Name: 踝距下复杂关节不稳定的小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-28T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 了解通过韧带切断术建立小鼠踝距下复杂关节不稳定模型的方法。该模型结合平衡木测试与步态分析，为足部疾病的临床诊断和治疗策略研究提供可靠的实验平台。

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本研究得到了江苏省政府奖学金项目和江苏省高等教育优势学科建设工程项目（PAPD）的支持。

所有动物实验均按照《实验动物护理和使用指南》进行，并经苏州大学 Institutional Animal Care and Use Committee 批准。
1. 手术操作
<ol>
	<li>将21只6周龄的C57BL/6雄性小鼠分为三组：横突间韧带与距腓前韧带组、横突间韧带与三角韧带组以及假手术组。确保所有小鼠均饲养在符合特定病原体阴性（SPF）标准的环境中。</li>
	<li>在实验开始前，将小鼠适应新的饲养环境（12小时光照/12小时黑暗循环，恒定温度和湿度分别为18–22 °C和40%–70%）2周。实验前1周对小鼠进行平衡木和步态训练，使其能够从平衡木或U形管的一端不停顿地走到另一端。</li>
	<li>在8周龄时，通过将2 mL异氟烷滴加于棉球上并置于密闭容器中使其充分挥发，采用异氟烷吸入法对小鼠进行麻醉。监测小鼠活动情况，持续吸入直至其活动明显减少。通过夹捏小鼠脚趾观察其反应以判断麻醉深度。在后续操作过程中，通过面罩吸入2%气化异氟烷以维持麻醉状态。麻醉期间使用兽用眼膏防止眼睛干燥。</li>
	<li>麻醉完成后，使用剃毛器去除小鼠右后肢踝关节处的毛发，并交替使用碘伏棉球和酒精棉球对暴露的皮肤进行三次消毒。皮下注射5 mg/kg卡洛芬。将小鼠转移至显微外科动物手术室，使用无菌手术垫。</li>
	<li>对于横突间韧带与距腓前韧带（CL + ATFL）组，在右踝关节上方皮肤处用手术刀做一个7 mm斜向下的纵向切口，并用显微直镊在踝关节前方进行探查。</li>
	<li>探查后暴露位于距骨体下缘与腓骨之间的ATFL，用手术刀轻轻将其切断。分离腓骨长肌腱、腓骨短肌腱以及趾长伸肌腱，暴露CL后用手术刀将其切断。</li>
	<li>对于横突间韧带与三角韧带（DL）组，在右踝关节内侧皮肤做8 mm垂直切口，钝性分离内踝处的DL并最终将其切断。然后按照步骤1.5所述方法切断CL。</li>
	<li>对于假手术组（sham手术组），对右踝关节进行假手术操作，但不切断任何韧带。</li>
	<li>用无菌生理盐水冲洗切口，并使用5-0外科尼龙线缝合。最后用碘伏棉球对缝合后的切口进行消毒。</li>
	<li>持续观察小鼠直至其能够维持胸卧位，并在其完全清醒前进行监护。每天两次用碘伏棉球对踝关节切口进行消毒，每天一次皮下注射卡洛芬（5 mg/kg），连续给药1周。术后单独饲养，并密切观察小鼠的术后状况。</li>
	<li>术后2周且踝关节肿胀减轻后，开始每天使用小鼠旋转疲劳仪对小鼠进行1小时的运动训练。</li>
</ol>
2. 平衡木实验
<ol>
	<li>使用摄影三脚架夹具夹住一根长度为 1 m、直径为 20 mm 的圆形木杆，将其一端倾斜 15°，另一端放置在与封闭盒带相连的工作表面上。</li>
	<li>在手术前 1 周进行平衡木训练，确保小鼠能够顺利从木杆一端移动到另一端。当小鼠在 60 秒内连续两次通过木杆且中途不停顿时，视为通过测试。</li>
	<li>每只小鼠进行连续两次试验，每次试验后用 75% 酒精喷洒平衡木，以防止前一只小鼠残留的气味影响下一只小鼠。</li>
	<li>在术前以及术后 3 天、1 周、4 周、8 周和 12 周进行平衡木测试。记录每只小鼠连续两次通过平衡木的平均时间，以及右后肢从木杆上滑落的次数，作为因变量。</li>
</ol>
3. 足迹分析
<ol>
