Name: 小鼠骨髓造血干细胞和祖细胞以及基质生态位细胞的流式细胞术分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 学习使用流式细胞术分析小鼠骨髓造血干细胞、祖细胞及基质生态位细胞的方法。该技术可区分骨内膜和中央骨髓区域，为研究造血微环境扰动提供重要工具。

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LM 获得了塔塔夫人纪念基金会（Lady Tata Memorial Trust）资助项目的资助。JR 获得了葡萄牙科学技术基金会（Fundação para a Ciência e Tecnologia，FCT；FCT 博士生奖学金编号 UI/BD/150833/2021）提供的博士生奖学金支持。ML 获得了葡萄牙科学技术基金会（FCT）提供的博士生奖学金支持（FCT 奖学金编号 2021.04773.BD）。DD 获得了美国血液学会、Pablove 基金会、葡萄牙科学技术基金会（FCT，项目编号 EXPL/MED-ONC/0522/2021）以及葡萄牙血液学会的资助。我们感谢 i3s 机构 TRACY 平台的 Catarina Meireles 博士和 Emilia Cardoso 提供的支持。

本方案中使用的动物饲养在i3S动物实验设施中，环境条件为12小时光照-黑暗循环、温度受控且无特定病原体。动物可自由获取标准啮齿类动物饲料和水。所有动物的护理均遵循欧洲实验动物科学联合会（Federation of European Laboratory Animal Science Associations）关于实验动物护理和使用的标准（欧盟指令2010/63/EU）。对动物实施的实验操作（安乐死）已获得i3S动物伦理委员会（编号：DD_2019_15）和葡萄牙国家农业与兽医局（Direção-Geral de Alimentação e Veterinária）的批准。本方案中所用材料的详细信息见《材料表》Table of Materials。
1. 溶液与染色混合液的制备
<ol>
	<li>磷酸盐缓冲液（PBS）：将五片 PBS 片剂溶解于 1 L 蒸馏水中。室温（RT）保存。</li>
	<li>含 2% 胎牛血清（FBS）的 PBS：向 500 mL PBS 中加入 10 mL FBS。4 °C 保存。</li>
	<li>红细胞（RBC）裂解缓冲液（1x）：将 50 mL 10x RBC 裂解缓冲液加入 450 mL 去离子水中。4 °C 保存。</li>
	<li>胶原酶 IV 和分散酶 II 溶液：将 30 mg 胶原酶 IV 和 60 mg 分散酶 II 溶解于 30 mL HBSS 中，配制成浓度为 1 mg/mL 的胶原酶 IV 和 2 mg/mL 的分散酶 II 溶液。使用前新鲜配制。</li>
	<li>Fc 受体封闭溶液：将 10 µL 纯化的抗小鼠 CD16/32 抗体加入 490 µL 含 2% FBS 的 PBS 中。可新鲜配制或于前一天配制。4 °C 保存至使用前。</li>
	<li>荧光细胞活力染料染色液：将 2 µL 荧光细胞活力染料加入 1 mL PBS 中。使用前新鲜配制。</li>
	<li>生物素标记谱系抗体混合液：取下列每种抗体各 100 µL 混合：生物素标记抗小鼠 CD3ε、生物素标记抗小鼠 CD4、生物素标记抗小鼠 CD8a、生物素标记抗小鼠/人 CD11b、生物素标记抗小鼠/人 CD45R/B220、生物素标记抗小鼠 Ly-6G/Ly-6C（Gr-1）以及生物素标记抗小鼠 TER-119/红系细胞抗体。4 °C 保存至使用前。</li>
	<li>造血干细胞（HSCs）一抗染色混合液：向 940 µL 含 2% FBS 的 PBS 中加入 10 µL 生物素标记谱系抗体混合液、10 µL 免疫荧光标记的抗小鼠 CD150（SLAM）510 抗体、10 µL 藻红蛋白（PE）标记抗小鼠 Flk2（CD135）抗体、10 µL 多甲藻叶绿素蛋白（PerCP）标记抗小鼠 Ly-6A/E（Sca-1）抗体、10 µL PE/氰胺 7（PE/Cyanine7）标记抗小鼠 CD48 抗体，以及 10 µL 别藻青蛋白（APC）/氰胺 7（APC/Cyanine7）标记抗小鼠 CD117（c-kit）抗体。可新鲜配制或于前一天配制。4 °C 避光保存至使用前。</li>
	<li>基质细胞一抗染色混合液：向 954 µL 含 2% FBS 的 PBS 中加入 5 µL 小鼠瘦素受体（leptin R）生物素化抗体、6.7 µL PE 标记抗小鼠内黏蛋白（endomucin）抗体、10 µL PerCP 标记抗小鼠 Ly-6A/E（Sca-1）抗体、4 µL PE/氰胺 7 标记抗小鼠 CD31 抗体、10 µL APC/氰胺 7 标记抗小鼠 CD45 抗体，以及 10 µL APC/氰胺 7 标记抗小鼠 TER-119/红系细胞抗体。可新鲜配制或于前一天配制。4 °C 避光保存至使用前。</li>
	<li>HSCs/基质细胞二抗染色溶液：向 1 mL 含 2% FBS 的 PBS 中加入 1 µL APC 标记链霉亲和素。可新鲜配制或于前一天配制。4 °C 避光保存至使用前。</li>
	<li>内皮细胞（ECs）染色混合液：向 940 µL 含 2% FBS 的 PBS 中加入 10 µL PE 标记抗小鼠内黏蛋白（endomucin）抗体、10 µL PerCP 标记抗小鼠 Ly-6A/E（Sca-1）抗体、10 µL PE/氰胺 7 标记抗小鼠 CD31 抗体、10 µL Alexa Fluor 647 标记抗小鼠 CD54/ICAM-1 抗体、10 µL APC/氰胺 7 标记抗小鼠 CD45 抗体，以及 10 µL APC/氰胺 7 标记抗小鼠 TER-119/红系细胞抗体。可新鲜配制或于前一天配制。4 °C 避光保存至使用前。</li>
	<li>DAPI 染色液：向 500 µL PBS 中加入 1 滴 DAPI 试剂。使用前新鲜配制。</li>
</ol>
2. 样品提取
<ol>
