Name: 跟踪实验进化人群中结构变异的动态 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T13:35:00.000+00:00
Duration: 4 min 52 s
Description: 了解如何利用三重引物设计与平行毛细管电泳技术，在实验进化群体中动态追踪结构变异等位基因频率。该方法以mutS基因为例，揭示了1000代进化过程中非单调的等位基因轨迹，为研究进化动态提供了经济高效的新工具。

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本工作由S.B.获得欧洲研究委员会（ERC HGTCODONUSE，项目编号：ERC-2015-CoG-682819）资助。本研究所使用的数据部分由蒙彼利埃进化科学研究所（Institut des Sciences de l'Evolution de Montpellier）的GenSeq技术平台在LabEx CeMEB（法国国家科研署ANR资助项目）的支持下生成。 &#34;未来投资&#34; 项目（ANR-10-LABX-04-01）。

建立本实验方案需要精确掌握祖先序列中插入、缺失、倒位或重复的位置。这些信息通常通过末端或中间时间点样品的全基因组测序（WGS）获得。在以下方案中，每一步均以插入突变为例说明其基本原理，并结合一个代表性案例进行阐述：追踪大肠杆菌（E. coli）实验进化群体中mutS基因内IS10插入事件的频率变化。在该群体中，终点群体的全基因组测序结果显示，在第2,463至2,471位点之间插入了一个1,329 bp的IS10元件，导致该插入位点发生重复。本方法同样适用于其他三种结构变异类型，各类情况的具体注意事项将在讨论部分予以说明。
1. 三引物设计
<ol>
	<li>采用经典的引物设计原则（18-24 bp，40%-60% GC 含量，尽可能以 G/C 碱基对起始或终止，Tm 差异 &lt; 5 °C）设计引物 FW1 和 RV1。设计引物以扩增野生型等位基因上突变等位基因插入位点附近的短片段（图1）。 
	注意：扩增片段大小可在 100 bp 至 3,000 bp 范围内，需与毛细管电泳所用的 DNA 分子量标准相匹配。在本示例中，扩增了一个 155 bp 的片段。此处选择的小片段尺寸可防止对完整的 IS10 插入序列进行非特异性扩增（见第 2 节）。</li>
	<li>在插入序列内部设计第二个正向引物 FW2，以产生第二个扩增片段，其大小比野生型扩增片段大约或小约 5%（图1）。该 5% 的大小差异是并行毛细管电泳设备能够可靠区分的最小差异。因此，设计引物时应使两个扩增片段的大小差异略高于但尽可能接近此相对阈值。 
	注意：务必尽量减少 Tm 差异和引物二聚体的形成。在本示例中，设计了一个第二个正向引物，用于扩增一个 226 bp 的片段，比野生型扩增片段大 71 bp。在此代表性示例中，引物序列如下： 
	FW1:AAAGCATTTCGCCGAACGCC 
	RV1: GCGATAAATCCACTCCAGCGCC 
	FW2: AGTTCGCTTAGGCATGGAAG</li>
</ol>
<img alt="mutS基因图谱显示IS10插入，突出PCR过程及用于分析的引物位置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64709/64709fig01.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：mutS野生型基因及mutS IS10插入突变体的三重引物设计示意图。 黑色三角形表示mutS基因中的IS10插入位点。野生型基因用蓝色表示，IS10用橙色表示。引物FW1和RV1标记IS10插入位点，扩增出155 bp的野生型产物。RV1引物与IS10内部的引物FW2共同扩增出第二个226 bp的产物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64709/64709fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. PCR 条件的优化