	<li>将一个长度为 50 cm、宽度为 10 cm、高度为 10 cm 的 U 形塑料通道放置在实验台上，并将塑料通道的一端连接至一个封闭的盒式装置。</li>
	<li>将一张白素描纸平铺于通道内，然后用双手固定小鼠，将其前足和后足分别均匀涂抹无毒的红色和绿色颜料。</li>
	<li>将染色后的小鼠轻柔地放置在通道一端，使其自行移动至盒式装置的另一端。取出带有足印的染色纸，标记信息后置于通风避光处的架子上晾干。</li>
	<li>每只小鼠通过后，用 75% 酒精喷洒 U 形塑料通道，以防止前一只小鼠残留的气味影响下一只小鼠的行为。</li>
	<li>在每张纸上选取三个连续且清晰的小鼠足印，使用直尺测量小鼠右足足印的步长，以及左右足印之间的步宽。</li>
</ol>
4. 热痛觉敏感性评估
<ol>
	<li>实验过程中，使用足底测试记录小鼠足部对热伤害性刺激的反应时间，分别记录小鼠在活动状态和静息状态下的反应时间。测量数据以秒为单位记录。</li>
	<li>将小鼠置于测量仪器中，使仪器对准其右足，开始缓慢升温加热。观察小鼠的反应。当温度升高超过其耐受限度时，小鼠会迅速回缩或舔舐右足。使用仪器记录该时间，并将此时间定义为活动状态下的反应时间。</li>
	<li>为测量静息状态下的反应时间，先让小鼠在未加热的静息台上静置 30 分钟，然后按照步骤 4.2 所述方法获取时间数据。将获得的时间数据用于后续分析。</li>
</ol>
5. 微型计算机断层扫描
<ol>
	<li>术后用二氧化碳处死12周龄小鼠，剥离其右踝关节的皮肤，然后用手术剪剪断中段胫骨和腓骨，以获取完整的踝关节标本。将标本置于标记好的含有10%中性甲醛的15 mL离心管中固定48小时。</li>
	<li>固定后，将标本分批（每批四个）放入专用海绵槽中进行微计算机断层扫描（micro-CT）。设置仪器参数如下：电压 = 50 kV，电流 = 200 mA，滤膜 = 0.5 mmAl，分辨率 = 9 µm。启动micro-CT扫描仪。</li>
	<li>扫描完成后，使用重建软件划定图像范围，并通过商业数据分析软件调整划定图像的XYZ轴，选择特定角度位置，具体操作如Liu等10所述。</li>
	<li>使用micro-CT分析软件，在经XYZ轴调整后的重建图像中选取连续的10层感兴趣区域，对目标关节进行定量分析，以确定骨体积分数（BV/TV），具体方法如Liu等10所述。</li>
	<li>最后，使用三维医学图像处理软件对小鼠踝关节进行三维CT图像处理，具体操作如Liu等10所述。重建后，观察ASCJ中磨损情况及骨赘形成。</li>
</ol>
6. 关节软骨切片染色
注意：所有染色步骤均在通风橱中进行，操作过程中需佩戴口罩。
<ol>
	<li>使用显微镊子和剪刀去除踝关节标本周围的多余软组织，然后将标本放入含有10% EDTA脱钙液的离心管中，该脱钙液由44 g NaOH、两包PBS和400 g EDTA-2Na配制而成，并用盐酸调节pH至7.35–7.45，同时标记不同组别。</li>
	<li>接着将离心管置于摇床上（转速设为20 rpm）进行脱钙处理，并每天更换一次脱钙液。通过观察判断标本的脱钙程度。</li>
	<li>脱钙1个月后，用梯度酒精对标本进行脱水，随后用正丁醇透明处理8小时。最后将透明后的标本以冠状位浸入石蜡中包埋。</li>
	<li>将石蜡包埋的标本置于4 °C冰箱中保存备用。切片前，从4 °C冰箱中取出标本，并放入−20 °C冷冻机中约10分钟，以便完整切面的切割。</li>
	<li>将标本固定在切片机上，切片厚度为6 µm。同时使用显微镜观察样本是否已切至预期层面——以注射器针头可轻松刺入骨组织为准。</li>
	<li>提前将展片机的水温调节至40 °C。接着连续切下两到三张完整的石蜡切片，转移至展片机中充分展开。然后用载玻片捞取石蜡切片并沥干水分。最后在载玻片上标记组别和编号。</li>
</ol>
7. 苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色