	<li>通过颈椎脱位处死动物（本研究中所用动物的详细信息见补充表1）。将动物仰面放置于培养皿中，并用70%乙醇喷洒。使用剪刀在腹部上方剪开皮肤，并将皮肤一直剥离至踝部。</li>
	<li>握住一条腿，用剪刀在腿部末端（即腿与髋部关节连接处）剪断，使其与动物体分离。此步骤也可作为安乐死的二次确认方法。在踝部剪断以去除足部。将腿置于冰上预冷的含2% FBS的PBS中。如有需要，对另一条腿重复此步骤。</li>
	<li>握住髋骨，用剪刀在其后方剪断，使其与动物体分离。将髋骨置于冰上预冷的含2% FBS的PBS中。如有需要，对另一侧髋骨重复此步骤。</li>
	<li>将腿和髋骨放入培养皿中，使用无菌手术刀清理骨骼组织。用手术刀在膝关节处剪断，分离胫骨和股骨。将清理后的骨骼置于冰上预冷的含2% FBS的PBS中。</li>
</ol>
3. 全骨髓中造血细胞群体分析的样品处理
<ol>
	<li>将一根股骨或胫骨放入研钵中，加入预冷的含2% FBS的PBS，用研杵轻轻将其压向研钵壁以捣碎骨骼。骨髓细胞会释放到研钵中的溶液里。</li>
	<li>使用10 mL移液器反复吹打所得细胞悬液，混匀后通过置于50 mL离心管上方的40 µm细胞筛网转移至该离心管中。</li>
	<li>如果此时捣碎后的骨骼未呈现白色，向研钵中补充更多含2% FBS的PBS，重复研磨操作，再反复吹打并将溶液通过同一40 µm细胞筛网转移至同一个50 mL离心管中。</li>
	<li>用额外的含2% FBS的PBS冲洗研钵，并将冲洗液通过同一40 µm细胞筛网转移至同一50 mL离心管中。将50 mL离心管在4 °C条件下以500 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，于室温下用5 mL红细胞裂解缓冲液（1x）重悬细胞沉淀，通过反复吹打数次使其充分悬浮。室温孵育2分钟后，加入15 mL含2% FBS的PBS。</li>
	<li>将50 mL离心管在4 °C条件下以500 × g离心5分钟。若细胞沉淀仍呈红色，则返回步骤3.5重复操作；若无明显红色，则弃去上清液，将沉淀重悬于200 µL PBS中，并将细胞悬液转移至96孔V型底板的一个孔中用于染色。</li>
	<li>将培养板在4 °C条件下以500 × g离心3分钟。将板倒扣在吸水纸上弃去上清液，再将沉淀重悬于200 µL荧光染料染色液中。室温避光孵育15分钟。</li>
	<li>将培养板在4 °C条件下以500 × g离心3分钟。将板倒扣在吸水纸上弃去上清液，再将沉淀重悬于200 µL含2% FBS的PBS中进行洗涤。</li>
	<li>将培养板在4 °C条件下以500 × g离心3分钟，将板倒扣在吸水纸上弃去上清液，再将沉淀重悬于100 µL Fc受体封闭液中。4 °C避光孵育10分钟。</li>
	<li>加入100 µL含2% FBS的PBS，轻轻吹打数次进行洗涤。&#160;将培养板在4 °C条件下以500 × g离心3分钟，弃去上清液（将板倒扣于吸水纸上），再将沉淀重悬于100 µL HSCs一抗染色混合液中。室温避光孵育15分钟。</li>
	<li>加入100 µL含2% FBS的PBS，轻轻吹打数次进行洗涤。将培养板在4 °C条件下以500 × g离心3分钟，弃去上清液（将板倒扣于吸水纸上），再将沉淀重悬于100 µL HSCs二抗染色溶液中。室温避光孵育15分钟。</li>
	<li>加入100 µL含2% FBS的PBS，轻轻吹打数次进行洗涤。将培养板在4 °C条件下以500 × g离心3分钟，并将板倒扣在吸水纸上弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于250 µL含2% FBS的PBS中，并通过40 µm细胞筛网将细胞悬液转移至一个5 mL聚苯乙烯圆底管中。置于冰上并避光保存，直至进行流式细胞术分析。 
	&#8203;注意：若需测定造血细胞亚群的绝对数量，可在上机分析前向聚苯乙烯管中加入Calibrite微球16。</li>
</ol>
4. 全骨髓基质细胞群体分析的样品处理
<ol>
	<li>将一根股骨或胫骨放入研钵中，加入冰冻的含2% FBS的PBS，用研杵轻轻在研钵壁上按压以研磨骨骼&#160;。用剪刀剪去P1000吸头的尖端，用其将研钵中的全部内容物转移至一个50 mL离心管中（不要通过细胞滤网）。</li>
	<li>在4 °C条件下，以500 × g离心50 mL离心管5分钟，弃去上清液，并将沉淀重悬于3 mL胶原酶IV和分散酶II溶液中。将离心管在37 °C孵育40分钟。</li>
	<li>用含2% FBS的PBS补至25 mL，涡旋混匀。将50 mL离心管中的内容物通过100 µm细胞滤网转移至一个新的50 mL离心管中。向原50 mL离心管中加入15 mL含2% FBS的PBS，并通过同一细胞滤网将溶液转移至同一新50 mL离心管中。&#160;在4 °C以500 ×&#160;g&#160;离心&#160;5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用移液器反复吹打数次，将细胞沉淀重悬于5 mL室温的红细胞裂解缓冲液（1×）中。在室温孵育2分钟后，加入15 mL含2% FBS的PBS。</li>
	<li>在4 °C以500 × g离心50 mL离心管5分钟。若细胞沉淀仍呈红色，则返回步骤4.4。若无明显红色，则弃去上清液，将沉淀重悬于200 µL含2% FBS的PBS中，并将细胞悬液转移至96孔V型底板的一个孔中用于染色。在4 °C以500 × g离心3分钟。</li>
	<li>若进行基质细胞染色，则进入步骤4.7；若进行内皮细胞（EC）染色，则进入步骤4.12。</li>
	<li>将板倒扣在吸水纸上弃去上清液，将沉淀重悬于100 µL基质细胞一抗染色混合液中。在室温避光孵育15分钟。</li>
	<li>加入100 µL含2% FBS的PBS，反复吹打数次进行洗涤。在4 °C以500 × g离心3分钟，将板倒扣在吸水纸上弃去上清液，将沉淀重悬于100 µL基质细胞二抗染色溶液中。在室温避光孵育15分钟。</li>
