植物原生质体的荧光激活细胞分选

一个隔离特定的细胞类型，从植物材料的方法是证明。这种技术采用特定类型的细胞，细胞分离和荧光激活细胞分选表达荧光蛋白的转基因标记线。此外，增长的设置是在这里建立，有利于治疗

该程序依赖于在特定细胞类型中表达 GFP 的植物，然后可以使用荧光激活细胞分选或 FACTS 将其从其余植物细胞中分离出来。这个例子使用在拟南芥的特定细胞类型中表达的两条标记线。Aliana 根幼苗生长在植物托盘或琼脂平板上。

它们的根被收获并用细胞壁消化酶处理。一小时后，过滤溶液以去除大碎片。然后离心溶液并除去上清液。

随后通过传真分离 GFP 阳性原生质体。分选后的材料可用于细胞类型特异性分析，例如全基因组转录谱。大家好，我是来自纽约大学生物系 Ken Birnbaum 实验室的 Basian Barman。

今天，我们将向您展示植物原生质体的荧光激活细胞分选程序。在此示例中，我们将对拟南芥路线中的两种特定细胞类型进行排序。我们在实验室中使用该程序来研究细胞类型特异性转录谱。

那么让我们开始吧。要开始此过程，请培养野生型幼苗以及具有 GFP 细胞类型特异性表达的幼苗。驱动 GFP 的稻草人启动子标记一组幼苗中的根内皮和静止中心。

在另一组中，根静止中心由驱动 GFP 的 walk 5 启动子标记。幼苗以水培方式生长，FIA 托盘位于尼龙过滤器的顶部，让根部生长到生长介质中。或者，植物可以在尼龙网和垂直放置的 1% 琼脂平板上生长。

除了帮助收获根部外，过滤器还允许将幼苗大量转移到新的植物托盘或琼脂平板上，在那里可以补充感兴趣的催化剂。这可以用于研究细胞类型对营养物质、激素或应激治疗的特异性转录反应。在荧光显微镜下检查以验证荧光标记物是否按预期表达。

确保标记物的表达模式在应用的处理条件下一致，因为它会因处理而发生变化。继续收获并准备原生质体。首先准备原生质体溶液。

将 1.25% 每体积重量的纤维素酶 0.3%每体积重量、maser 酶 0.4 摩尔 D 甘露醇 20 毫摩尔、MES 和 20 毫摩尔 KCL 混合在软化水中，并在 pH 值为 7.5 时将 pH 值与一摩尔 tris HCL 调节至 5.7。此溶液会略微浑浊。然后将溶液加热至 55 摄氏度 10 分钟。

溶液会变澄清，冷却至室温，然后加入每体积重量 0.1% 的 BSA 10 毫摩尔氯化钙和 5 毫摩尔的 β me capto 乙醇从一个植物托盘中收获一周龄的幼苗。在稻草人 GFP 线或八盘四日龄的情况下走 5G FP 幼苗。用手术刀从尼龙网上刮下根部，然后将它们放入装有原生质体溶液的容器中。

每 10 棵幼苗使用大约 1500 毫升原生质体溶液。在室温下以 75 RPM 的转速轻轻摇动培养瓶 1 小时。较长的孵育时间可能会增加原生质体的产量，但也会增加原生质体本身对基因表达的影响。

现在原生质体已经释放出来，使用 40 微米的细胞过滤器过滤溶液，并将原生质体悬浮液分装在 15 mil 锥形管中。重要的是生成干净的原生质体悬浮液，没有太多的碎片，以防止堵塞事实并最大限度地减少分选细胞所需的时间。将试管放入水平吊篮中，在室温下以 500 G 离心 10 分钟。

请注意，离心速度取决于产生原生质体的植物切片的构成和酶处理过程中产生的细胞碎片的量。离心后，除去大部分上清液，并将含有原生质体的沉淀轻轻重悬于少量剩余的原生质体溶液中。最后，使用血细胞计数器对原生质体进行计数并确定其密度以计算产量并确定事实运行参数。

计数后，检查原生质体。检查它们的完整性、GFP 表达水平和污染细胞碎片的含量。接下来，继续进行传真。

如果没有，请直接进行传真。原生质体可以洗涤、重悬并储存在孵育溶液中，例如没有添加酶或 W five 溶液的 proto 电镀溶液。打开细胞分选仪和工作站计算机。

在这里，我们使用 Becton Dixon and Company 制造的 fria。使用一个 XPBS 作为鞘液并运行流体启动程序。安装一个 100 微米的喷嘴并设置 20 PSI 的护套压力。