<ol>
	<li>将切片置于60 °C的孵育箱中，使完整的ASCJ关节结构可在显微镜下观察，并烘烤40-50分钟。随后，依次使用编号为I、II和III的二甲苯对切片进行脱蜡，分别处理15分钟、15分钟和10分钟，以便于识别。</li>
	<li>将脱蜡后的切片依次置于100%乙醇（编号为I和II，以便识别）、90%乙醇和80%乙醇中，分别处理3分钟、3分钟、5分钟和5分钟。接着，用重蒸水（ddH2O）清洗切片5分钟。</li>
	<li>用苏木精浸泡切片1分钟后，用ddH2O冲洗至无色。将切片置于1%酸性乙醇分化液中30秒，随后用ddH2O冲洗3次，每次1分钟。然后，用1%氨水溶液染色1分钟，再用ddH2O冲洗3次，每次1分钟。</li>
	<li>接着，用伊红染色液染色1分钟，然后依次放入95%乙醇和100%乙醇中各1分钟。最后，用二甲苯IV处理切片1分钟。</li>
	<li>将切片自然晾干，在载玻片上的样本处滴加一滴中性树胶，盖上盖玻片。然后，使用正置荧光显微镜在明场下以5x和20x物镜拍摄图像。</li>
</ol>
8. 番红O-固绿染色
<ol>
	<li>将选定的切片放入60 °C的培养箱中，烘烤40-50分钟。然后依次用二甲苯I、II和III分别脱蜡15分钟、15分钟和10分钟。</li>
	<li>将脱蜡后的切片依次置于100%乙醇I、II、90%乙醇和80%乙醇中，分别浸泡3分钟、3分钟、5分钟和5分钟。接着用ddH2O洗涤切片5分钟。</li>
	<li>用苏木精浸泡切片1分钟后，用ddH2O洗涤至无色。将切片浸入1%酸性乙醇分化液中30秒，并用ddH2O洗涤3次，每次1分钟。然后用1%氨水溶液染色1分钟，再用ddH2O洗涤3次，每次1分钟。</li>
	<li>将切片浸入0.05%快绿溶液中染色2分钟，随后依次浸入1%乙酸溶液30秒和0.1%沙黄溶液5分钟。将染色后的样本依次放入95%乙醇和100%乙醇中各1分钟。</li>
	<li>最后，用二甲苯IV处理切片1分钟。将切片自然晾干，在载玻片上的样本处滴加一滴中性树胶，加盖盖玻片。然后使用正置荧光显微镜在明场模式下以5x和20x放大倍数拍摄图像。</li>
</ol>
9. 免疫组织化学
<ol>
	<li>第1天：将选定的切片放入60 °C的孵育箱中，烘烤40–50分钟，然后依次用二甲苯I、II和III分别脱蜡15分钟、15分钟和10分钟。将脱蜡后的切片依次置于100%乙醇I、II、90%乙醇和80%乙醇中，分别浸泡3分钟、3分钟、5分钟和5分钟。随后用ddH2O清洗5分钟，使用组织化学笔圈出标本区域，并将切片置于避光盒中。</li>
	<li>抗原修复：在圈出的标本区域滴加20–50 µL 0.25%胰蛋白酶，于37 °C孵育箱中孵育60分钟，然后用PBS洗涤标本3次，每次2分钟。通过加入3% H2O2封闭内源性过氧化物酶，在室温避光条件下孵育10分钟，再用PBS洗涤3次，每次2分钟。进行血清封闭：加入10%山羊血清，室温孵育20分钟，随后在4 °C下与一抗（小鼠抗小鼠II型胶原抗体，稀释1000倍）孵育过夜。</li>
	<li>第2天：将切片在室温下复温30分钟。回收一抗，并用PBS洗涤切片3次，每次2分钟。在37 °C孵育箱中与二抗孵育40分钟，然后用PBS洗涤3次，每次2分钟。</li>
	<li>DAB显色：加入5 mL ddH2O，两滴缓冲液，四滴DAB和两滴H2O2配制DAB试剂。向切片上滴加20–50 µL试剂，避光反应5分钟，然后用ddH2O洗涤2分钟。</li>
	<li>用苏木精浸泡1分钟后，用ddH2O洗涤切片至无色。将切片浸入1%酸性乙醇分化液中30秒，再用ddH2O洗涤3次，每次1分钟。用1%氨水溶液染色1分钟，然后用ddH2O洗涤3次，每次1分钟。</li>
	<li>随后将切片分别置于95%乙醇和100%乙醇中，各1分钟。最后将切片与二甲苯IV孵育1分钟。自然晾干切片，在载玻片上的标本处滴加一滴中性树胶，盖上盖玻片。然后使用正置荧光显微镜在明场模式下以5倍和20倍物镜采集图像。</li>
</ol>