	<li>加入100 µL含2% FBS的PBS，反复吹打数次进行洗涤。在4 °C以500 × g离心3分钟。将板倒扣在吸水纸上弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于250 µL含2% FBS的PBS中，并通过40 µm细胞滤网将细胞悬液转移至一个5 mL聚苯乙烯圆底管中。置于冰上并避光保存。</li>
	<li>在上机进行流式细胞仪分析前，向含有细胞悬液的管中加入35 µL DAPI染色液，在室温避光孵育5分钟。孵育结束后，置于冰上并避光保存，直至进行流式细胞仪分析。</li>
	<li>将板倒扣在吸水纸上弃去上清液，将沉淀重悬于100 µL内皮细胞（ECs）染色混合液中。在室温避光孵育15分钟。</li>
	<li>加入100 µL含2% FBS的PBS，反复吹打数次进行洗涤。在4 °C以500 × g离心3分钟。</li>
	<li>将板倒扣在吸水纸上弃去上清液。将沉淀重悬于250 µL含2% FBS的PBS中，并通过40 µm细胞滤网将细胞悬液转移至一个5 mL聚苯乙烯圆底管中。置于冰上并避光保存。</li>
	<li>在上机进行流式细胞仪分析前，向含有细胞悬液的管中加入35 µL DAPI染色液，在室温避光孵育5分钟。孵育结束后，置于冰上并避光保存，直至进行流式细胞仪分析。 
	&#8203;注意：若需测定基质细胞和内皮细胞群体的绝对数量，可在上机分析前向聚苯乙烯管中加入Calibrite微球16。</li>
</ol>
5. 粉碎并冲洗骨髓中造血细胞群体分析的样品处理
<ol>
	<li>将一根股骨置于培养皿中，使用无菌手术刀切除骨的两端。</li>
	<li>用无死体积的0.5 mL胰岛素注射器，从骨的两侧分别向骨髓腔内各注入100 µL含2% FBS的PBS溶液一次，并将冲洗液收集至含有1 mL含2% FBS的PBS的微量离心管中。随后，将细胞悬液转移至一个已标记为“冲洗骨髓”（flushed BM）的50 mL离心管中，该管内预先加入4 mL含2% FBS的PBS。置于冰上保存。</li>
	<li>将骨的两端放入预冷的含2% FBS的PBS的研钵中，用研杵轻轻沿研钵壁按压研磨。使用10 mL移液器反复吹打所得细胞悬液以混匀，并通过40 µm细胞滤网转移至标记为“研磨骨髓”（crushed BM）的50 mL离心管中。</li>
	<li>若此时研磨后的骨组织仍未呈白色，向研钵中补充更多含2% FBS的PBS，重复研磨过程。再次用移液器反复吹打，并通过同一40 µm细胞滤网将溶液转移至同一个50 mL离心管（研磨骨髓）中。</li>
	<li>用更多含2% FBS的PBS冲洗研钵，并通过同一40 µm细胞滤网将冲洗液转移至同一个50 mL离心管（研磨骨髓）中。</li>
	<li>将分别对应冲洗和研磨样本的50 mL离心管在4 °C条件下以500 × g 离心3分钟。</li>
	<li>对冲洗和研磨所得的骨髓样本，继续执行第3.5至3.13步（第3节）的操作。</li>
</ol>
6. 流式细胞术分析用单色对照（SCC）的制备
<ol>
	<li>使用未用于主分析的某只动物的额外一块骨骼，重复步骤 3.1 至 3.6（第 3 节），但将最终的细胞悬液转移至含有 1 mL PBS 2% FBS 的微量离心管中，而非 96 孔 V 型底板的孔中。</li>
	<li>将 100 µL 细胞悬液转移至 96 孔 V 型底板的 8 个孔中，另取 100 µL 加入标记为 DAPI SCC 的含有 100 μL PBS 2% FBS 的 5 mL 聚苯乙烯圆底管中，剩余的细胞悬液加入另一标记为未染色的含有 100 μL PBS 2% FBS&#160;的 5 mL 聚苯乙烯圆底管中。将所有管置于冰上，并避光保存。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 500 x g 离心 3 分钟，然后将板倒置在吸水纸上弃去上清液。</li>
	<li>将其中一个沉淀重悬于 100 µL 荧光染料染色液中，其余沉淀均重悬于 100 µL PBS 2% FBS 中。</li>
	<li>向各含有 PBS 2% FBS 细胞悬液的孔中分别加入以下抗体：除抗体谱系混合物需加入 2 µL、PECy7 标记的 CD31 抗体需加入 0.3 µL 外，其余每种抗体均加入 0.5 µL。每孔仅加一种抗体，所用抗体应与主分析图谱中使用的抗体相同，或为具有相似荧光强度和表位丰度的同荧光素标记抗体。具体抗体包括：生物素标记的谱系混合抗体、免疫荧光标记的 510 抗小鼠 CD150（SLAM）、PE 标记的抗小鼠 Flk2（CD135）、PerCP 标记的抗小鼠 Ly-6A/E（Sca-1）、免疫荧光标记的 647 抗小鼠 CD54/ICAM-1、PE/Cyanine7 标记的抗小鼠 CD48，以及 APC/Cyanine7 标记的抗小鼠 CD117（c-kit）。将板在室温下避光孵育 15 分钟。</li>
	<li>向每孔加入 100 µL PBS 2% FBS，反复吹打数次进行洗涤。在 4 °C 条件下以 500 x g 离心 3 分钟，然后将板倒置在吸水纸上弃去上清液。</li>
	<li>除用抗体谱系混合物孵育过的细胞沉淀外，将所有其他沉淀重悬于 180 µL PBS 2% FBS 中，并通过 40 µm 细胞筛网将细胞悬液转移至 5 mL 聚苯乙烯圆底管中。置于冰上避光保存，直至进行流式细胞术分析。</li>
	<li>将用抗体谱系混合物孵育过的细胞沉淀重悬于 100 µL HSCs/基质细胞二次染色液中。将板在室温下避光孵育 15 分钟。</li>
	<li>加入 100 µL PBS 2% FBS，反复吹打数次进行洗涤。在 4 °C 条件下以 500 x g 离心 3 分钟。</li>
	<li>将沉淀重悬于 180 µL PBS 2% FBS 中，并通过 40 µm 细胞筛网将细胞悬液转移至 5 mL 聚苯乙烯圆底管中。置于冰上避光保存，直至进行流式细胞术分析。</li>
	<li>在上机检测前，向 DAPI SCC 管中加入 35 µL DAPI 染色液，在室温下避光孵育 5 分钟。孵育结束后，立即置于冰上避光保存，直至进行流式细胞术分析。</li>
</ol>

