跟踪实验进化人群中结构变异的动态
February 3rd, 2023
我们开发了一种具有成本效益的方法来跟踪非单核苷酸多态性等位基因动力学，该方法可以轻松适应实验进化冷冻档案。将三重PCR技术与自动平行毛细管电泳相结合，以量化实验进化过程中插入等位基因的相对频率。
插入、缺失、重复和反转等结构变异在过去更难通过实验进行跟踪，并且它们的频率无法通过扩增子测序准确测量。在这里，我们提供了一种简单的具有成本效益的技术，该技术将一式三份引物设计和平行毛细管电分离置换相结合，以随着时间的推移跟踪结构变异等位基因频率。该方法旨在补充实验进化中的终点测序，并追溯新兴新生等位基因的频率。
我们希望这种方法也能使那些使用宿主内病原体数据的人受益。演示该程序的将是来自我们实验室的研究助理Jeanne Hamet。这些方法的不同步骤将显示在派生等位基因由IS10插入称为mutS的细菌基因中产生的情况下。
首先设计一对引物，以扩增突变插入位点周围野生型等位基因上的短扩增子。在插入序列中设计第三个引物正向引物二，以从野生型扩增子中产生轻微的大小变量。首先从固定野生型和突变等位基因克隆的 24 小时培养物中提取 DNA。
定量DNA后，用水将每个DNA提取物稀释至每微升5纳克。以 50/50 的比例固定两个样本。设置一个 20 微升反应，其中包含 10 纳克 DNA 样品、引物和 PCR 预混液。
接下来，使用2%琼脂糖凝胶通过电泳分离PCR产物。野生型扩增子和突变体之间的大小差异必须在凝胶上验证。为了获得校准曲线，首先以各种比例混合野生型DNA和突变型DNA。
将PCR产物稀释至每微升浓度0.1纳克。要制备分离凝胶，请将新鲜凝胶和染料混合。更换入口缓冲液。
将冲洗缓冲液放在平行毛细管电泳仪的正确抽屉位置。将22微升稀释剂标记物添加到96孔板的孔中。现在向每个样品孔中加入两微升稀释的PCR产物。
在一个孔中，从高灵敏度试剂盒中添加一个DNA大小的分子量标准，大小范围为1到6， 000个碱基对。将微孔板放入平行毛细管电泳仪中，在仪器软件上选择运行。使用数据分析软件分析结果。
首先，根据峰的已知大小识别峰。量化每个扩增子以产生校准曲线。最后，验证是否正确测量了两个等位基因的相对数量。
然后使用该校准曲线计算PCR扩增和平行毛细管电泳后结构变异的数量。这些具有代表性的结果是在mutS基因的破坏性插入之后。敲低和mutS导致超突变表型，允许细菌采样比其基本突变率更多的突变。
使用所提出的方法，跟踪了1000代的mutS结构变异频率。揭示了新兴突变等位基因的非单调轨迹。突变等位基因首次在第680代被发现。
然后等位基因的频率迅速增加，到713代达到67%。然后这种增长停滞不前，在接下来的53代中仅增加了10%，达到76%出乎意料的是，突变等位基因频率在13代的过程中从76%下降到49%，之后它增加到固定。这种方法将使那些从事实验进化的人受益。
该协议允许用户获取冻结的档案并探索进化轨迹，否则端点测序数据无法观察到这些轨迹。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本研究提出了一种新颖的、经济有效的方法来跟踪结构性变异等位基因，特别是插入在实验进化过程中的动态变化。通过结合三重引物设计和并行毛细管电泳，该技术可以揭示等位基因频率随时间的变化，展示了其在研究进化轨迹方面的实用性。
关键研究组成部分
研究领域
- 遗传学
- 实验进化
- 结构变异
背景
- 结构变异一直是用常规方法难以量化的。
- 放大和测量插入等位基因频率对于理解它们在进化中的作用至关重要。
- 该方法旨在补充现有的测序技术。
使用的方法
- 三重PCR技术与自动并行毛细管电泳相结合
- 细菌模型系统（mutS基因）
- 等位基因频率的定量评估
主要结果
- 成功跟踪了一个mutS等位基因在1000代中的非单调轨迹。
- 揭示了复杂的动态变化，其中突变频率最初激增，然后在固定之前下降。
- 展示了在分析固定冷冻样本用于进化研究中的应用。
结论
- 该研究引入了一种观察结构变异动态的稳健方法，这些变异在端点测序中容易被忽略。
- 这种方法为研究实验进化和病原体动态的研究者提供了重要的意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantifying structural variant (SV) allele dynamics is critical for understanding genetic adaptation and phenotypic diversity in microbial and pathogen populations. This method enables precise, cost-effective tracking of SV frequencies, addressing a key gap in discovery-stage genomics and supporting predictive confidence in variant-driven functional studies. Its scalability and compatibility with pooled samples position it as a valuable tool for early discovery and translational research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative tracking of SV allele frequencies to clarify variant-driven phenotypes.
- Supports functional target validation by monitoring de novo allele emergence in evolving populations.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing non-monotonic variant trajectories over time.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological systems for downstream screening by quantifying SVs in pooled samples.
- Standardizes SV detection with reproducible primer design and capillary electrophoresis readouts.
- Enables scalable, parallelized analysis suitable for high-throughput variant screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by enabling SV quantification in intra-host pathogen populations.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by tracking variant dynamics in archived samples.
- Provides predictive value for risk-adjusted advancement decisions in microbial and pathogen research.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling dynamic SV tracking from early hypothesis testing through translational research, especially in microbial and pathogen systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying emerging SVs.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative SV measurements for assay readiness.
- Analytics: Provides calibration-based quantification and comparative analysis of allele frequencies.
- Translational Research: Enables SV tracking in natural and intra-host populations, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable, cost-effective workflow for SV quantification across diverse projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in SV-driven studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible SV quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying variant impact early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of SV-related targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primer design and capillary electrophoresis instrumentation.
- Needs access to parallel capillary electrophoresis and quantitative analysis software.
- Demands cross-team standardization of calibration and normalization protocols.
- Adaptable to various SV types and pooled sample contexts with appropriate primer sets.
- Limited by requirement for detectable amplicon size differences and calibration accuracy.