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</ol>

所有作者均无利益冲突。

本研究通过切断CL + ATFL或CL + DL，成功构建了两种ASCJ不稳定的鼠类模型。术后8周和12周，小鼠通过平衡梁所需的时间显著延长，这与Hubbard-Turner团队通过切断踝关节外侧韧带所得结果相似23,24。在右足滑移试验中，我们观察到两组韧带切断小鼠的滑移次数显著高于假手术组小鼠，且滑移次数在术后12周达到峰值，提示这两组小鼠可能出现了ASCJ不稳定。步态分析显示，尽管小鼠步长随年龄增长逐渐增加，但术后12周时，两组韧带切断小鼠的步长仍低于假手术组，其中CL + ATFL组的步长比假手术组短7.2%。综上所述，上述结果表明，两组韧带切除小鼠的运动水平和平衡能力均受到显著损害。
在CT图像的三维重建中观察到，韧带切断组小鼠的ASCJ关节面比假手术组小鼠更粗糙，关节周围形成骨赘，关节的骨体积分数增加。这些结果提示，韧带切断组小鼠的ASCJ关节软骨存在退行性病变。关节软骨切片染色显示软骨退变，如软骨表面不连续和软骨细胞减少，进一步证实长期ASCJ不稳定可...

踝关节扭伤是全球最常见的运动损伤之一。据估计，仅在美国每天就有约10,000人发生此类损伤1，其中运动相关损伤占15%–45%2。美国每年用于治疗踝关节扭伤的医疗费用高达42亿美元3,4,5。慢性足部不稳是踝关节扭伤后常见的问题，约74%的踝关节扭伤患者会出现此类情况6，包括踝关节或距下关节不稳。然而，由于临床症状和体征相似，医务人员在临床上难以判断慢性踝关节不稳是否同时伴有慢性距下关节不稳，因此慢性距下关节不稳容易被漏诊。因此，慢性踝-距下复合关节（ASCJ）不稳（一种同时包含慢性踝关节不稳和慢性距下关节不稳的特定类型慢性足部不稳）的真实发病率可能高于现有报道7,8,9。若未及时治疗，慢性踝-距下复合关节不稳可导致反复的踝关节扭伤，从而形成踝关节扭伤与慢性踝-距下复合关节不稳之间的恶性循环。长期的慢性踝-距下复合关节不稳可引起ASCJ退行性变及创伤后骨关节炎，在严重情况下还可能影响邻近关节10。对于这些疾病，目前临床治疗以保守治疗为主，此外还包括韧带修复和韧带重建等手术治疗方法11,12。
踝-下距关节复合体（ASCJ）是足部的核心结构，在运动过程中维持身体的平衡13。目前已有大量研究分别针对踝关节和距下关节的结构展开14,15,16,17。然而，关于整个踝-距下关节复合体的研究却十分罕见。约四分之一的踝关节损伤病例伴有距下关节损伤18。由于ASCJ不稳定的损伤机制复杂，临床上对其诊断和治疗尚无统一共识。鉴于目前踝关节损伤的临床现状，亟需一种更为科学的方法将踝关节与距下关节作为一个整体进行研究，从而为足部疾病的研究提供新的认识。
由于小鼠后足在肌肉骨骼层面的解剖结构与人类足部相似19，已有多个研究采用了小鼠模型用于足/踝部的研究10,19。Chang 等人19成功建立了三种不同的小鼠踝关节骨关节炎模型。受小鼠模型中踝关节不稳成功建模的启发，我们建立了一种针对踝-距下关节复合体（ASCJ）不稳的小鼠模型，假设切断小鼠后足的部分韧带将导致ASCJ的机械性不稳定，从而引发ASCJ的创伤后骨关节炎（PTOA）。该ASCJ不稳动物模型可用于同时研究踝关节不稳和距下关节不稳的治疗，相较于目前常用的单纯踝关节不稳模型，更符合实际临床情况7,8,9,19。为验证这一假设，设计了两种由韧带切断诱导ASCJ不稳的小鼠模型。采用感觉运动功能评估——包括平衡木实验、足迹分析和热痛觉测试——来评价模型的可行性，同时采用微型计算机断层扫描（CT）和组织学染色评估小鼠关节软骨的损伤与退变情况。成功建立ASCJ不稳的小鼠模型，不仅为研究足部疾病提供了新的视角，也为损伤相关机制的临床研究提供了有价值的参考，有助于为踝关节扭伤提供更优的治疗方案，并推动对该类疾病的进一步研究。

