Name: 通过实时 FRET 显微镜和免疫荧光评估早期斑马鱼 Noonan 综合征模型中 ERK 活性调节的有效方案 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学习利用实时FRET显微镜和免疫荧光技术，在斑马鱼胚胎中检测RAS通路相关ERK活性变化，验证致病性变异并评估MEK抑制剂药效。该方法为发育生物学和遗传学研究提供了高时空分辨率的活体分析工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

我们感谢荷兰乌得勒支Hubrecht研究所的Jeroen den Hertog博士慷慨提供了pCS2+_eGFP-2a-Shp2a质粒，我们从中提取了shp2的全长CDS以构建所使用的质粒模板7。我们感谢奈良先端科学技术大学院大学（Takaaki Matsui）和日本国立遗传学研究所（NIG/ROIS）（Koichi Kawakami）提供了转基因Teen报告基因品系。本研究得到了意大利卫生部2021年和2024年常规研究基金以及青年研究人员定向研究基金GR-2019-12368907（AL）；2019年常规研究基金、PNRRMR1-2022-12376811、2019年5x1000项目、AIRC（IG-21614和IG-28768）以及LazioInnova（A0375-2020-36719）（MT）的资助。

<ol><li>Iroegbu, J. D., Ijomone, O. K., Femi-Akinlosotu, O. M., Ijomone, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK%2FMAPK+signalling+in+the+developing+brain%3A+Perturbations+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Biobehav+Rev%22%5BJournal%5D)">ERK/MAPK signalling in the developing brain: Perturbations and consequences.</a> Neurosci Biobehav Rev. 131, 792-805 (2021).</li>
<li>Tartaglia, M., Aoki, Y., Gelb, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+genetics+of+RASopathies%3A+An+update+on+novel+disease+genes+and+new+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet+C+Semin+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">The molecular genetics of RASopathies: An update on novel disease genes and new disorders.</a> Am J Med Genet C Semin Med Genet. 190 (4), 425-439 (2022).</li>
<li>Tate, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COSMIC%3A+the+catalogue+of+somatic+mutations+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">COSMIC: the catalogue of somatic mutations in cancer.</a> Nucleic Acids Res. 47 (D1), D941-D947 (2019).</li>
<li>Tartaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+PTPN11%2C+encoding+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2%2C+cause+Noonan+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome.</a> Nat Genet. 29 (4), 465-468 (2001).</li>
<li>Jopling, C., van Geemen, D., den Hertog, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shp2+knockdown+and+Noonan%2FLEOPARD+mutant+Shp2-induced+gastrulation+defects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Shp2 knockdown and Noonan/LEOPARD mutant Shp2-induced gastrulation defects.</a> PLoS Genet. 3 (12), e225(2007).</li>
<li>Wong, K. -L., Akiyama, R., Bessho, Y., Matsui, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK+activity+dynamics+during+zebrafish+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">ERK activity dynamics during zebrafish embryonic development.</a> Int J Mol Sci. 20 (1), 109(2019).</li>
<li>Fasano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+FRET-based+Teen+sensor+to+monitor+ERK+activation+changes+preceding+morphological+defects+in+a+RASopathy+zebrafish+model+and+phenotypic+rescue+by+MEK+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Assessment of the FRET-based Teen sensor to monitor ERK activation changes preceding morphological defects in a RASopathy zebrafish model and phenotypic rescue by MEK inhibitor.</a> Mol Med. 30 (1), 47(2024).</li>
<li>Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+imaging+and+linear+un-mixing+enables+improved+FRET+efficiency+with+a+novel+GFP2-YFP+FRET+pair%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair.</a> FEBS Lett. 531 (2), 245-249 (2002).</li>
<li>Sari, D. W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+observation+of+stepwise+regression+of+Erk+activity+in+zebrafish+presomitic+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Time-lapse observation of stepwise regression of Erk activity in zebrafish presomitic mesoderm.</a> Sci Rep. 8 (1), 4335(2018).</li>
<li>Wang, H., Li, J., Xue, T., Cheng, N., Du, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+series+of+pCS2%2B+backbone-based+Gateway+vectors+for+overexpressing+various+tagged+proteins+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Construction of a series of pCS2+ backbone-based Gateway vectors for overexpressing various tagged proteins in vertebrates.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 48 (12), 1128-1134 (2016).</li>
<li>Abdelrahman, D., Hasan, W., Da'as, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+quality+control+in+zebrafish+model+for+genetic+manipulations%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Microinjection quality control in zebrafish model for genetic manipulations.</a> MethodsX. 8, 101418(2021).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. (27), e1113(2009).</li>
<li>Rossant, J., Nutter, L. M. J., Gertsenstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Engineering the embryo.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (19), 7659-7660 (2011).</li>
<li>Jindal, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+severity+ranking+of+Ras+pathway+mutations+associated+with+developmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In vivo severity ranking of Ras pathway mutations associated with developmental disorders.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 114 (3), 510-515 (2017).</li>
<li>Leavesley, S. J., Rich, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+lmitations+of+FRET+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Overcoming lmitations of FRET measurements.</a> Cytometry A. 89 (4), 325-327 (2016).</li>
<li>Mascha, E., Vetter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance%2C+errors%2C+power%2C+and+sample+size%3A+Theblocking+and+tackling+of+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Significance, errors, power, and sample size: Theblocking and tackling of statistics.</a> Anesth Analg. 126 (2), 691-698 (2018).</li>
<li>Faul, F., Erdfelder, E., Lang, A. -G., Buchner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G%2APower+3%3A+a+flexible+statistical+power+analysis+program+for+the+social%2C+behavioral%2C+and+biomedical+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Res+Methods%22%5BJournal%5D)">G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences.</a> Behav Res Methods. 39 (2), 175-191 (2007).</li>
<li>Cohen, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCohen%2C+J+%22Statistical+power+analysis+for+the+behavioral+sciences%22">Statistical power analysis for the behavioral sciences</a>. , Routledge. New York. (1988).</li>
<li>Anastasaki, C., Rauen, K. A., Patton, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continual+low-level+MEK+inhibition+ameliorates+cardio-facio-cutaneous+phenotypes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Continual low-level MEK inhibition ameliorates cardio-facio-cutaneous phenotypes in zebrafish.</a> Dis Model Mech. 5 (4), 546-552 (2012).</li>
</ol>