<ol>
	<li>培养固定化的野生型和突变等位基因克隆的过夜培养物。</li>
	<li>使用任意试剂盒提取DNA。</li>
	<li>定量 DNA。</li>
	<li>将野生型（WT）和突变型DNA提取物稀释至5 ng/μL以制备DNA样品µL将两种DNA样本按1:1比例混合。</li>
	<li>使用2x预混PCR反应液，对10 ng的三种DNA样本（野生型、突变型、50/50混合样本）进行扩增， 0.5 µM FW1 引物， 1 µM RV1 引物，以及 0.5 µM FW2 引物在 a 中 20 µL 反应体系体积。使用2%琼脂糖凝胶通过经典电泳迁移PCR产物，并确定最佳PCR条件。 
	注意：应尽量缩短延伸时间，以防止在突变等位基因上形成 FW1 和 RV1 扩增子。应调整退火温度，以尽量减少等位基因的扩增偏倚和非特异性扩增。
	<ol>
		<li>要遵循本示例中的程序，请使用以下设置： 98 °C 10 秒，随后进行 25 个循环的 98 °C 1 秒， 58 °C 15 秒 72 °C 8 秒，以及最后的延伸步骤在 72 °C 1 分钟。 
		注意：将延伸时间缩短至8秒，以防止扩增目标产物 &gt;突变等位基因上由正向引物与RV1引物扩增出的1,000 bp产物（mutS 含IS10插入。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 标准曲线
<ol>
	<li>将野生型（WT）和突变型两种DNA样本按10/90、25/75、40/60、50/50、60/40、75/25和90/10的比例混合。 
	注意：生物学重复样本应来自独立的过夜细菌培养物。</li>
	<li>使用优化的PCR条件进行扩增（见第2节）。</li>
	<li>对扩增产物进行定量。</li>
	<li>将PCR产物稀释至0.1 ng/µL。</li>
	<li>准备毛细管电泳仪的并行运行。
	<ol>
		<li>混合新鲜凝胶和染料（NGS定量分析试剂盒（22、33或55）；本示例使用HS NGS片段1-6,000 bp）。 
		注意：详细操作步骤请参见并行毛细管电泳HS NGS片段使用指南（见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>更换毛细管储存液和进样缓冲液，并将清洗缓冲液板放置在并行毛细管电泳仪的正确抽屉位置。</li>
	<li>在96孔板中，向每份稀释后的样品22 µL中加入2 µL HS稀释标记物。</li>
	<li>从HS NGS定量分析试剂盒中取一条尺寸标准品（DNA尺寸标记物；范围1-6,000 bp）加入96孔板中的一个孔。</li>
	<li>将96孔板放入并行毛细管电泳仪的正确抽屉位置，并在并行毛细管电泳仪软件中选择运行。</li>
	<li>使用数据分析软件分析结果，该软件可检测并识别尺寸标准品的各个峰，并将各样品的峰分配至其已知的实际大小。
	<ol>
		<li>使用定量试剂盒时，通过积分峰下面积来确定每个片段的DNA量，方法类似于色谱数据分析。再次将样品与已知浓度的标准品进行比较，以定量每个峰，并计算样品中不同峰之间的比例。</li>
		<li>构建校准曲线（图2），将突变等位基因的已知比例（DNA混合物）与通过并行毛细管电泳仪测得的比例关联起来。该校准曲线可用于评估方法的可靠性，并对微小的扩增偏差进行校正。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 样品制备
<ol>
	<li>在标准条件下培养待测时间点的样品过夜。</li>
	<li>提取DNA。</li>
	<li>对DNA进行定量。</li>
	<li>使用优化的PCR条件扩增样品（见第2节）。</li>
	<li>将样品在平行毛细管电泳仪中进行分析（见步骤3.5–3.10）。</li>
</ol>
5. 等位基因定量
<ol>
	<li>利用软件从平行毛细管电泳仪器数据中提取突变等位基因的数量，并通过在校准曲线上绘制这些值来计算实际比例。</li>
</ol>

