实验进化群体中结构变异动态的追踪

插入、缺失、重复和倒位等结构变异在以往的实验中较难追踪，且其频率无法通过扩增子测序进行准确测定。本文提供了一种简单且成本效益高的技术，通过三重引物设计与并行毛细管电泳相结合，实现对结构变异等位基因频率随时间变化的监测。该方法旨在补充实验进化研究中的终点测序，并追溯新出现的从头等位基因的频率变化。

我们希望该方法也能使研究宿主内病原体数据的科研人员受益。演示该实验流程的是来自我们实验室的研究助理 Jeanne Hamet。方法的各个步骤将通过一个实例进行展示，该实例中衍生等位基因是由插入到一种名为 mutS 的细菌基因中的 IS10 插入序列所导致的。

首先设计一对引物，用于扩增野生型等位基因上突变插入位点附近的短片段。在插入序列内设计第三条正向引物（正向引物2），使其产生的扩增片段长度与野生型扩增片段略有差异。实验起始步骤为提取培养24小时的野生型和突变型等位基因克隆的DNA。

在定量DNA后，用纯水将每种DNA提取物稀释至每微升5纳克。将两个样本按1:1比例混合固定。设置一个20微升的反应体系，包含10纳克DNA样本、引物和PCR预混液。

接下来，使用 2% 琼脂糖凝胶通过电泳分离 PCR 产物。需在凝胶上验证野生型与突变型扩增子之间的大小差异。为获得标准曲线，首先将野生型 DNA 与突变型 DNA 按不同比例混合。

将PCR产物稀释至0.1纳克/微升的浓度。准备分离胶时，混合新鲜凝胶与染料。更换进样缓冲液。

将清洗缓冲液置于毛细管平行电泳仪的正确抽屉位置。向96孔板的各孔中加入22微升稀释液标记物。然后向每个样本孔中加入2微升稀释后的PCR产物。

向一个样品孔中加入高灵敏度试剂盒的DNA大小标记物，其大小范围为1至6,000个碱基对。将微孔板放入平行毛细管电泳仪中，并在仪器软件中选择运行程序。使用数据分析软件分析结果。

首先，根据已知大小确定各个峰的位置。对每个扩增产物进行定量，以生成标准曲线。最后，验证两个等位基因的相对含量是否被准确测定。

然后利用该标准曲线计算PCR扩增及平行毛细管电泳后结构变异的数量。这些代表性结果源于mutS基因中的破坏性插入。mutS基因的敲降导致超突变表型，使细菌能够积累比其基础突变率更多的突变。

通过所介绍的方法，对 mutS 结构变异频率在 1000 代过程中进行了追踪。结果显示，新出现的突变等位基因呈现出非单调性变化轨迹。该突变等位基因首次在第 680 代被检测到。

随后，该等位基因频率迅速上升，在第713代时达到67%。此后增长趋于停滞，在接下来的53代中仅上升了10%，达到76%。出乎意料的是，突变等位基因频率在随后的13代内从76%下降至49%，之后又回升并最终达到固定。该方法将有助于从事实验进化研究的研究人员。

本方案使用户能够利用冷冻保存的样本，探索仅通过终点测序数据无法观察到的进化轨迹。