尽管数十年的研究已发现大量突变，导致如今已明确多种高度异质性的RASopathies亚型，但在对尚未确诊的患者进行测序时，仍不断出现意义未明的遗传变异。实际上，在许多情况下，仅依靠临床特征进行诊断具有挑战性，因此仍需依赖功能基因组学方法来验证测序结果。此外，尽管已有部分抗癌药物（例如&#160;MEK抑制剂）被提议用于治疗部分RASopathies，并且已出现一些成功的案例，但目前仍缺乏广泛共识。这主要是由于大多数现有药物缺乏充分的临床前证据支持，包括在儿童患者中使用强效抗癌药物时的有效剂量和治疗窗也尚不明确。
动物模型中的功能分析是疾病亚型分类、患者分层以及药物初步评估的重要步骤。斑马鱼可作为用于验证导致儿童疾病（包括RASopathies）的潜在致病性变异体功能的高效体内模型14。目前针对与RASopathy相关变异体影响的表型评估已有先进方法，适用于斑马鱼RASopathy模型，主要依赖形态学指标——即在原肠胚形成结束时测量胚胎体轴的&#34;卵形测试&#34;。然而，与ERK激活的相关性分析通常仍主要通过标准...

RAS病是一类影响正常发育并累及多种器官和组织的遗传综合征。这些疾病通常由RAS/MAPK信号通路中关键基因的种系功能获得性（GoF）突变所致，导致细胞外信号调节激酶（ERK）的过度活化（磷酸化水平升高）。ERK通过转入细胞核来调控发育过程中的某些基本过程——如组织生长-1,2。RAS-MAPK通路相关基因的体细胞突变是导致癌症最常见的事件3。因此，RAS病患者同样表现出癌症易感性并不令人意外。努南综合征（Noonan syndrome, NS）是RAS病中最常见的类型，其特征为发育迟缓、身材矮小、程度不一的认知缺陷以及心肌病2。在大多数病例中，该疾病由PTPN11基因的功能获得性突变引起，该基因于2000年代初首次被发现，是第一个被确认的RAS病相关基因4，编码蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2，后者作为该信号通路的正向调控因子发挥作用。
自那时以来，由于外显子组测序技术在未确诊患者中的广泛应用，不断发现影响RAS-MAPK通路相关因子的潜在致病性变异，这些变异可能与多种RASopathies疾病相关，但仍需进行功能表征，以实现对患者的高效分层2。为实现这一目标，亟需能够在整体生物水平上快速且信息丰富的实验方案，以进行功能验证。若采用经典且标准化的哺乳动物模型来检测意义未明的变异，将耗费高昂、耗时极长，并需要在不透明的大型动物中实施侵入性方法。鉴于目前大量RASopathies患者因诊断不足或未诊断而缺乏有效管理和治疗，给社会带来沉重负担，此类策略显然无法满足快速检测的需求。针对完整生物体中关键表型特征及其分子相关指标的定量评估方案，还将有助于加快现有药物在RASopathies患者中的临床转化，实现药物的再利用或重新定位。
斑马鱼是研究影响早期发育疾病的理想脊椎动物模型。首先，斑马鱼与人类具有高度的基因同源性。成年斑马鱼繁殖力高，可产生大量体型小且发育迅速的胚胎。胚胎在早期阶段具有透明性，使得主要的发育过程-表皮层扩展、原肠胚形成、轴向确定和体轴模式建立等过程均可通过标准显微镜技术轻松观察。此外，现有多种转基因品系可用于在发育过程中实时、原位追踪特定细胞行为和动态分子事件，结合先进的遗传模型构建技术，其优势无可比拟。此外，斑马鱼的表型读出可在多个层次进行评估（从整体生物体到细胞水平的缺陷），且已有多种针对特定疾病的专用检测方法建立，包括RASopathies相关疾病。5此外，对于水溶性化合物而言，在早期阶段采用相对简单的浸浴式给药方法，至少可实现高通量药物筛选。 体内 以96孔板格式。
从分子角度来看，采用免疫组织化学和免疫印迹等标准方法的研究有力地证明了ERK激活与鱼类胚胎中RAS病相关发育缺陷之间的关联6,7。近年来开发的斑马鱼EKAR型FRET生物传感器（Tg[ef1a:ERK biosensor-nes], Teen）提供了一种可靠的体内工具，能够以时空分辨的方式记录胚胎发生过程中的ERK激活。因此，该工具可用于更准确地评估RAS病鱼类模型中ERK动态变化及药物干预效应。
在&#160;的 青少年 传感器中，报告基因的特定ERK底物会在ERK激活时被磷酸化，从而引发构象变化，使荧光CFP供体（D）与荧光Ypet（改良型YFP）受体（A）相互靠近。当D的发射光谱与A的吸收光谱显著重叠时，即可发生FRET（能量从D向A转移）。该过程与D和A之间的距离成正比，因此在Teen中可反映ERK的激活状态。可利用普通或共聚焦显微镜的标准及高级成像模块，针对活体或固定样本建立多种成像方案。在激发D后，沿CFP至YFP的特定发射光谱范围（λ）进行多光谱扫描采集，随后进行光谱分析 &#34;解混&#34; 算法是注册和量化FRET数据最可靠的方法之一8也可应用于活体斑马鱼样本以进行记录 体内 组织动力学
根据先前的报道6,9以及我们最近的研究应用7，本文详细描述了利用Teen鱼在原肠胚形成初期检测NS模型动物极边缘细胞中ERK激活的逐步操作流程，并将其与发育后期才显现的典型体轴缺陷进行关联分析。我们展示了如何在使用可获得的MEK抑制剂处理前后，从活体NS原肠胚中获取并分析定量的FRET数据，以及如何&#160;通过针对磷酸化（活性）ERK的标准免疫组织化学方法对结果进行交叉验证，或对胚胎伸长缺陷进行相关的形态计量学分析。