<table><tbody><tr><td>5-0 外科尼龙缝线</td><td>Ningbo Medical Needle Co., Ltd.</td><td>191104</td><td></td></tr><tr><td>酸性乙醇分化液（1%）</td><td>上海源叶生物科技有限公司</td><td>R20778</td><td></td></tr><tr><td>粘附性载玻片</td><td>江苏世泰实验器材有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氨水溶液（1%）</td><td>上海源叶生物科技有限公司</td><td>R20788</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>国药集团化学试剂上海有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水性乙酸（1%）</td><td>上海源叶生物科技有限公司</td><td>R20773</td><td></td></tr><tr><td>黑色立方体包埋盒</td><td>上海轶哲仪器有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>北京索莱宝科技有限公司</td><td>YA0476</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>北京索莱宝科技有限公司</td><td>YA0472</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>江苏世泰实验器材有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CTAn 软件</td><td>Blue scientific</td><td></td><td>micro-CT 分析软件</td></tr><tr><td>Dataview 软件</td><td>AEMC instruments</td><td></td><td>商业数据分析软件</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）</td><td>北京索莱宝科技有限公司</td><td>E8490</td><td></td></tr><tr><td>电热恒温培养箱</td><td>苏州华美设备厂</td><td></td><td></td></tr><tr><td>包埋石蜡</td><td>Leica, Germany</td><td>39001006</td><td></td></tr><tr><td>伊红染色液（醇溶性，1%）</td><td>上海源叶生物科技有限公司</td><td>R30117</td><td></td></tr><tr><td>快绿染色液</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>F7275</td><td></td></tr><tr><td>步态纸</td><td>保定华融造纸厂</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8.0</td><td>Graphpad software</td><td></td><td>在线统计分析工具</td></tr><tr><td>碘伏棉球</td><td>青岛海诺生物工程有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica 818 刀片</td><td>Leica, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>Skyscan, Belgium</td><td>SkyScan 1176</td><td></td></tr><tr><td>显微操作镜</td><td>苏州欧迈特光电科技有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mimics 软件</td><td>Materialise&amp;nbsp;</td><td></td><td>3D 医学图像处理软件&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>改良 Harris 苏木精染色液</td><td>上海源叶生物科技有限公司</td><td>R20566</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗小鼠 II 型胶原抗体</td><td>美国 Abcam 公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>国药集团化学试剂上海有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>正丁醇</td><td>国药集团化学试剂上海有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>中性福尔马林固定液（10%）</td><td>上海源叶生物科技有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>中性树胶</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nrecon 重建软件&amp;nbsp;</td><td>Micro Photonics Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oaks 电动剃毛器</td><td>Oaks 集团有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>石蜡包埋机</td><td>Leica, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 计</td><td>上海雷磁公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>美国 Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生理盐水（哺乳动物用，无菌）</td><td>上海源叶生物科技有限公司</td><td>R22172</td><td></td></tr><tr><td>萨弗兰宁 O 染色液</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>HT90432</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水（0.9%）</td><td>上海百特医疗药品有限公司</td><td>309107</td><td></td></tr><tr><td>摇床</td><td>海门麒麟贝尔仪器制造有限公司</td><td>2008779</td><td></td></tr><tr><td>SPSS 23</td><td>IBM</td><td></td><td>在线统计分析工具</td></tr><tr><td>切片机</td><td>Leica, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织切片机</td><td>Leica, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ugo Basile</td><td>Ugo Basile 生物研究公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>正置荧光显微镜</td><td>Zeiss Axiovert, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U 形塑料通道</td><td>上海轶哲仪器有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>兽用眼膏</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>国药集团化学试剂上海有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>YLS-10B 轮式疲劳测试仪</td><td>济南益延科技发展有限公司</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