<ol><li>Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niches+that+regulate+stem+cells+and+hematopoiesis+in+adult+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow.</a> Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

尽管所述方案简单且易于操作，但仍需特别注意某些步骤。例如，在获取冲洗骨髓（步骤5.2）时，通过骨中央部分内腔的含2% FBS的PBS冲洗体积或次数不应超过指定范围，否则可能导致冲洗样本被骨内膜细胞群体严重污染。
研究者可根据需要对实验方案进行适当调整以方便操作。在样本提取（第2节）过程中，腿部和/或骨骼可在含2% FBS的PBS中4 °C保存最多24小时，然后再进行样本处理与分析。然而，应尽可能缩短保存时间。在造血干细胞（HSCs）一抗染色混合液孵育（步骤3.10）和二抗染色混合液孵育（步骤3.11）过程中，虽然推荐在室温下孵育15分钟，但也可替换为在4 °C孵育30分钟。
上述情况同样适用于与基质细胞一抗染色混合液（步骤 4.7）、基质细胞二抗染色溶液（步骤 4.8）、内皮细胞（ECs）染色混合液（步骤 4.12）以及用于 SCCs 的抗体孵育（步骤 6.5）；虽然建议在室温下孵育 15 分钟，但也可替换为在 4 °C 下孵育 30 分钟。
最近有文献描述了通过离心法分...