该工作流程可用于促进对新出现的变异体和假定与RASopathies相关的疾病基因进行功能检测，并有助于深入了解在脊椎动物发育过程中ERK激活动态在空间和时间上的相关性及其与胚胎形态缺陷的关系。我们证明，该方案还可用于评估候选药物在调节ERK激活方面的有效性。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;塑料器皿&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.7 L 繁殖缸 - 沙滩式设计</td><td>Tecniplast</td><td>1.7L SLOPED</td><td>繁殖缸</td></tr><tr><td>毛细管 GC100F-10</td><td>Harvard apparatus</td><td>30-0019</td><td>单细胞期胚胎显微注射</td></tr><tr><td>细胞与组织培养板 - 12 孔</td><td>BIOFIL</td><td>TCP011012</td><td>胚胎收集与处理</td></tr><tr><td>细胞与组织培养板 - 6 孔</td><td>BIOFIL</td><td>TCP011006</td><td>胚胎收集与处理</td></tr><tr><td>细胞培养皿</td><td>SPL Life Sciences</td><td>20100</td><td>胚胎收集&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc 玻璃培养皿 12 mm</td><td>Thermo Fisher</td><td>150680</td><td>胚胎 FRET 光谱成像</td></tr><tr><td>巴斯德移液管</td><td>Corning</td><td>357524</td><td>胚胎转移</td></tr><tr><td>蛋白抗吸附管 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30108450</td><td>免疫组化检测</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂及其他&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>鱼子粒径 500–800 &amp;micro;m</td><td>Rettenmaier Italia</td><td>BE2269 (500-800)</td><td>干燥鱼类饲料</td></tr><tr><td>大盐湖蓝卤虫卵囊</td><td>Sanders</td><td>00004727</td><td>活体鱼类饲料</td></tr><tr><td>Instant Ocean 海盐</td><td>Tecniplast</td><td>XPSIO25R</td><td>活体饲料制备用脱水海盐</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Tg(EF1a:ERK Biosensor-nes) (Teen)&lt;/em&gt;</td><td>订购联系方式*：&lt;br/&gt; 日本国立生物资源计划斑马鱼项目，理化学研究所脑科学中心资源开发支援部门。https://shigen.nig.ac.jp/zebra/index_en.html &lt;em&gt;*需签署材料转让协议（MTA）。&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td>-</td><td>ERK 报告基因斑马鱼品系供应商。签署材料转让协议（MTA）后，可从日本斑马鱼国家生物资源计划（理化学研究所，日本）获取鱼胚胎。该斑马鱼品系由奈良先端科学技术大学院大学（松井贵明）和日本遗传学研究所（NIG/ROIS）（河上晃一，Tol2 系统专利）提供（Wong 等，2018；Urasaki 等，2006；Okamoto 与 Ishioka，2010）。</td></tr><tr><td>6x 上样缓冲液</td><td>Cell Signaling</td><td>B7024S</td><td>凝胶电泳</td></tr><tr><td>100 bp DNA 标准分子量标记</td><td>NEB</td><td>N3231S</td><td>凝胶电泳</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1,01,236</td><td>凝胶电泳</td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414-10G</td><td>FRET 光谱成像与免疫组化检测中的胚胎封片</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8022</td><td>免疫组化检测</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td>E3 培养基组分</td></tr><tr><td>硝酸钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237124</td><td>Danieau 储存液组分</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>免疫组化检测</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>凝胶制备用 