用于细胞表面蛋白质组无标记定量的"细胞表面捕获"工作流程

该协议使我们能够研究存在于各种细胞类型的细胞表面的抗原，以找到对该类型细胞或组织具有特异性的抗原。我们在这里介绍的技术允许从全细胞裂解物中富集细胞膜蛋白，最终通过基于质谱的蛋白质组学进行分析。因此，该方案的一个具体应用是将其应用于肿瘤细胞，以寻找存在于这些癌细胞表面的抗原，而不是可能作为癌症免疫疗法新靶标的正常细胞。

关于此方案需要注意的一点是，针对您感兴趣的实验优化样品输入可能很重要。因此，可能需要多次迭代或滴定才能找到最佳条件。因此，我们实验室的初级专家 Akul Naik 将演示该程序。

首先，将冷冻的生物素标记的细胞沉淀从零下 80 摄氏度中取出，然后在冰上解冻。向沉淀中加入 500 μL 2X 裂解缓冲液，充分混合，并剧烈涡旋 30 秒。在冰上对细胞裂解物进行超声处理，并在 4 摄氏度下以 17、200 G 离心裂解物 10 分钟，以沉淀任何残留的碎片。

在裂解物离心时，将 100 μL NeutrAvidin 琼脂糖树脂珠添加到连接到真空歧管的过滤柱中。轻轻抽真空，然后在珠子上流动 3 毫升洗涤缓冲液 1 来洗涤珠子。从真空歧管中取出过滤柱，盖上底部，然后将澄清的细胞裂解物添加到带有珠子的柱子中。

盖上层析柱顶部，将裂解物与微珠在端对端转子上在 4°C 下孵育 120 分钟。完成裂解液孵育后，将过滤柱放回真空歧管上，并施加温和的真空。通过在珠子上流动 5 毫升洗涤缓冲液 1 来洗涤珠子。

用 5 mL 洗涤缓冲液 2 和洗涤缓冲液 3 重复洗涤步骤。一旦最终洗涤缓冲液完全流过磁珠，从歧管中取出色谱柱。然后向磁珠中加入 100 μL 裂解液，并用移液管将其转移到 1.7 mL 低蛋白结合微量离心管中。

短暂旋转试管以沉淀珠子并去除 50 μL 溶液。接下来，将试管放在 65 摄氏度的加热块振荡器上，以 1000 RPM 的速度摇动 10 分钟。通过添加 210 μL 重悬溶液并上下吹打数次，确保所有干燥的胰蛋白酶都重悬于试剂盒的消化管中，以确保所有干燥的胰蛋白酶都被重悬。

在磁珠孵育结束时，将其从加热块振荡器中取出，并向磁珠中加入 50 μL 重悬的胰蛋白酶溶液。在 37 摄氏度下孵育试管，以 500 RPM 振荡至少 90 分钟以消化蛋白质。消化完成后，将含有磁珠的溶液转移到离心柱中，然后将柱插入 1.7 mL 低蛋白结合微量离心管中。

旋转试管以将消化的肽溶液与珠子分离。接下来，加入 100 微升终止液以终止消化反应并使肽溶液酸化。使用试管适配器，将脱盐柱放入 1.7 mL 低蛋白结合微量离心管中。

将整个酸化肽溶液加入色谱柱中。将色谱柱以 3， 800 G 离心 3 min，使溶液流过色谱柱。丢弃流出液，因为肽现在已结合到色谱柱上。

向色谱柱中加入 200 μL Wash 1 溶液，在室温下以 3， 800 G 离心 3 分钟，然后弃去流出液。用 200 微升 Wash 2 溶液重复洗涤步骤。将色谱柱转移到新标记的 1.7 mL 低蛋白结合微量离心管中。

向色谱柱中加入 100 μL 洗脱液，并在室温下以 3， 800 G 离心 3 分钟。肽现在从色谱柱上洗脱到试管中。将肽溶液放入真空离心机中，使其干燥过夜。

将干燥的肽置于零下 80 摄氏度，直到准备好在质谱仪上进行定量和分析。使用液相色谱串联质谱法进行蛋白质组分析以表征富集的细胞表面蛋白。基于比色肽定量测定获得约 630 ng/μL 的最终肽浓度。

使用 MaxQuant 分析质谱数据并随后对细胞表面蛋白进行数据集分析，在样品中产生了 601 种表面蛋白，约占所有鉴定蛋白质的 27%。此处显示了代表 Andromeda 评分中鉴定蛋白质分布的图，散点图说明了样品间的相关性。箱线图描述了运行间的变异。

样本分布图表示重复的数据质量。要记住的最重要的一点是肽在每个步骤中的位置。最初，它们在溶液中，然后它们与磁珠结合直至消化，然后，它们与脱盐柱结合直至最终洗脱。

按照此程序，有多种方法可以验证一些已鉴定的蛋白质，例如靶向流式细胞术和靶向蛋白质组学。这将提供有关样品中这些蛋白质表达水平的更详细信息。