设置稳定的流速并校准液滴延迟。请注意，此程序中不显示校准。密度高达 1000 万个细胞/密耳的原生质体悬液可以成功分选。

为了防止原生质体沉淀，请根据事实使用样品搅拌选项。如果堵塞事实是一个问题，则有三个可能的拍摄步骤。首先，执行样品行反冲洗。

其次，稀释原生质体悬浮液以降低密度。第三，通过在离心和复苏悬浮后重复过滤步骤来清理原生质体溶液。仅使用四个参数来区分 GFP 阳性原生质体和 GFP 阴性原生质体，被 488 纳米激光激发后的细胞碎片前向散射是颗粒大小的指标，侧向散射是颗粒粒度的指标。

530 纳米发射是绿色荧光的量度，610 纳米发射是红色光谱自发荧光的量度。首先，为前向散射与侧向散射设置点图。应用电压设置，使测量的事件在绘图中居中。

与自发荧光事件相比，GFP 阳性原生质体可以通过其增加的绿色与红色发射比率来区分。仅设置绿色荧光与红色光谱自发荧光的点图。应用电压设置，使测量事件在图中产生单个对角线总体。

当观察野生型原生质体悬浮液时，GFP 阳性原生质体应产生野生型样品中从未见过的清晰绿色荧光事件群。设置补偿约束以调整绿色荧光和红色光谱自发荧光之间的光谱重叠。使用 GFP 阳性原生质体悬浮液，适当的补偿约束设置将允许更好地分离 GFP 阳性原生质体与非 GFP 原生质体，碎片设置一个门来识别 GFP 阳性事件。

建议每次准备分选实验时都带上非 GFP 原生质体，以帮助定义门边界。最后，设置前向散射阈值截止，以便在分析中留下小碎片。前向散点图与侧向散点图中 GFP 阳性事件的可视化将有助于确定应设置阈值的位置。

在此初始事实运行中设置的参数可以重复用于将来的排序。对于事实的日常使用，需要稍作调整。对于 RNA 提取，准备含有 RNA 提取缓冲液的收集管，最多使用 100 μL 分选体积至 350 μL 提取缓冲液作为指导。

20， 000 次分选事件产生的总分选体积约为 100 微升。现在，传真参数和作模式已设置完毕，收集管已准备就绪，当排序完成后，开始对原生质体进行分类。混合样品收集管，因为细胞悬液可以在顶部混合，在 RNA 提取和 CD NA 扩增后，只需 500 个分选事件可用于微阵列分析。

在这里，我们使用 RNEZ 微量提取试剂盒、WT ovation PICO RNA 扩增系统和 fl ovation CD NA 生物素模块 V 2。以下是来自非 GFP 稻草人、GFP 和 W 5G FP 幼苗的原生质体的典型传真结果，在 x 轴上绿色荧光与红色荧光的每个点图中显示了 100， 000 个事件。在 Y 轴上，落在 GFP 排序门内的事件以绿色突出显示。

这是表达稻草人 GFP 标记根内胚层和静止中心或行走 5G FP 标记根静止中心的幼苗的典型原生质体产量的总结。与根内皮相比，根静止中心的细胞较少。因此，尽管从更多的原生质体开始，但与稻草人 GFP 分选相比，步行 5G FP 分选中表达 GFP 的细胞的产量较小，此处显示的是一式三份样品的典型 RNA 提取结果。

每个样品对应于从 10， 000 个事件中提取的 RNA。在生物分析仪上分析提取的 RNA，显示稻草人 GFP 样品的核糖体峰在顶部，在提取的 RNA 下方的行走 5G FP 样品可以进一步用于微阵列分析。这个对数 2 表达水平的散点图证明了两个重复之间的相似性。

我们刚刚向您展示了如何对植物原生质体进行荧光激活细胞分选以进行细胞类型特异性分析。该技术适用于许多不同的植物组织和物种。低碎片含量和健康的原生质体的良好产量将在转录和其他分析中提供更好的下游结果。

还要记住，保持植物材料的生长条件相同以进行比较很重要。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。