TBE 缓冲液组分</td></tr><tr><td>乙醇 99%+</td><td>Fisher Scientific</td><td>10048291</td><td>体外 RNA 纯化</td></tr><tr><td>16% 甲醛</td><td>Thermo Fisher</td><td>28908</td><td>胚胎固定</td></tr><tr><td>甲酰胺&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td>凝胶电泳</td></tr><tr><td>凝胶上样缓冲液 II（变性 PAGE）</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM8546G</td><td>体外 RNA 转录</td></tr><tr><td>冰乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td>凝胶制备用 TBE 缓冲液组分</td></tr><tr><td>甘油&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279-1L</td><td>免疫组化检测</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td>免疫组化检测</td></tr><tr><td>山羊抗兔 Alexa Fluor 633</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21070</td><td>免疫组化检测</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Danieau 储存液组分</td></tr><tr><td>KpnI - HF（酶 + rCutSmart 缓冲液）</td><td>NEB</td><td>R3142</td><td>质粒线性化&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>E3 培养基组分 / Danieau 储存液组分</td></tr><tr><td>Millennium RNA 标记物</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM7150</td><td>凝胶电泳</td></tr><tr><td>Monarch 基因组 DNA 纯化试剂盒</td><td>NEB</td><td>T3010L</td><td>质粒线性化&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>小鼠单克隆 p44/42 MAPK 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>4696S</td><td>免疫组化检测</td></tr><tr><td>mMACHINE SP6 转录试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1340</td><td>体外 RNA 转录</td></tr><tr><td>正常山羊血清（NGS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td>免疫组化检测</td></tr><tr><td>无核酸酶水 Ambion</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9937</td><td>体外 RNA 转录</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PZ0162</td><td>MEK 抑制剂</td></tr><tr><td>酚红溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>显微注射混合液组分&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>多聚 A 尾添加试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1350</td><td>体外 RNA 转录</td></tr><tr><td>高纯度氯化钾&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>E3 培养基组分 / Danieau 储存液组分 / PBS 储存液组分</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>PBS 储存液组分</td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308</td><td>免疫组化检测</td></tr><tr><td>兔多克隆磷酸化 p44/42 MAPK 抗体&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>4695S</td><td>免疫组化检测</td></tr><tr><td>SYBR safe DNA 