<ol><li>Mahmoud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+variant+calling%3A+the+long+and+the+short+of+it%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural variant calling: the long and the short of it.</a> Genome Biology. 20 (1), 246(2019).</li>
<li>Bragg, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+onset+in+X-linked+dystonia-parkinsonism+correlates+with+expansion+of+a+hexameric+repeat+within+an+SVA+retrotransposon+in+TAF1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Disease onset in X-linked dystonia-parkinsonism correlates with expansion of a hexameric repeat within an SVA retrotransposon in TAF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (51), 11020-11028 (2017).</li>
<li>Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+kinase+fusions+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The landscape of kinase fusions in cancer.</a> Nature Communications. 5, 4846(2014).</li>
<li>Tenaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+diversity+of+adaptive+convergence%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The molecular diversity of adaptive convergence.</a> Science. 335 (6067), 457-461 (2012).</li>
<li>Vandecraen, J., Chandler, M., Aertsen, A., Van Houdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+insertion+sequences+on+bacterial+genome+plasticity+and+adaptability%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The impact of insertion sequences on bacterial genome plasticity and adaptability.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (6), 709-730 (2017).</li>
<li>Andersson, D. I., Gene Hughes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((amplification+and+adaptive+evolution+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">amplification and adaptive evolution in bacteria.</a> Annual Review of Genetics. 43, 167-195 (2009).</li>
<li>Bailey, S. F., Bataillon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+the+experimental+evolution+programme+help+us+elucidate+the+genetic+basis+of+adaptation+in+nature%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Can the experimental evolution programme help us elucidate the genetic basis of adaptation in nature.</a> Molecular Ecology. 25 (1), 203-218 (2016).</li>
<li>Consuegra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion-sequence-mediated+mutations+both+promote+and+constrain+evolvability+during+a+long-term+experiment+with+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Insertion-sequence-mediated mutations both promote and constrain evolvability during a long-term experiment with bacteria.</a> Nature Communications. 12 (1), 980(2021).</li>
<li>Burch, C. L., Romanchuk, A., Kelly, M., Wu, Y., Jones, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+determination+of+barriers+to+horizontal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Genome-wide determination of barriers to horizontal gene transfer.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Slomka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+evolution+of+Bacillus+subtilis+reveals+the+evolutionary+dynamics+of+horizontal+gene+transfer+and+suggests+adaptive+and+neutral+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Experimental evolution of Bacillus subtilis reveals the evolutionary dynamics of horizontal gene transfer and suggests adaptive and neutral effects.</a> Genetics. 216 (2), 543-558 (2020).</li>
<li>Choudhury, D., Saini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+Escherichia+coli+in+different+carbon+environments+for+2%2C000+generations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolution of Escherichia coli in different carbon environments for 2,000 generations.</a> Journal of Evolutionary Biology. 32 (12), 1331-1341 (2019).</li>
<li>Tenaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tempo+and+mode+of+genome+evolution+in+a+50%2C000-generation+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tempo and mode of genome evolution in a 50,000-generation experiment.</a> Nature. 536 (7615), 165-170 (2016).</li>
<li>Behringer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichiacoli+cultures+maintain+stable+subpopulation+structure+during+long-term+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Escherichiacoli cultures maintain stable subpopulation structure during long-term evolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4642-4650 (2018).</li>
<li>Voordeckers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+to+high+ethanol+reveals+complex+evolutionary+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Adaptation to high ethanol reveals complex evolutionary pathways.</a> PLoS Genetics. 11 (11), 1005635(2015).</li>
<li>Levy, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evolutionary+dynamics+using+high-resolution+lineage+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quantitative evolutionary dynamics using high-resolution lineage tracking.</a> Nature. 519 (7542), 181-186 (2015).</li>
<li>Bruger, E. L., Marx, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+genome+sequencing+has+revolutionized+studies+of+experimental+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A decade of genome sequencing has revolutionized studies of experimental evolution.</a> Current Opinion in Microbiology. 45, 149-155 (2018).</li>
<li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+amplicon-based+sequencing+framework+for+accurately+measuring+intrahost+virus+diversity+using+PrimalSeq+and+iVar%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar.</a> Genome Biology. 20 (1), 8(2019).</li>
<li>Bedhomme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+changes+after+translational+challenges+imposed+by+horizontal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolutionary changes after translational challenges imposed by horizontal gene transfer.</a> Genome Biology and Evolution. 11 (3), 814-831 (2019).</li>
<li>Tenaillon, O., Toupance, B., Le Nagard, H., Taddei, F., Godelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutators%2C+population+size%2C+adaptive+landscape+and+the+adaptation+of+asexual+populations+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutators, population size, adaptive landscape and the adaptation of asexual populations of bacteria.</a> Genetics. 152 (2), 485-493 (1999).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

