通过实时 FRET 显微镜和免疫荧光评估早期斑马鱼 Noonan 综合征模型中 ERK 活性调节的有效方案
2025年5月2日
RASopathies 是由 RAS-MAPK 通路过度激活引起的多系统遗传综合征。等待验证的潜在致病性变异不断出现，而临床前证据不佳限制了治疗。在这里，我们描述了我们的 体内 方案，通过 青少年报告斑马鱼的实时 FRET 成像来测试和交叉验证 RASopathy 相关的 ERK 激活水平及其胚胎发生过程中的药理学调节。
我们生成复杂发育疾病的斑马鱼模型，将患者测序与功能基因组学联系起来，支持变异解读及临床前药物检测。尽管FRET传感器有所改进，但能够检测到Ras-MAPK信号细微致病变化且时空敏感度高的强有力体内检测仍然不足。首先，将含有E3培养基中模制的2%琼脂糖的定制微注射板放置在工作平台上。
将受精的斑马鱼卵在培养盘中排列并对齐，以限制微注射过程中卵的移动。用微型装载移液器将两微升注射材料反装入针头。根据针头和胚胎的质量调整压力和时间设置，校准每次注射。
将溶液注入斑马鱼胚胎的单细胞阶段。在受控饲养条件下饲养微注射的青少年胚胎。在沉积后三小时内清理任何看起来浑浊或退化的卵。
受精后约四小时，使用标准荧光立体显微镜，波长范围为465至500纳米。筛查胚胎以检测荧光报告表达。选择青少年阳性鱼进行FRET影像，阴性兄弟姐妹保留免疫组化评估。
将数量相等的胚胎池放入六孔板的不同孔中。开始治疗时，将胚胎浸入含有载体对照的三毫升E3培养基中，作为DMSO或稀释的MEK以所需浓度进行。首先，将1.5%到2%低熔点的琼脂糖分项液在50摄氏度的热搅拌机中熔化。
溶解后，将温度降至约30摄氏度。将单个注射的青少年阳性胚胎置于35毫米玻璃底盘中央进行实时成像。去除多余的E3培养基，加入一滴低融琼脂以固定胚胎。
让琼脂糖在室温下聚合。在采集前至少一小时打开孵化器控制器，并将温度设为28摄氏度以维持胚胎健康。孵化箱稳定后，将装有胚胎的成像盘放在样本架上，使用10倍干物镜观察样本。
打开氩离子激光器，将激光功率调整为50%。在硬件设置中，选择八位深度分辨率以获取图像。接下来，在采集面板中选择光谱检测模式xy、γ、λ、z扫描模式，并将格式图像设置为512×512像素，扫描速度为400赫兹，光学变焦为0.75。激活氩离子激光器的458纳米激光线，并将其强度设为8.5%，然后选择混合探测器，并将灵敏度设为500。
在检测器栏下拉菜单中选择青色荧光蛋白或ECFP发射曲线。要显示YPET发射曲线，启动第二个探测器。然后选择黄色荧光蛋白YFP发射曲线。
要开始实时采集，将检测光标置于最强的YFP信号范围内，以可视化样品。在Z-Stack LASX窗口中设置样品厚度的起始和结束位置。将伽马扫描范围属性设置为从460纳米开始，到570纳米为检测范围结束。
定义检测带宽为5纳米，扫描步长为5纳米。开始Z-stack采购。在配置窗口中的染料数据库中插入并保存两个CFP和YFP的适配参考发射光谱，以排除光谱透透。
从成像会话中选择生成的光谱图像文件，并打开过程窗口。接下来，在染料分离工具中选择光谱染料分离，并配置染料分离的设置。在对话框左侧的下拉列表中，选择新的CFP发射谱（位于第一位置）和新的YFP发射谱，从谱数据库中选择新的YFP发射谱。
在伽马扫描中，识别信号强度最高的图像。然后沿Z扫描移动，选择突出边缘区感兴趣区域的光学部分。在动物极的边缘区激活ROI选择模式，以确定光谱最优的区域。
点击显示窗口中的ROI准星，在测量区域将参考ROI的大小调整为40个体素。打开包含两个分开通道的新生成文件。利用最大强度投影从三维图像序列中生成二维投影图像。
在“进程”窗口中，选择裁剪，将通道分成两个独立文件，分别是通道一和通道二。在进程窗口中，选择“合并图像”，然后选择通道二文件，插入第一个选项。然后选择通道一文件，插入第二个选项。
设置一个基于五倍的重标，并选择比率作。点击应用以生成包含比率度量图像的新文件。保存文件以便数据分析。
将光谱成像和染料分离图像文件导入开源的斐济软件进行分析。使用“分析与设置测量”配置斐济的读出测量参数。选择面积、积分密度和平均灰值作为感兴趣的参数。
使用工具栏中的多边形选择工具，选择对应于小胃径边缘的感兴趣区域。依次点击分析、工具和投资回报率经理，保存投资回报率与相关规范。要在选定的投资回报率中进行测量，请点击“分析与测量”。
在工作表中组织每个投资回报率（CFP）值，实验组列为列，原始值为行。对于单次生物复制，创建一个带有一个分组变量的列表，每个组由一列定义。胃体发育结束时，将胚胎浸泡在PBS中制备的4%对外醛中，室温下20分钟固定胚胎。
固定后，用PBS多次清洗胚胎。使用牧师移液器，将胚胎侧向定位于含有新鲜PBS的12孔板的单一孔中。使用配备2.7倍放大率物镜、0.63倍扫描物镜和8.6倍变焦因子的立体显微镜，在明场模式下捕捉图像，以评估椭圆形的存在。
将捕获的胚胎图像导入斐济软件。要测量胚胎轴的长度，请从工具栏中选择直线工具，点击“分析”，然后点击“测量”。完成选定测量后，将其添加到ROI管理器列表，并保存ROI文件。
将数据导出为工作表。通过将长轴长度除以短轴长度来计算轴的比值。计算平均值、均值的标准差或不同复制次均值的标准误。
我们在斑马鱼中的活FRET管线实现了对致病ERK信号激活的早期敏感检测，支持变异解读和MEK抑制剂效率测试。
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概述
本研究利用斑马鱼的体内协议，通过活体FRET成像来研究RAS病相关的ERK激活水平。该方法旨在验证致病变异并评估胚胎发生期间的药理调控。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 遗传学
- 发育生物学
背景
- RAS病是与RAS-MAPK通路过度激活相关的遗传综合征。
- 新出现的变异需要验证以开发有效的治疗方法。
- 当前的临床前证据有限，需要改进的模型。
- 活体FRET成像为研究体内ERK激活提供了一种新的方法。
研究目的
- 在斑马鱼中测试RAS病相关的ERK激活水平。
- 验证与RAS病相关的潜在致病变异。
- 探索胚胎发生期间的药理调控。
所用方法
- 为复杂的发育性疾病生成斑马鱼模型。
- 将患者测序数据与功能基因组学联系起来。
- 用定制材料微注射受精的斑马鱼卵。
- 利用FRET传感器检测Ras-MAPK信号变化。
主要结果
- 成功对齐和注射斑马鱼卵以保证实验一致性。
- 展示了在检测ERK激活方面的时空敏感性。
- 验证了体内检测致病变化的方法。
- 潜在改进临床前药物测试方法。
结论
- 该研究为研究RAS病提供了一个强有力的框架。
- 活体FRET成像是实时分析信号通路的有前景的工具。
- 未来的研究可以在这些发现的基础上改进治疗策略。
常见问题
Executive Industry Relevance