流式细胞术是一种用于表征和前瞻性分离免疫细胞及造血细胞的宝贵方法。该技术也越来越多地被用于分析不同组织中的基质细胞和上皮细胞群体。造血干细胞（HSC）具有自我更新和多向分化潜能的独特特性。在成年哺乳动物中，HSC主要存在于骨髓（BM）中，在那里它们从周围的微环境或生态位接收维持静息状态和存活的信号1。HSC的形式定义依据功能检测实验2。然而，多篇里程碑式的研究论文已证明流式细胞术在鉴定HSC方面的有效性。通过使用有限的细胞表面标志物，可以区分出富含HSC的造血细胞群体3。因此，流式细胞术是干细胞研究领域的一项核心方法。它被广泛用于评估假定的生态位细胞类型及生态位因子对HSC的影响。通过将流式细胞术与成像技术和功能检测相结合，研究发现HSC受到血管周围间充质干细胞（MSC）和内皮细胞（EC）的关键支持。骨髓MSC是一类异质性群体，其分泌的细胞因子各不相同4，但已有充分证据表明，表达瘦素受体（LepR）+的MSC是关键的生态位细胞1。骨髓EC同样具有高度异质性，可构成窦状血管、小动脉以及H型/过渡型血管5。不同研究揭示了这些不同类型EC的精细作用。例如，骨内膜附近的窦状血管EC在空间上更接近静息态HSC6，而活性氧水平较低且不迁移的HSC则位于小动脉EC附近7。生态位所处的骨内膜区域与中央区域的位置差异也极为重要。骨内膜处的H型血管与血管周围的基质细胞相关，而这些基质细胞会随衰老而丢失，从而导致HSC减少8。在急性髓系白血病中，中央区域的EC扩增，而骨内膜血管和骨内膜HSC则减少9。
该领域的大多数研究一直聚焦于造血过程本身以及造血干细胞（HSCs）的细胞外在调控。然而，人们日益认识到，有必要更深入地表征调控其他前体细胞的微环境，特别是多能前体细胞（MPPs），因为它们在稳态条件下是造血的主要驱动者10。与固定的层级结构不同，近期研究表明，造血是一个连续的过程&#160;，其中HSCs在早期阶段即分化为具有不同谱系偏向的MPPs11。MPPs曾依据不同的分类体系命名12，但国际实验血液学学会（ISEH）近期发布的一份共识文件建议将MPPs区分为早期MPPs，并根据其淋巴系偏向（MPP-Ly）、巨核系-红系偏向（MPP-Mk/E）以及髓系偏向（MPP-G/M）进行分类13。流式细胞术的应用对于进一步研究骨髓（BM）微环境在调控这些细胞群体中的作用至关重要。目前的流式细胞术方法采用不同的设门策略来区分造血干细胞和祖细胞（HSPCs），并使用不一致的标志物来鉴定基质细胞，特别是内皮细胞（ECs）。本方法的目标是提供一种简单且可重复的骨髓染色操作流程，用于识别HSPC亚群、异质性的EC群体以及LepR+ 间充质干细胞（MSCs）。我们认为，尽管该技术与先前报道的方法具有可比性（例如参见文献14），但它为两种功能性骨髓区域——骨内膜区和中央骨髓区8,15——以及骨髓基质微环境细胞中造血细胞的表型分析，提供了一种更新且易于实施的实验方案。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 647 抗小鼠 CD54/ICAM-1 抗体</td><td>BioLegend</td><td>116114</td><td></td></tr><tr><td>APC 链霉亲和素</td><td>BioLegend</td><td>405207</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cyanine7 抗小鼠 CD117 (c-kit) 抗体</td><td>BioLegend</td><td>105826</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cyanine7 抗小鼠 CD45 抗体</td><td>BioLegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cyanine7 抗小鼠 TER-119/红系细胞抗体</td><td>BioLegend</td><td>116223</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记抗小鼠 CD3&amp;epsilon; 抗体</td><td>BioLegend</td><td>100304</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记抗小鼠 CD4 抗体</td><td>BioLegend</td><td>100404</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记抗小鼠 CD8a 抗体</td><td>BioLegend</td><td>100704</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记抗小鼠 Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) 抗体</td><td>BioLegend</td><td>108404</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记抗小鼠 TER-119/红系细胞抗体</td><td>BioLegend</td><td>116204</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记抗小鼠/人 CD11b 抗体</td><td>BioLegend</td><td>101204</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记抗小鼠/人 CD45R/B220 抗体</td><td>BioLegend</td><td>103204</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 抗小鼠 CD150 (SLAM) 抗体</td><td>BioLegend</td><td>115929</td><td></td></tr><tr><td>Calibrite 2 色微球</td><td>BD Biosciences</td><td>349502</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 IV</td><td>Merck Life Science</td><td>C1889</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Merck Life Science</td><td>D4693</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，经鉴定，热灭活，符合欧盟标准，南美洲来源</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 Leptin R 生物素化抗体</td><td>R&amp;D systems</td><td>BAF497</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue 固定细胞试剂 (DAPI)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37606</td><td>DAPI 试剂</td></tr><tr><td>PE 抗小鼠内粘蛋白抗体</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-5851-82</td><td></td></tr><tr><td>PE 抗小鼠 Flk2 (CD135)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-1351-82</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cyanine7 抗小鼠 CD31 抗体</td><td>BioLegend</td><td>102524</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cyanine7 抗小鼠 CD48 抗体</td><td>BioLegend</td><td>103424</td><td></td></tr><tr><td>PerCP 抗小鼠 Ly-6A/E (Sca-1) 抗体</td><td>BioLegend</td><td>108122</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS) 片剂</td><td>Merck Life Science</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>纯化抗小鼠 CD16/32 抗体</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液 10x</td><td>BioLegend</td><td>420302</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Violet 可固定活力染料</td><td>BioLegend</td><td>423114</td><td>荧光染料</td></tr></tbody></table>