在此，我们提出了一种经济高效的方法，可用于追踪实验进化群体中新出现的适应性结构变异（SV）等位基因的动态变化。该方法结合了经典的PCR技术与自动化并行毛细管电泳，能够测定两个等位基因的相对含量。方法建立后，可并行对大量样本中的等位基因比例进行定量，且成本远低于全基因组测序（WGS）。该方法可视为非SNP突变检测中与扩增子测序相当的技术。&#160;以及作为解决大SV扩增子测序技术局限性的方案。我们已证明，该方法利用可克服PCR偏好性的校准曲线，能够准确量化非SNP突变体的比例。图2).
表征结构变异等位基因的动态变化有助于通过其平行的时间动态识别连锁突变，或计算选择系数并鉴定其随时间的变化。在本文所展示的应用实例中，我们通过终点全基因组测序（WGS）发现，高突变表型个体在多个实验进化的 E. coli 种群中处于分离或固定状态18。这些种群被视为高突变表型，因其在甲基化错配修复（MMR）&#160;基因之一中存在破坏性突变（插入序列IS插入），并且在1,00...

结构变异（SV）是指基因组序列的改变，通常影响50个碱基对或更多。已描述的SV可分为四类：大片段插入、大片段缺失、倒位和重复。直到最近，相较于结构变异，单核苷酸变异（SNV）在表型效应、作为疾病遗传决定因素的作用或对适应性的贡献方面受到了更多关注。这可能是因为检测SNV并预测其表型效应相对更容易。然而，短读长和长读长深度测序技术已显著提高了SV的检出能力，至少在单个个体或克隆基因组中是如此1。与此同时，SV的表型效应也得到了更深入的表征，并已有大量文献记录了其作为人类疾病遗传决定因素2,3或对新环境适应4的实例。
缺失和插入突变通常由可移动遗传元件（MGE）插入引起，其破坏性远大于单核苷酸多态性（SNPs），可导致移码突变和蛋白质结构改变。基因内部的缺失及MGE插入几乎总是导致基因失活，而插入到非编码区时，若插入序列（ISs）包含启动子或终止序列，则可能导致邻近基因的抑制或组成型表达5。虽然必需基因的敲除会对细菌适应性产生明显的不利影响，但在某些情况下，非必需基因的丢失反而具有优势。尽管基因重复本身存在固有的代价，但在某些条件下也可能带来益处，并参与适应过程，因其可改变基因剂量；特定蛋白质活性的增加在特定环境下可能是有利的6。
微生物实验进化种群通常由克隆起始。这种初始遗传多样性缺失，加上试管的&#34;封闭环境&#34;特性，导致通过水平基因转移和重组实现基因获得的进化潜力极为有限。在这些特定条件下，缺失、重复以及基因组内可移动遗传元件（MGE）插入对适应性的贡献尤为重要；细菌常通过功能丧失性突变（主要由缺失或MGE插入引起）进行适应，影响在稳定且通常营养丰富的单培养人工环境中无用的基因7。在持续时间最长的大肠杆菌（E. coli）进化实验中，经过50,000代进化后的种群中IS150插入尤为频繁，其中IS元件占保持祖先点突变率的种群中达到高频突变的35%8。
进化与重测序研究结合实验进化和下一代测序（NGS）技术，用于探究细菌在不同环境条件和胁迫（如不同的碳源和能源、抗生素以及渗透压胁迫）下，如何在表型和基因组水平上发生适应性进化9,10,11这些研究通常仅在实验终点，有时也在若干中间时间点，获取进化种群或克隆的基因组信息。12,13,14这些数据有助于揭示与特定环境适应相关的基因和通路，但很少能允许研究人员追踪其动态变化过程 从头合成 随时间推移出现并迅速扩散的等位基因。
一种追踪这些动态的方法是选择少数感兴趣的分离等位基因（基于这些基因的功能，或因为它们在独立种群中平行发生选择性清除等），并利用扩增子测序来量化等位基因频率，将多个时间点的样本合并到同一次测序运行中15。该方法已成功用于追踪微生物在实验16和自然17种群中微小变异（如单核苷酸多态性SNPs或1 bp的插入缺失）的动态变化。然而，对于较大的插入缺失或可移动遗传元件（MGE）插入，扩增子的长度差异会导致PCR扩增效率不同，从而扭曲测序读段比例与真实等位基因比例之间的关系。在某些情况下，两个等位基因之间的长度差异甚至超过常规扩增子的长度。在此，我们结合三重PCR技术与自动化平行毛细管电泳，通过基于片段大小的区分来定量插入等位基因的相对频率。该方法能够以成本效益高的方式充分利用以往未被有效利用的实验时间点，以确定新出现的突变等位基因的动态变化，并追踪其频率直至固定或丢失。我们应用该方法追踪了由IS10插入导致突变的新兴mutS-&#160;等位基因，该突变基因型具有超突变表型。
该方法要求两个目标等位基因的大小差异至少为5%。首先，设计引物三联体以产生大小相似的片段，这些片段共享一个共同的引物。其次，优化PCR条件，并使用野生型（WT）与突变型基因组DNA（gDNA）的不同比例混合物制作标准曲线。最后，通过PCR扩增样品，并利用平行定量毛细管电泳测定每个等位基因的相对频率。