凝胶染色剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>S33102</td><td>凝胶电泳</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434-M</td><td>E3 培养基组分 / Danieau 储存液组分 / PBS 储存液组分</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td>PBS 储存液组分</td></tr><tr><td>Trizma 碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>凝胶制备用 TBE 缓冲液组分</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>PBSTr 缓冲液组分</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alliance Mini HD9&amp;nbsp;</td><td>Uvitec</td><td>-</td><td>成像系统</td></tr><tr><td>Centrifuge 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000205</td><td>微量离心机</td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>-</td><td>胚胎封片&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FemtoJet 4x</td><td>Eppendorf</td><td>-</td><td>显微注射系统</td></tr><tr><td>Infinite M Plex&amp;nbsp;</td><td>Tecan</td><td>-</td><td>多功能酶标仪</td></tr><tr><td>Leica M205FA</td><td>Leica Microsystems</td><td>-</td><td>荧光体视显微镜</td></tr><tr><td>Leica TCS-SP8X（配备 OkoLab 培养箱）</td><td>Leica Microsystems</td><td>-</td><td>共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>Mini-sub Cell GT 水平电泳系统&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1704406</td><td>凝胶电泳</td></tr><tr><td>PC-100 垂直拉针仪</td><td>Narishige</td><td>-</td><td>玻璃微针拉制仪</td></tr><tr><td>PowerPac Universal 电源供应器</td><td>Bio-Rad</td><td>1645070</td><td>凝胶电泳</td></tr><tr><td>Stellaris 5&amp;nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>-</td><td>共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>Vortex MiniStar silverline</td><td>VWR</td><td>-</td><td>质粒制备</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biorender</td><td>Biorender</td><td>CC-BY 4.0 许可证</td><td>图示卡通绘制</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft Office Professional Plus 2019</td><td>-</td><td>数据分析</td></tr><tr><td>Fiji 软件</td><td>ImageJ</td><td>15.3t</td><td>图像处理与定量分析（FRET 信号测量、免疫组化检测中 ERK 荧光强度、胚胎轴长测量）</td></tr><tr><td>GraphPad Prism&amp;nbsp;</td><td>GraphPad Software LLC</td><td>v. 9</td><td>统计学数据分析</td></tr><tr><td>iControl 分光光度计软件</td><td>Tecan</td><td>v. 2.0</td><td>RNA 定量</td></tr><tr><td>Illustrator</td><td>Adobe</td><td>26.0.3 (64 位)</td><td>图像整合</td></tr><tr><td>LASX 软件</td><td>Leica Microsystems</td><td>v. 4.5 (Stellaris 5), v. 3.0 (M205FA), v. 3.5 (TCS-SP8X)</td><td>光谱 FRET 实验成像采集及用于轴长测量的胚胎成像</td></tr><tr><td>Q9 Mini 18.02-SN 软件</td><td>Uvitec</td><td>-</td><td>凝胶图像采集</td></tr></tbody></table>