小鼠骨髓造血干细胞与祖细胞及基质微环境细胞的流式细胞术分析

Flow Cytometry Analysis of Murine Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and Stromal Niche Cells

骨髓（BM）是存在于骨骼内的软组织，是造血作用的主要发生场所，即新血细胞生成的过程。因此，骨髓中含有造血干细胞和祖细胞（HSPCs），以及支持性的基质细胞，这些细胞共同参与HSPCs的维持与调控。血液系统疾病及其他骨髓疾病可通过直接影响造血细胞和/或改变骨髓微环境，从而破坏正常造血功能。本文介绍一种通过流式细胞术对小鼠骨髓HSPCs及基质微环境细胞群进行表型分析，以研究健康与恶性状态下造血过程的方法。本方法详细描述了从骨内膜区和中央骨髓区富集骨髓细胞所需的步骤，以及用于鉴定两种关键微环境细胞类型——内皮细胞和间充质干细胞的合理设门策略。此处提出的表型分析方法可与小鼠突变体、疾病模型及功能实验相结合，用于全面表征HSPC区室及其微环境。

图1展示了在健康年轻成年C57Bl/6小鼠中对造血干细胞（HSCs）和多能祖细胞（MPPs）进行流式细胞术分析的代表性图谱。图1所示的设门策略遵循国际实验血液学会（ISEH）提出的最新统一命名规范13。在分析诸如感染或癌症等干扰因素的影响时，使用对照小鼠作为正常设门的参考至关重要。荧光减一（FMO）对照在界定设门边界时尤为有用，但需注意，盲目依据FMO结果设定门限可能会遗漏目标细胞或纳入非目标细胞。例如，CD48表达强度越低，静息态长期HSCs的富集程度越高17。此外，某些细胞群体的不同特性依赖于特定标志物的表达强度。例如，CD150表达水平较高的HSCs更倾向于髓系分化18。
对总共四只动物的造血细胞群体进行分析所获得的频率和绝对数量见表1。
图2<...