<table><tbody><tr><td>96 孔裙边 PCR 板</td><td>4titude</td><td>4Ti - 0740</td><td>PCR</td></tr><tr><td>分子生物学级琼脂糖</td><td>Eurogentec</td><td>EP-0010-05</td><td>琼脂糖凝胶电泳&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Agilent DNF-474 HS NGS 片段分析试剂盒（用于 Fragment Analyzer 系统）快速指南</td><td>Agilent</td><td></td><td>PDF 操作指南</td></tr><tr><td>TBE 缓冲液</td><td>Panreac appliChem</td><td>A4228,5000Pc</td><td>琼脂糖凝胶电泳&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>校准型一次性接种环和接种针</td><td>LABELIANS</td><td>8175CSR40H</td><td>细菌培养</td></tr><tr><td>DNeasy 血液与组织提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>DNA 提取</td></tr><tr><td>电泳电源</td><td>Amilabo</td><td>ST606T</td><td>琼脂糖凝胶电泳&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fragment Analyzer 自动化毛细管电泳系统</td><td>Agilent</td><td></td><td>并行毛细管电泳</td></tr><tr><td>片段 DNA 标准分子量标记物</td><td>Agilent</td><td>DNF-396，范围 1–6000 bp</td><td>并行毛细管电泳</td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素盐生物试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1264-1G</td><td>细菌培养</td></tr><tr><td>高灵敏度稀释标记物</td><td>Agilent</td><td>DNF-373</td><td>并行毛细管电泳</td></tr><tr><td>高灵敏度 NGS 定量分析试剂盒</td><td>Agilent</td><td>DNF-474</td><td>并行毛细管电泳</td></tr><tr><td>Ladder 快速上样 1 kb Plus DNA 标准分子量标记物</td><td>NEB</td><td>N0469S</td><td>琼脂糖凝胶电泳&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LB 肉汤，VegitoneNutriSelect Plus</td><td>Millipore</td><td>28713</td><td>细菌培养</td></tr><tr><td>Phusion Flash 高保真 PCR 预混液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F548L</td><td>PCR</td></tr><tr><td>引物</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>PCR</td></tr><tr><td>Prosize 数据分析软件 v.4</td><td>Agilent</td><td>V.4</td><td>并行毛细管电泳</td></tr><tr><td>Qubit 检测试剂</td><td>Invitrogen</td><td>MAN0010876</td><td>DNA 定量</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>LIFE TECHNOLOGIES SAS</td><td>Q32854</td><td>DNA 定量</td></tr><tr><td>PCR 仪（热循环仪）</td><td>Eppendorf</td><td>Ep gradients</td><td>PCR</td></tr><tr><td>UV 凝胶成像系统，eBOX VX5</td><td>Vilber Lourmat</td><td></td><td>琼脂糖凝胶电泳可视化</td></tr><tr><td>注射用配制用水</td><td>Aguettant</td><td>PROAMP</td><td>PCR</td></tr></tbody></table>

实验进化群体中结构变异动态的追踪

Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations

结构变异（SVs）（即缺失、插入、重复和倒位）现已被证实对表型变异具有重要作用，因此在疾病决定或适应新环境等过程中也具有重要意义。然而，单核苷酸变异受到的关注远多于结构变异，这可能是因为单核苷酸变异更容易被检测，且其表型效应更易于预测。短读长和长读长深度测序技术的发展已显著提高了结构变异的检出能力，但从群体测序（poolseq）数据中定量分析其频率在技术上仍然复杂且成本较高。
本文介绍了一种相对简单且成本较低的方法，可使研究人员追踪结构变异（SV）等位基因频率的动态变化。作为应用示例，我们追踪了细菌实验进化群体中插入序列（IS）插入突变频率的变化。该方法基于在结构变异边界周围设计三引物组合，使得扩增野生型（WT）和衍生等位基因所产生的扩增子在大小上至少相差5%，同时保证两者的扩增效率相近。随后通过毛细管电泳平行检测各扩增子的产量，并依据标准曲线进行归一化定量。该方法可轻松拓展应用于其他类型结构变异（如缺失、重复和倒位）频率的定量分析，以及自然群体（包括患者体内病原体群体）的pool-seq研究。

利用从 S2.11 群体第 1,000 代分离得到的祖先克隆和高突变克隆中提取的 DNA，我们建立了如图 2所示的校准曲线。通过毛细管电泳并行仪器测定的实验室制备 DNA 混合物中的实际突变体比例之间呈现出线性关系，斜率为 1.0706，R2 为 0.9705。此外，生物学重复之间具有良好的一致性；在校准曲线的九个数据点中，标准差介于 0.61 至 17.74 之间。
<img alt="WT/突变型DNA混合物分析的线性回归图 y=0.9064x+8.6084，R²=0.9705。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64709/64709fig02.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
<strong class="xfig" style="font-...