一种通过活细胞fret显微镜和免疫荧光高效评估斑马鱼努南综合征早期模型中erk活性调控的实验方案

An Efficient Protocol to Assess ERK Activity Modulation in Early Zebrafish Noonan Syndrome Models via Live FRET Microscopy and Immunofluorescence

RASopathies 是由 ERK 过度激活引起的一类遗传综合征，可导致多系统疾病，并可能增加患癌风险。尽管该病具有广泛的遗传异质性，但大多数病例均由 RAS-MAPK 信号通路关键调控因子的生殖系功能获得性突变所致。得益于先进的测序技术，影响 RAS-MAPK 通路的潜在致病性变异仍在不断被发现。对这些变异致病性的功能验证对于准确诊断至关重要，需要快速且可靠的实验方案，最好在 体内 进行。鉴于幼儿期有效治疗手段有限，此类方案若能在具有成本效益的动物模型中实现规模化，将有望为药物重新定位/再利用提供重要的临床前研究基础。
本文逐步描述了在斑马鱼胚胎中快速建立瞬时RASopathy模型的方案，并通过实时多光谱Förster共振能量转移（FRET）成像，直接观察在原肠胚形成期间即已发生的与疾病相关的活体ERK活性变化。该方案采用了一种近期建立并已整合到商用显微镜硬件中的转基因ERK报告系统。我们以Noonan综合征（NS）斑马鱼模型为例，该模型通过表达Shp2D61G构建而成。我们介绍了一种简便的方法，可在药理学信号调节前后，记录NS鱼模型中ERK信号的变化，所用调节剂为现有低剂量MEK抑制剂。我们详细说明了如何在处理前后生成、获取和评估来自多光谱采集的比率型FRET信号，并通过早期整体胚胎的经典免疫荧光染色对结果进行交叉验证。随后，我们描述了如何通过检测标准形态计量学参数，分析同一胚胎在受精后6小时通过活体FRET评估ERK活性后出现的后期胚胎形态改变，这些改变提示原肠胚形成过程可能受到损伤。

本方案展示了一种简单的操作流程，可快速建立斑马鱼胚胎中的瞬时RAS病模型，并利用 recently established ERK斑马鱼传感器6,9，结合标准的活体FRET成像方法，检测早期突变体中ERK的动态变化。如近期研究所示6,7，在同一实验流程中，可通过针对磷酸化ERK和总ERK的标准免疫组化（IHC）在整体胚胎上对FRET结果进行交叉验证。在FRET检测所用的同一胚胎中，还可于后续发育阶段追踪体轴形成障碍与ERK激活增强之间的相关性7。本文展示了通过FRET记录到的早期原肠胚中典型的ERK波动，这些波动与导致努南综合征（NS）的Shp2D61G表达相关。此外，还收集了经低剂量MEK抑制剂（MEKi）处理后信号呈负向调控的突变体数据，该处理可抑制RAS/MAPK信号通路。
...

