一种可扩展的基于细胞的功能性评估 Ube3a 变异体的方法

我们的方法为快速理解 Ube3a 基因变异的功能影响提供了途径。Ube3a 是一种泛素连接酶，其突变可导致天使综合征（Angelman syndrome），并与一种称为 Dup15q 综合征的遗传性自闭症密切相关。传统上，泛素连接酶活性的表征过程费时费力，且难以适用于对已发现的数百种 Ube3a 变异体进行系统性分析。天使综合征由母源 Ube3a 基因缺失引起，而 Dup15q 综合征则由母源 Ube3a 基因重复所致。因此，明确错义变异如何改变 Ube3a 酶活性至关重要，而这一目标若不通过实验逐一检测每种变异体，则难以实现。

演示该实验步骤的是我实验室的研究技术员 Jalin Stelzer。首先，按照文稿中所述方法，在37摄氏度、5%二氧化碳、湿度充足的培养环境中，使用杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培养 HEK293T 细胞。在生物安全柜中，将悬浮的 HEK293T 细胞接种至经组织培养处理的96孔平底培养板中，于37摄氏度孵育过夜。

第二天，在生物安全柜中用萤光素酶和海肾荧光素酶报告质粒以及Ube3a质粒对细胞进行转染，每组设三个重复。每孔总体积为10微升。在1.5毫升微量离心管中为每种变异体制备转染用的总混合液，室温孵育15分钟。

孵育后，轻轻敲击离心管使转染混合物混匀，然后直接向孔中的现有培养基中加入10微升转染混合物。随后将细胞放回培养箱，使质粒表达48小时。使用荧光显微镜通过GFP荧光监测转染效率。

转染48小时后，应有超过80%的细胞表达GFP。小心吸除转染后的HEK293T细胞培养液，然后用预冷的PBS洗涤细胞。吸除PBS。

加入 25 µL 非变性裂解缓冲液以裂解细胞，冰上轻轻摇动孵育 15 分钟。然后，取 20 µL 裂解产物加入新的 96 孔检测板中，该检测板内含有 100 µL 萤光素酶底物试剂，通过轻敲混匀反应板。将检测板放入酶标仪，使用顶部检测器测量发光信号，检测高度为 1 mm，积分时间为 1 秒。

在读取萤火虫荧光素酶发光信号后，立即向各孔中加入 100 微升海肾荧光素酶底物，以淬灭萤火虫荧光素酶活性，同时检测海肾荧光素酶活性。通过轻微振荡培养板混匀样品，再次测量发光信号以评估海肾荧光素酶活性。通过定量报告基因反应，并将各变异体的萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶数值相对于野生型 Ube3a 进行归一化，比较不同变异蛋白的相对活性。

转染了编码野生型 Ube3a 质粒且质粒量递增的 HEK293T 细胞显示出 BAR 反应的线性增加。BAR 检测可识别与疾病相关的质粒变异体，表明该方法的准确性和普适性。对 152 种 Ube3a 变异体进行的 BAR 检测筛选结果显示，相对于野生型 Ube3a，存在良性的功能丧失和功能获得突变。

在Ube3a蛋白的第588位点，谷氨酸取代导致功能获得，脯氨酸取代和另一精氨酸取代导致功能丧失，这三种突变产生了截然不同的效应，凸显了对变异体进行实证评估的重要性。热图显示了Ube3a第588位点全面突变分析的标准化BAR结果。白色区域代表野生型Ube3a的活性水平，蓝色区域表示功能丧失型突变，红色区域表示功能获得型突变。

除了本研究的临床意义之外，Ube3a 还属于泛素连接酶中的 HECT 结构域家族，该家族均具有保守的 HECT 催化结构域。我认为本研究的一个引人入胜之处在于，它提供了关于 Ube3a 的丰富结构与功能数据，这些数据可用于深入理解此类酶的作用机制。