我们开发了一种经济高效的方法，用于追踪非单核苷酸多态性等位基因的动态变化，该方法可轻松适用于实验进化过程中的冷冻样本库。通过将三重PCR技术与自动化平行毛细管电泳相结合，可在实验进化的整个过程中定量检测插入等位基因的相对频率。

结构变异（SVs）（即缺失、插入、重复和倒位）现已证实对表型变异具有重要作用，且……

插入、缺失、重复和倒位等结构变异在以往的实验中较难追踪，且其频率无法通过扩增子测序进行准确测定。本文提供了一种简单且成本效益高的技术，通过三重引物设计与并行毛细管电泳相结合，实现对结构变异等位基因频率随时间变化的监测。该方法旨在补充实验进化研究中的终点测序，并追溯新出现的从头等位基因的频率变化。我们希望该方法也能使研究宿主内病原体数据的科研人员受益。演示该实验流程的是来自我们实验室的研究助理 Jeanne Hamet。方法的各个步骤将通过一个实例进行展示，该实例中衍生等位基因是由插入到一种名为 mutS 的细菌基因中的 IS10 插入序列所导致的。首先设计一对引物，用于扩增野生型等位基因上突变插入位点附近的短片段。在插入序列内设计第三条正向引物（正向引物2），使其产生的扩增片段长度与野生型扩增片段略有差异。实验起始步骤为提取培养24小时的野生型和突变型等位基因克隆的DNA。在定量DNA后，用纯水将每种DNA提取物稀释至每微升5纳克。将两个样本按1:1比例混合固定。设置一个20微升的反应体系，包含10纳克DNA样本、引物和PCR预混液。接下来，使用 2% 琼脂糖凝胶通过电泳分离 PCR 产物。需在凝胶上验证野生型与突变型扩增子之间的大小差异。为获得标准曲线，首先将野生型 DNA 与突变型 DNA 按不同比例混合。将PCR产物稀释至0.1纳克/微升的浓度。准备分离胶时，混合新鲜凝胶与染料。更换进样缓冲液。将清洗缓冲液置于毛细管平行电泳仪的正确抽屉位置。向96孔板的各孔中加入22微升稀释液标记物。然后向每个样本孔中加入2微升稀释后的PCR产物。向一个样品孔中加入高灵敏度试剂盒的DNA大小标记物，其大小范围为1至6,000个碱基对。将微孔板放入平行毛细管电泳仪中，并在仪器软件中选择运行程序。使用数据分析软件分析结果。首先，根据已知大小确定各个峰的位置。对每个扩增产物进行定量，以生成标准曲线。最后，验证两个等位基因的相对含量是否被准确测定。然后利用该标准曲线计算PCR扩增及平行毛细管电泳后结构变异的数量。这些代表性结果源于mutS基因中的破坏性插入。mutS基因的敲降导致超突变表型，使细菌能够积累比其基础突变率更多的突变。通过所介绍的方法，对 mutS 结构变异频率在 1000 代过程中进行了追踪。结果显示，新出现的突变等位基因呈现出非单调性变化轨迹。该突变等位基因首次在第 680 代被检测到。随后，该等位基因频率迅速上升，在第713代时达到67%。此后增长趋于停滞，在接下来的53代中仅上升了10%，达到76%。出乎意料的是，突变等位基因频率在随后的13代内从76%下降至49%，之后又回升并最终达到固定。该方法将有助于从事实验进化研究的研究人员。本方案使用户能够利用冷冻保存的样本，探索仅通过终点测序数据无法观察到的进化轨迹。

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Biology

生物学

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了解如何利用三重引物设计与平行毛细管电泳技术，在实验进化群体中动态追踪结构变异等位基因频率。该方法以mutS基因为例，揭示了1000代进化过程中非单调的等位基因轨迹，为研究进化动态提供了经济高效的新工具。

实验进化群体中结构变异动态的追踪

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