踝-距下复合关节不稳的小鼠模型

A Mouse Model of Ankle-Subtalar Complex Joint Instability

踝关节扭伤可能是日常生活中最常见的运动损伤，常导致踝-距下复合关节（ASCJ）不稳定，并可能长期发展为创伤后骨关节炎（PTOA）。然而，由于损伤机制复杂，且临床表现多样，如足外侧出现瘀斑、血肿或压痛等，目前临床上对ASCJ不稳定的诊断和治疗尚无统一共识。由于小鼠后足骨骼与韧带的肌肉骨骼结构与人类相似，本研究通过切断ASCJ周围韧带，建立了小鼠ASCJ不稳定的动物模型。该模型通过一系列行为学测试和组织学分析得到了充分验证，包括平衡木实验、足迹分析（用于评估小鼠运动水平与平衡能力）、热痛觉测试（用于评估小鼠足部感觉功能）、显微计算机断层扫描（CT）以及关节软骨切片染色（用于评估小鼠关节软骨的损伤与退变情况）。小鼠ASCJ不稳定模型的成功建立，将为临床研究踝关节扭伤的损伤机制提供有价值的参考，并有助于开发更有效的治疗方案。

相关性数据的统计分析采用在线统计分析工具进行。符合正态分布和方差齐性两项检验的数据，通过单因素方差分析进行进一步统计分析。若数据不符合这两项检验，则采用 Kruskal-Wallis 检验进行统计分析。数据以平均值表示 &#177; 标准差 (SD) p &#60; 0.05 被视为具有统计学显著性。
平衡木测试 
对每只小鼠在各阶段两次通过平衡木所需平均时间的统计分析表明，各组小鼠术前通过平衡木所需时间无统计学差异。p = 0.73）。术后第三天，与假手术组小鼠相比，CL + ATFL 组和 CL + DL 组小鼠通过平衡木所需时间更长，差异具有统计学意义（p &#60; 0.05）。术后四周，与假手术组小鼠相比，CL + ATFL 组和 CL + DL 组小鼠通过平衡木所需时间未观察到显著差异。p &#62; 此外，术后8周和12周时，与假手术组小鼠相比，CL + ATFL组和CL + DL组小鼠通过平衡木所需时间更长，且差异具有统计学意义（p < 0.05）。<...

踝-距下复合关节（ASCJ）是足部的核心结构，在日常活动中对平衡控制起着关键作用。运动损伤常导致该关节不稳定。本文介绍一种通过韧带横断诱导ASCJ不稳定的 小鼠模型。