RAS病是一类由RAS-MAPK信号通路过度激活引起的多系统遗传综合征。随着大量潜在致病变异不断被发现，亟需对其进行功能验证，然而临床前证据的缺乏限制了治疗策略的开发。本文中，我们描述了一种在Teen-报告基因斑马鱼中通过活体FRET成像检测RAS病相关ERK活化水平及其在胚胎发育过程中药物调控作用的体内实验方案。

一种通过活细胞FRET显微镜和免疫荧光高效评估斑马鱼努南综合征早期模型中ERK活性调控的实验方案

RASopathies 是由 ERK 过度激活引起的遗传性综合征，可导致多系统疾病，并可能增加患癌倾向。

我们构建斑马鱼复杂发育性疾病的模型，将患者测序数据与功能基因组学相联系，以支持变异解读以及临床前药物测试。尽管FRET传感器已有改进，但仍缺乏具有足够时空敏感性的稳健体内检测方法，用于检测Ras-MAPK信号通路的细微致病性变化。首先，将含有模制2%琼脂糖的定制显微注射板置于E3培养基中，并放置于工作平台上。将受精的斑马鱼胚胎按适当的位置排列并固定在培养板的加样槽中，以限制其在显微注射过程中的移动。使用微量移液器向注射针头后部加载 2 µL 注射材料。根据显微注射装置上针头和胚胎的质量，调节压力和时间参数，以校准每次注射条件。将溶液注射到斑马鱼胚胎的单细胞期。在受控的饲养条件下培养显微注射后的胚胎。在受精后三小时内清除任何呈现浑浊或退化迹象的卵。受精后约4小时，使用标准荧光体视显微镜，在465至500纳米波长范围内观察胚胎的荧光报告基因表达。筛选出荧光阳性的幼鱼用于FRET成像，将阴性同胞幼鱼保留用于免疫组织化学分析。将数量相等的胚胎分组放入六孔板的不同孔中。开始处理时，将胚胎浸入含有溶剂对照（DMSO）或稀释后的MEK（目标浓度）的3毫升E3培养基中。首先，在ThermoMixer中将1.5%至2%的低熔点琼脂糖 aliquot 在50摄氏度下融化。溶解后，将温度降至约 30 摄氏度。将一枚注射过的 teen positive 胚胎置于 35 毫米玻璃底培养皿中央，用于活体成像。吸除多余的 E3 培养基，加入一滴低熔点琼脂糖以固定胚胎。在室温下使琼脂糖聚合。在采集图像前至少一小时打开培养箱控制器，并将温度设置为28摄氏度，以维持胚胎的健康状态。待培养箱温度稳定后，将含有胚胎的成像培养皿放置在样品支架上，使用10倍干镜物镜观察样品。打开氩离子激光器，并将激光功率调节至50%。在硬件设置中，选择8位深度分辨率以采集图像。接着，在采集面板中选择光谱检测xy、gamma、lambda、z扫描模式，设置图像格式为512×512像素，扫描速度为400赫兹，光学放大倍数为0.75。激活氩离子激光器的458纳米激光线，并将其强度值设为8.5%。然后选择混合探测器，并将其灵敏度设置为增益值500。在检测器栏中打开下拉菜单，选择青色荧光蛋白或ECFP发射曲线。如需显示YPET发射曲线，请激活第二个检测器，然后选择黄色荧光蛋白YFP发射曲线。开始实时采集时，将检测光标置于YFP信号最强的范围内以观察样品。在Z-Stack LASX窗口中设置样品厚度的起始和终止位置。将伽马扫描范围的检测属性设置为从460纳米开始，至570纳米结束。将检测带宽定义为5纳米，扫描步长设为5纳米。开始z轴层扫描采集。在配置窗口的染料数据库中插入并保存CFP和YFP的两种经调整的参考发射光谱，以排除光谱串扰。从成像会话中选择生成的光谱图像文件，并打开处理窗口。接着，在染料分离工具中选择光谱染料分离，并配

an-efficient-protocol-to-assess-erk-activity-modulation-early

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

通过实时 FRET 显微镜和免疫荧光评估早期斑马鱼 Noonan 综合征模型中 ERK 活性调节的有效方案

本视频展示了一种非侵入性检测方法，用于研究斑马鱼胚胎中运动神经元的电生理特性。通过测量胚胎尾部因脊髓运动神经元自发去极化而产生的卷曲活动，随后施加钠通道阻断剂以降低卷曲频率。接着，将胚胎固定在琼脂糖中，并置于荧光显微镜下观察。经基因工程改造的运动神经元表达一种带有供体和受体荧光团的电压感应生物传感器。受体荧光团发射信号的减弱表明，由于钠通道阻断剂的作用，运动神经元的自发去极化活动减少。...

