踝-距下复合关节不稳的小鼠模型

成功建立ASCJ踝关节不稳小鼠模型，拓展了一种简单的踝关节不稳动物模型，并为临床足部疾病的研究提供了新思路。我们已建立一种更符合实际临床情况的动物模型，可用于足部疾病诊断与治疗的进一步研究。实验前一周，对小鼠进行平衡木和步态训练，使其从平衡木或U形管的一端行进至另一端，过程中不得停留。

用麻醉剂麻醉小鼠右后肢踝关节并去除毛发后，使用碘伏棉签对暴露的皮肤进行消毒。将小鼠置于无菌手术垫上，转移至显微外科动物手术室。对于横韧带和距腓前韧带组，用手术刀在右踝关节上方皮肤做一条7毫米长的斜向下方纵行切口。

用显微直镊在踝关节前方进行探查，充分暴露距骨体下缘与腓骨之间的下距腓前韧带，用手术刀轻轻将其切断。分离腓骨长肌腱和腓骨短肌腱，以及趾长伸肌腱。

暴露颈韧带，并用手术刀将其切断。对于横行颈韧带联合三角韧带组，于右踝关节内侧皮肤做一8 mm的垂直切口，钝性分离三角韧带与内踝之间的连接，然后将其切断。随后按照前述方法切断颈韧带。

对于假手术组，在小鼠右踝关节处进行假手术操作。用无菌生理盐水冲洗切口后，使用5-0外科尼龙线缝合切口，再用碘伏棉签对缝合后的切口进行消毒。术后两周待踝关节肿胀减轻后，每天使用小鼠旋转式疲劳仪对小鼠进行一小时的运动训练。

进行平衡木实验时，使用三脚架夹具将一根圆形木制横梁的一端固定，并使其倾斜15度，另一端放置在与一个封闭暗盒相连的工作台面上。在手术前一周进行平衡木训练，以确保小鼠能够顺利地从横梁一端移动到另一端。当小鼠在60秒内无停顿地通过横梁两次时，视为通过测试。

每次试验后，用75%酒精喷洒平衡木，以消除前一只小鼠留下的残留气味对下一只小鼠的干扰。进行平衡木实验，记录每只小鼠连续两次通过平衡木的平均时间，以及右后肢从平衡木上滑落的次数，作为因变量。

进行足迹分析时，将U形塑料通道置于实验台上，并将塑料通道的一端连接至一个封闭的盒式装置。将一张白纸平放在通道内。然后用双手固定小鼠，将无毒的红色和绿色染料均匀地涂抹在小鼠的前足和后足上。

现在，将涂有颜料的小鼠放置在通道的一端，使其移动至盒体的另一端。取下带有脚印的着色滤纸，做好标记，并置于通风且避光的地方晾干。每只小鼠通过后，用75%酒精喷洒U形塑料通道，以防止前一只小鼠残留的气味影响下一只小鼠的行为。

在每张纸上选择三个连续清晰的小鼠脚印。使用直尺测量小鼠右脚脚印的步长，并测量左右脚印之间的步宽。使用显微镊子和剪刀去除踝关节标本周围多余的软组织。

然后，将标本放入含有10% EDTA脱钙液的离心管中，并标记不同组别。接着，将离心管置于摇床中进行脱钙。每天更换一次脱钙液，并检测标本的脱钙程度。

脱钙一个月后，用梯度酒精脱水标本，然后用正丁醇透明八小时。最后将透明后的标本浸入石蜡中，以冠状位包埋。切片前，将标本从4°C冰箱转移至-20°C冷冻柜中约10分钟，以利于完整切面的获取。

将标本固定在切片机上，切成六微米厚的切片。同时，使用显微镜观察样品是否已切至预期位置，以确保注射针头能够顺利穿入骨组织。连续切出两到三张完整的石蜡切片后，将其转移至设定为40摄氏度的展片台上，使其充分展开。

然后用载玻片移除石蜡切片。最后，用组别和编号标记载玻片，以便在显微镜下观察完整的ASCJ关节结构。

将切片置于60摄氏度的孵育箱中孵育40至50分钟。然后按照文稿中的描述，用二甲苯脱蜡三次。将脱蜡后的切片先后浸入100%乙醇中两次，每次3分钟，随后分别在90%和80%乙醇中各浸泡5分钟。

然后用双蒸水清洗切片5分钟。用苏木精浸泡1分钟后，再用双蒸水清洗切片，直至切片无色。将切片浸入1%酸性乙醇分化液中30秒，随后用双蒸水冲洗。

将切片用1%氨水溶液染色后，用双蒸水洗涤，再将样品放入伊红染色液中染色1分钟。然后依次将切片放入95%和100%乙醇中各1分钟。最后，用二甲苯处理切片4次，每次1分钟。

将切片风干后，在载玻片上的样本处滴加一滴中性树胶，盖上盖玻片。然后使用正置荧光显微镜在明场下以5倍和20倍物镜拍摄图像。将经苏木精和氨水染色的切片浸入0.05%快绿溶液中染色两分钟。

随后将切片浸入1%乙酸溶液中30秒，再浸入0.1%番红溶液中5分钟。然后按照之前所述方法，用乙醇和二甲苯处理载玻片。使用正置荧光显微镜在明场下以5X和20X放大倍数拍摄图像。

术后3天、8周和12周时，韧带切断组小鼠通过平衡木所需时间明显长于假手术组。术前，三组小鼠的右后肢步长相似。然而，术后12周，韧带切断组的步长短于假手术组。

术前，三组小鼠在活动期间足部的热伤害感受反应时间相似。术后，韧带切断组小鼠的反应时间较假手术组延长。韧带切断组小鼠右后足距下关节（ASCJ）显示关节面粗糙、骨赘积聚及退行性改变。

且骨体积分数显著高于假手术组。韧带切断组ASCJ的软骨层出现不连续，且软骨细胞数量减少。此外，韧带切除小鼠的Malkin评分和国际骨关节炎研究学会评分均显著高于假手术组。

假手术组小鼠右后足ASCJ关节软骨层中的II型胶原分布更为均匀，且含量高于两条韧带切断的两组小鼠。本研究可用于踝关节不稳的诊断与治疗，并为该疾病的临床治疗提供实验参考。