Rapid in vivo assessment of ERK activity modulation in zebrafish enables early-stage functional validation of RASopathy-associated variants, directly supporting target validation and mechanistic de-risking in rare disease pipelines. The protocol's integration of live FRET imaging and immunofluorescence provides quantitative, reproducible outputs essential for preclinical evaluation of pharmacological modulators. This scalable approach enhances predictive confidence and accelerates variant triage for portfolio advancement in genetic disease research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of RAS-MAPK pathway variants in a live vertebrate system.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying ERK signaling changes linked to pathogenic mutations.
- Facilitates rapid triage of candidate variants for downstream therapeutic exploration.
Screening & Assay Development
- Provides a validated, quantitative readout of ERK activity for assay standardization.
- Delivers reproducible FRET-based measurements suitable for pharmacological screening of MEK inhibitors.
- Supports scalability and platform reuse in cost-effective zebrafish models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns early functional outputs with disease-relevant phenotypes for translational continuity.
- Enables preclinical assessment of drug repositioning candidates in a whole-organism context.
- Reduces biological risk by linking molecular activity to morphometric outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol bridges early discovery and preclinical validation by enabling real-time ERK activity measurement and pharmacological testing in zebrafish embryos.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and variant interpretation through live ERK activity quantification.
- Screening: Establishes assay readiness and reproducibility for MEK inhibitor evaluation.
- Analytics: Provides ratiometric FRET and morphometric data for robust statistical comparison.
- Translational Research: Connects molecular signaling changes to phenotypic outcomes relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for diverse RASopathy and pathway-targeted studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in variant pathogenicity and drug response.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible in vivo assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and reduces late-stage biological uncertainty.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic targets and therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish microinjection and live imaging techniques.
- Needs access to multispectral FRET-capable confocal microscopy and image analysis software.
- Demands cross-team standardization of imaging and data analysis protocols.
- Adaptation may be needed for different genetic backgrounds or pathway targets.
- Throughput is limited by embryo handling and imaging capacity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:30
Microinjection and Treatment of Zebrafish Embryos for FRET Imaging and MEK Inhibition Assays
2:13
Live Multispectral FRET Imaging of RASopathy Zebrafish Models
4:57
Postprocessing and Dye Separation for Ratiometric FRET Imaging
7:03
Quantitative Analysis of FRET Signals and Image Rendering
8:14
Assessment of Morphological Phenotypes and Image Analysis in Zebrafish Embryos
9:41
Conclusion