本文介绍了一种简单的小鼠骨髓细胞分离与染色方案，用于表征造血干细胞和祖细胞，以及支持性微环境中的内皮细胞和间充质干细胞。方案中还包括一种富集位于骨内膜区和骨髓中央区域细胞的方法。

骨髓（BM）是存在于骨骼内的软组织，是造血作用的主要发生部位，即新血细胞生成的过程。作为……

本方案可用于骨髓造血干细胞和祖细胞以及骨髓基质细胞的表型分析。该方法可用于研究在不同条件下这些细胞群体的变化。与其他已报道的方法相比，该技术能够对造血细胞进行表型分析，特别是针对骨髓的两个功能性区域——骨内膜区和中央骨髓区，以及骨髓基质细胞。首先，将已处死的动物仰卧放置于培养皿中，并用70%乙醇喷洒。使用剪刀在腹部上方剪开切口，将皮肤一直剥离至踝部。抓住其中一条腿，用剪刀在其底部剪断，将其从动物体上分离。然后在踝关节处剪切，将足部从腿部移除，并将腿部置于冰上预冷的含2% FBS的PBS中。接着用镊子夹住髋骨，使用剪刀在其后方剪切，将其从动物体上分离。将髋骨置于冰上预冷的含2% FBS的PBS中。将腿骨和髋骨放入培养皿后，使用无菌手术刀清洁骨骼。然后用手术刀在膝关节处切割，分离胫骨和股骨，并将清洁后的骨骼置于含2%FBS的冰浴PBS中。将股骨或胫骨放入研钵中，加入含2%FBS的冰浴PBS，用研杵轻轻按压骨骼使其紧贴研钵壁，从而粉碎骨骼。接下来，使用10毫升移液器将所得的细胞悬液上下吹打，以混匀，并通过置于管口上方的40微米细胞筛网将其转移至50毫升离心管中。用更多含有2% FBS的PBS冲洗研钵，并将冲洗液通过同一40微米细胞筛网转移至同一50毫升离心管中。将50毫升离心管在4摄氏度下以500 ×g离心5分钟。弃去上清液后，于室温下用移液器反复吹打数次，将细胞沉淀重悬于5毫升红细胞裂解缓冲液中。室温孵育2分钟后，加入15毫升含2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液（PBS 2%FBS），并将50毫升离心管离心。若细胞沉淀无明显红色，则弃去上清液，将沉淀重悬于200微升含2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液（PBS 2%FBS）中，随后将细胞悬液转移至96孔V型底板的一个孔中进行染色。按照之前演示的方法将骨组织研碎后，用剪刀剪去P1000移液枪枪头的尖端，用其将研钵中的全部内容物转移至一个50毫升离心管中。随后在4°C条件下以500 ×g离心5分钟。弃去上清液后，将沉淀重悬于3毫升胶原酶IV和分散酶II溶液中。将试管在 37 摄氏度下孵育 40 分钟。用含 2% FBS 的 PBS 补充至 25 毫升，并涡旋混匀。接着，通过 100 微米细胞滤筛将内容物转移至新的 50 毫升试管中。然后向旧的50毫升离心管中加入15毫升含2% FBS的PBS，并通过100微米细胞滤筛将溶液转移至新的50毫升离心管中。离心后弃去上清液，用移液器反复吹打数次，将细胞沉淀重悬于5毫升红细胞裂解缓冲液中。室温孵育2分钟后，加入15毫升含2% FBS的PBS。再次离心试管，弃去上清液后若细胞沉淀无明显红色，则将沉淀重悬于 200 µL 含 2% FBS 的 PBS 中，并将细胞悬液转移至 96 孔 V 型底板的一个孔中进行染色。随后在 4°C 条件下以 500 ×g 离心 3 分钟。将股骨置于培养皿中，使用无菌手术刀切除骨的两端。然后使用无死体积的0.5毫升胰岛素注射器，从骨的两侧各一次将100微升含2%FBS的PBS穿过骨内部，冲洗骨的中央部分，并将冲洗液收集至含有1毫升含2%FBS的PBS的微量离心管中。随后将细胞悬液转移至一个已标记为“冲洗后骨髓”的50毫升离心管中，该管内含有4毫升含2%FBS的PBS。在研钵中用预冷的含2%FBS的PBS，借助研杵轻轻按压骨的两端使其与研钵壁摩擦，从而将骨端压碎。待细胞悬液充分匀浆后，通过40微米细胞滤筛将其转移至已标记为“破碎骨髓”的50毫升离心管中。最后，用更多含2% FBS的PBS冲洗研钵，并将冲洗液转移至同一离心管中。对健康年轻成年C57BL6J小鼠的全部骨髓样本进行了造血干细胞和多能祖细胞的流式细胞术分析。在分析总骨髓中的基质细胞、内皮细胞和间充质干细胞时，可根据瘦素受体（leptin receptor）的表达来明确识别间充质干细胞，而内皮细胞则可根据CD31和SCA-1的表达进行识别。通过流式细胞术分析总骨髓中的内皮细胞，可依据ICAM1的表达区分小动脉内皮细胞与窦状内皮细胞。对中央区和骨内膜区骨髓组织中动脉性和窦状骨髓内皮细胞的定量分析显示，动脉性骨髓内皮细胞在骨内膜区域更为丰富，而窦状结构则更多见于中央骨髓区域。在获取灌洗骨髓时，通过骨中央部分内腔的含2%FBS的PBS的体积或次数不应超过所述指示量。将本方法与经表型分析的细胞群体的功能检测相结合，可进一步提供有关在研究条件下这些细胞群体可能发生的改变的宝贵信息。本方案可实现对骨内膜区和中央骨髓中造血细胞的差异性表型分析，使研究人员能够探究在这些特定骨髓区域中可能特异性发生的造血功能紊乱。