一种非侵入性研究斑马鱼胚胎运动神经元电生理学的方法

斑马鱼现已成为研究肌营养不良症、先天性肌病及相关神经肌肉疾病的重要且强大的模型工具。双折射和触觉诱发逃逸行为是两种常用的非侵入性检测方法，用于评估斑马鱼胚胎在早期发育过程中肌肉结构紊乱和运动功能障碍的程度。...

通过双折射和触诱发逃逸反应检测分析斑马鱼幼虫骨骼肌缺陷

本文介绍了一种对斑马鱼胚胎中组织特异性荧光进行半自动化成像的实验方案。...

斑马鱼胚胎中组织特异性荧光的半自动化成像

我们介绍一种利用显微操作和视网膜电图（ERG）技术对斑马鱼幼鱼进行视网膜电图分析的方法。该方法简便直接，适用于检测斑马鱼幼鱼的视觉功能。 体内.

斑马鱼幼鱼视觉反应的视网膜电图分析

此处描述的实验方案通过采用斑马鱼胚胎，能够在最接近生理状态且侵入性最小的条件下研究可兴奋细胞的电学特性。 体内...

在活体斑马鱼胚胎中检测运动神经元膜电位

本文介绍了一种斑马鱼癫痫模型的建立与表征方案，该模型源于对DEPDC5基因的瞬时抑制。...

癫痫斑马鱼模型中的行为与生理学分析

本文描述了一种通过行为学方法简单测量成年斑马鱼应激反应的技术。该方法利用了斑马鱼在应激状态下倾向于停留在水箱下半部分的先天行为特征。我们还介绍了将该检测方法与药理学实验相结合的技术。...

研究斑马鱼先天应激的动物行为学方法

斑马鱼在细胞生物学和生理学研究中具有显著的光学透明优势。本文描述了在个体动物中测量细胞生长的可靠方法，这些方法能够提供新的见解，揭示骨骼肌及邻近组织的生长如何与整体身体生长相协调。...

对经历电活动改变的单条活体斑马鱼骨骼肌生长进行实时和重复测量

斑马鱼靶向反应性亲电体和氧化剂（Z-REX）是一种基于化学生物学的方法，用于研究反应性小分子信号传导。该技术可应用于不同发育阶段的活体斑马鱼。在此，我们将斑马鱼中的标准检测方法与Z-REX相结合，用于信号通路分析。...

监测斑马鱼幼虫中的靶向信号响应——Z-REX揭示亲电性药物与代谢物的精确作用机制

利用光遗传学手段调控信号通路，是研究发育、再生、稳态及疾病过程中信号如何被解码的一种强有力策略。本方案提供了在早期斑马鱼胚胎中使用基于光-氧-电压感应结构域的 Nodal...

斑马鱼胚胎中的光遗传学信号激活

本文介绍了一种详细的实验方案，利用共聚焦显微镜检测表达GCaMP钙指示剂的转基因斑马鱼脑区中神经活动的方法。...

体内 共聚焦荧光成像技术用于观察部分固定幼年斑马鱼在感觉刺激下诱导的神经活动

学习利用实时FRET显微镜和免疫荧光技术，在斑马鱼胚胎中检测RAS通路相关ERK活性变化，验证致病性变异并评估MEK抑制剂药效。该方法为发育生物学和遗传学研究提供了高时空分辨率的活体分析工具。

一种通过活细胞FRET显微镜和免疫荧光高效评估斑马鱼努南综合征早期模型中ERK活性调控的实验方案

探索更多视频