离时，将柱子置于磁珠分离器上，用 3 毫升缓冲液洗涤柱子以进行预处理。接着，将细胞悬液加入柱子中。

让其流过，并将未标记的细胞收集到一个15毫升离心管中。用3毫升缓冲液洗涤柱子三次，并将全部流出液收集至一个15毫升离心管中。现在，将柱子放入一个新的15毫升离心管中，并向柱子中加入5毫升缓冲液。

用力推动柱子的推杆，将磁性标记的细胞冲洗至离心管中。将磁性标记的细胞在300 G条件下离心5分钟。弃去上清液后，用500 µL PBS重悬细胞，并将细胞悬液转移至1.5 mL微量离心管中，用于后续转录组测序。

将收集的未标记细胞在300 G条件下离心5分钟以沉淀细胞，然后在1.5毫升微量离心管中用100微升PBS重悬细胞。随后，向细胞悬液中加入每种标记抗体各2微升，在冰上避光孵育30分钟。接下来，将100微升PBMC细胞悬液分装至1.5毫升微量离心管中，用于制备CD3、CD4、CD8和CD19的阴性对照样本、单染样本，以及CD56或CD16染色样本。

然后向每管中加入两微升相应的荧光标记抗体，置于冰上避光孵育30分钟。孵育结束后，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤所有细胞，方法如前所述，并将细胞重悬于500微升PBS中。打开细胞分选系统，运行电源开启程序。

然后，安装85微米喷嘴，并打开分选流。将分选电压设置为4,500伏，频率设置为47。在断裂窗口中将间隙设置为8，并开启甜点自动分选模式，以自动确定液滴振幅值。

最后，在侧流窗口中将液滴延迟调整为 30.31。利用前向散射光与侧向散射光的散点图，绘制多边形门 P1 以识别完整的淋巴细胞群体。接着，利用前向散射光面积与高度的散点图，绘制多边形门 P2 以识别单细胞并排除双联体。

然后使用CD 19 FITC面积与CD 3 PerCP-Cy5.5面积的散点图，绘制矩形门P3以选择CD 3阳性的T细胞和CD 19阳性的B细胞。接着，使用CD 4 APC-Cy7面积与CD 8 PE面积的散点图，绘制矩形门以选择CD 4和CD 8阳性的T细胞。最后，使用侧向散射面积与CD 56或CD 16 APC面积的散点图，绘制矩形门以选择CD 56或CD 16阳性的自然杀伤细胞。

对于阴性对照管，在采集仪表板中点击“加载”，并在软件中选择流式细胞仪的设置。在检查器窗口中，点击“参数”选项卡，调节前向散射光、侧向散射光以及不同荧光染料的电压。将单染管加载至流式细胞仪后，在采集仪表板中点击“加载”，然后点击“补偿”选项卡，按照文中所述调整补偿。

将细胞悬液轻轻涡旋混匀，然后将试管装入流式细胞仪。向四个收集流式管中各加入 200 µL FBS，涡旋混匀，并将这些试管放入流式细胞仪的收集室中。

将不同类型的细胞分别收集到四个流式管中。以300 G离心5分钟，然后向细胞沉淀中加入200微升RNA提取试剂，用于转录组测序。在本研究中，通过结合免疫磁珠技术和荧光激活细胞分选技术，高效地分选出不同样本外周血中的免疫细胞亚群。

本方案中，细胞分选步骤经过优化，以提高细胞活力。与健康的EB病毒携带者及未感染样本相比，传染性单核细胞增多症患者的分选免疫细胞中，CD3、CD8阳性T细胞的比例升高。相反，与健康EBV携带者及EBV未感染儿童相比，传染性单核细胞增多症患者中CD3、CD4阳性T细胞和CD19阳性B细胞的比例降低。

此外，与未感染 EBV 的儿童相比，传染性单核细胞增多症患者的 CD56 或 CD16 阳性自然杀伤细胞比例降低。保持细胞活力对于后续实验至关重要。在分选过程中将细胞置于冰上或冰箱中有利于维持细胞活力。