flow-cytometry-analysis-murine-bone-marrow-hematopoietic-stem

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

小鼠骨髓造血干细胞和祖细胞以及基质生态位细胞的流式细胞术分析

本文介绍了一种通过流式细胞术分析骨髓造血祖细胞分布的方法，以及高效分离高纯度造血干细胞（HSCs）的技术。该分离流程主要基于对c-Kit+细胞的磁珠富集，再通过细胞分选来纯化HSCs，用于细胞和分子水平的研究。...

小鼠造血干细胞及谱系定向祖细胞的表型分析与分离

本文介绍了一种对骨髓组织学数据进行定量分析的策略。通过对组织切片中荧光标记细胞进行共聚焦显微镜成像，获得二维图像，并对其进行自动分析。通过将不同细胞类型的共定位分析结果与模拟图像数据进行比较，可获得有关细胞间相互作用的定量信息。...

未脱钙骨组织切片中造血细胞与基质细胞相互作用的自动化定量分析

我们展示了如何利用磁珠分选与荧光激活细胞分选技术（MACS 和 FACS）相结合的方法，从小鼠骨髓中鉴定并分离出 6 个髓系祖细胞亚群。该方案可用于 体外 培养实验（甲基纤维素培养或液体培养） 体内...

从小鼠骨髓中鉴定与分离寡能性及谱系定向的髓系祖细胞

我们描述了一种利用多参数流式细胞术检测小鼠健康造血干细胞和祖细胞（HSPCs）以及由MLL-AF9驱动的急性髓系白血病（AML）小鼠模型中白血病细胞线粒体活性氧（ROS）的方法。...

小鼠造血干细胞与祖细胞及MLL-AF9驱动型白血病中线粒体活性氧的流式细胞术分析

本文介绍了一种处理从小鼠或人新鲜骨髓（BM）中分离的中性粒细胞谱系细胞的实验方案，用于高维质谱流式细胞术（飞行时间质谱流式细胞术，CyTOF）分析。...

中性粒细胞谱系细胞的全骨髓样本制备用于质谱流式分析

本文介绍了一种通过流式细胞术对小鼠腹膜、脾脏和骨髓组织中免疫B细胞区室异质性的简单分析方法。该方案可适用于并扩展至其他小鼠组织。...

小鼠B细胞发育的流式细胞术表征

本文介绍一种新型的流式细胞术方法，可直接从新鲜的小鼠骨髓和脾脏中前瞻性分离早期红系爆式集落形成单位（BFU-e）和红系集落形成单位（CFU-e）前体细胞。该实验方案基于单细胞转录组数据开发，是首个能够以高纯度分离出全部组织中红系前体细胞的方法。...

通过流式细胞术从小鼠组织中鉴定与分离红系爆式形成单位和集落形成单位祖细胞

本文介绍了一种基于流式细胞术的技术，可同时测量细胞分裂次数、细胞表面表型以及细胞间的亲缘关系。这些特性可通过基于置换的统计框架进行检验。...

同时评估亲缘关系、分裂次数和表型 通过 造血干细胞与祖细胞的流式细胞术

本文提供了一种详细的实验方案，用于从小鼠模型中分离和表征骨髓增生异常综合征及急性髓系白血病的骨髓微环境细胞群体。该技术可识别疾病进展过程中非造血性骨髓微环境（包括内皮细胞和间充质基质细胞）的变化。...

识别骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病中的骨髓微环境细胞群

本文介绍了可从鼠骨、骨髓、胸腺及人胸腺组织中分离基质细胞的实验方案，这些方案适用于单细胞多组学分析。...

造血器官中基质细胞的分离

本方案描述了一种经济高效的方法，用于纯化、扩增和表征小鼠来源的高度均一的骨髓间充质干细胞（BMSCs）。该方法有助于获得大量具有高增殖和分化潜能的BMSCs，可支持小鼠模型研究并推动临床前研究的进展。...

小鼠骨髓间充质干细胞的分离、扩增及基于流式细胞术的表型分析

学习使用流式细胞术分析小鼠骨髓造血干细胞、祖细胞及基质生态位细胞的方法。该技术可区分骨内膜和中央骨髓区域，为研究造血微环境扰动提供重要工具。

小鼠骨髓造血干细胞与祖细胞及基质微环境细胞的流式细胞术分析

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