踝关节扭伤可能是日常生活中最常见的运动损伤，常导致踝-距下复合关节（ASCJ）的不稳，以及……

成功建立ASCJ踝关节不稳小鼠模型，拓展了一种简单的踝关节不稳动物模型，并为临床足部疾病的研究提供了新思路。我们已建立一种更符合实际临床情况的动物模型，可用于足部疾病诊断与治疗的进一步研究。实验前一周，对小鼠进行平衡木和步态训练，使其从平衡木或U形管的一端行进至另一端，过程中不得停留。用麻醉剂麻醉小鼠右后肢踝关节并去除毛发后，使用碘伏棉签对暴露的皮肤进行消毒。将小鼠置于无菌手术垫上，转移至显微外科动物手术室。对于横韧带和距腓前韧带组，用手术刀在右踝关节上方皮肤做一条7毫米长的斜向下方纵行切口。用显微直镊在踝关节前方进行探查，充分暴露距骨体下缘与腓骨之间的下距腓前韧带，用手术刀轻轻将其切断。分离腓骨长肌腱和腓骨短肌腱，以及趾长伸肌腱。暴露颈韧带，并用手术刀将其切断。对于横行颈韧带联合三角韧带组，于右踝关节内侧皮肤做一8 mm的垂直切口，钝性分离三角韧带与内踝之间的连接，然后将其切断。随后按照前述方法切断颈韧带。对于假手术组，在小鼠右踝关节处进行假手术操作。用无菌生理盐水冲洗切口后，使用5-0外科尼龙线缝合切口，再用碘伏棉签对缝合后的切口进行消毒。术后两周待踝关节肿胀减轻后，每天使用小鼠旋转式疲劳仪对小鼠进行一小时的运动训练。进行平衡木实验时，使用三脚架夹具将一根圆形木制横梁的一端固定，并使其倾斜15度，另一端放置在与一个封闭暗盒相连的工作台面上。在手术前一周进行平衡木训练，以确保小鼠能够顺利地从横梁一端移动到另一端。当小鼠在60秒内无停顿地通过横梁两次时，视为通过测试。每次试验后，用75%酒精喷洒平衡木，以消除前一只小鼠留下的残留气味对下一只小鼠的干扰。进行平衡木实验，记录每只小鼠连续两次通过平衡木的平均时间，以及右后肢从平衡木上滑落的次数，作为因变量。进行足迹分析时，将U形塑料通道置于实验台上，并将塑料通道的一端连接至一个封闭的盒式装置。将一张白纸平放在通道内。然后用双手固定小鼠，将无毒的红色和绿色染料均匀地涂抹在小鼠的前足和后足上。现在，将涂有颜料的小鼠放置在通道的一端，使其移动至盒体的另一端。取下带有脚印的着色滤纸，做好标记，并置于通风且避光的地方晾干。每只小鼠通过后，用75%酒精喷洒U形塑料通道，以防止前一只小鼠残留的气味影响下一只小鼠的行为。在每张纸上选择三个连续清晰的小鼠脚印。使用直尺测量小鼠右脚脚印的步长，并测量左右脚印之间的步宽。使用显微镊子和剪刀去除踝关节标本周围多余的软组织。然后，将标本放入含有10% EDTA脱钙液的离心管中，并标记不同组别。接着，将离心管置于摇床中进行脱钙。每天更换一次脱钙液，并检测标本的脱钙程度。脱钙一个月后，用梯度酒精脱水标本，然后用正丁醇透明八小时。最后将透明后的标本浸入石蜡中，以冠状位包埋。切片前，将标本从4°C冰箱转移至-20°C冷冻柜中约10分钟，以利于完整切面的获取。将标本固定在切片机上，切成六微米厚的切片。同时，使用显微镜观察样品是否已切至预期位置，以确保注射针头能够顺利穿入骨组织。连续切出两到三张完整的石蜡切片后，将其转移至设定为40摄氏度的展片台上，使其充分展开。然后用载玻片移除石蜡切片。最后，用组别和编号标记载玻片，以便在显微镜下观察完整的ASCJ关节结构。将切片置于60摄氏度的孵育箱中孵育40至50分钟。然后按照文稿中的描述，用二甲苯脱蜡三次。将脱蜡后的切片先后浸入100%乙醇中两次，每次3分钟，随后分别在90%和80%乙醇中各浸泡5分钟。然后用双蒸水清洗切片5分钟。用苏木精浸泡1分钟后，再用双蒸水清洗切片，直至切片无色。将切片浸入1%酸性乙醇分化液中30秒，随后用双蒸水冲洗。将切片用1%氨水溶液染色后，用双蒸水洗涤，再将样品放入伊红染色液中染色1分钟。然后依次将切片放入95%和100%乙醇中各1分钟。最后，用二甲苯处理切片4次，每次1分钟。将切片风干后，在载玻片上的样本处滴加一滴中性树胶，盖上盖玻片。然后使用正置荧光显微镜在明场下以5倍和20倍物镜拍摄图像。将经苏木精和氨水染色的切片浸入0.05%快绿溶液中染色两分钟。随后将切片浸入1%乙酸溶液中30秒，再浸入0.1%番红溶液中5分钟。然后按照之前所述方法，用乙醇和二甲苯处理载玻片。使用正置荧光显微镜在明场下以5X和20X放大倍数拍摄图像。术后3天、8周和12周时，韧带切断组小鼠通过平衡木所需时间明显长于假手术组。术前，三组小鼠的右后肢步长相似。然而，术后12周，韧带切断组的步长短于假手术组。术前，三组小鼠在活动期间足部的热伤害感受反应时间相似。术后，韧带切断组小鼠的反应时间较假手术组延长。韧带切断组小鼠右后足距下关节（ASCJ）显示关节面粗糙、骨赘积聚及退行性改变。且骨体积分数显著高于假手术组。韧带切断组ASCJ的软骨层出现不连续，且软骨细胞数量减少。此外，韧带切除小鼠的Malkin评分和国际骨关节炎研究学会评分均显著高于假手术组。假手术组小鼠右后足ASCJ关节软骨层中的II型胶原分布更为均匀，且含量高于两条韧带切断的两组小鼠。本研究可用于踝关节不稳的诊断与治疗，并为该疾病的临床治疗提供实验参考。

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