Name: 小鼠上丘的钙成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 学习利用双光子与宽场显微镜在小鼠上丘进行钙成像的技术，实现单细胞分辨率与全视野神经活动记录。该方法可在保持大脑皮层完整的前提下，长期监测清醒小鼠的视觉信息处理机制。

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本研究受到国家自然科学基金（32271060）的支持。Y.-t.L. 设计了研究方案，进行了实验，分析了数据，并撰写了稿件。Z.L. 和 R.W. 参与了实验工作。

所有实验操作均遵循动物福利指南，并经北京中国脑科学研究院动物实验伦理委员会批准。
注意：本方案的时间安排如下：1）制备吸盘；2）注射病毒；3）植入头板；4）3周后，植入塞子；5）在跑步机上经过约3天的恢复和适应后，进行双光子/宽场成像。
1. 吸盘的制备（图1A）
<ol>
	<li>在丙烯酸培养皿中滴加一滴磷酸盐缓冲液（PBS, 1x），用21 G平头针头接触液滴，通过毛细作用使针头尖端充满液体。</li>
	<li>用半透明硅胶粘合剂覆盖针头尖端，并静置约10分钟使其固化。</li>
	<li>用剪刀将硅胶粘合剂裁剪成直径约2 mm的圆片。</li>
</ol>
2. 制备胶块（图1B）
<ol>
	<li>准备厚度为 0.75 mm 的塑料垫片材料，并在其中心切割出一个 1 cm × 1 cm 的正方形孔。准备两块丙烯酸树脂块。用酒精清洁垫片材料和丙烯酸树脂块，并用镜头纸擦拭干净。</li>
	<li>将垫片材料置于一块丙烯酸树脂块上，在中心处滴加硅胶粘合剂，填充约 90% 的开口（避免产生气泡），然后盖上另一块丙烯酸树脂块并施加约 1 kg 的力，静置 20 分钟。</li>
	<li>在手术显微镜下，使用解剖刀将硅胶粘合剂切割成高 1 mm、宽 1.5 mm 的三角形棱柱，操作时在印有三角形图案的纸张上方进行。</li>
	<li>使用塑料粘性胶带清除三角形棱柱上的任何灰尘，并将其放置在直径为 5 mm、厚度为 0.15 mm 的玻璃盖玻片上。</li>
	<li>将带有三角形棱柱的盖玻片置于电晕处理仪下，开启电晕处理仪，并将其逐渐靠近盖玻片直至出现电火花。保持该位置数分钟，直至棱柱牢固粘附于盖玻片上。 
	注意：此步骤可能因不同型号的电晕处理仪而有所差异。</li>
	<li>将制备好的塞子放入培养皿中，并置于 70 °C 的培养箱中过夜。</li>
</ol>
3. 动物准备及病毒载体注射
<ol>
	<li>使用6周龄（成像时为9周龄）的C57BL/6J（野生型）和Emx1-Cre:Pals1flox/wt（部分皮层缺失）20小鼠，雌雄均可。</li>
	<li>对手术所用的所有材料和器械进行灭菌处理。</li>
	<li>用5%异氟烷对小鼠进行麻醉，术中以1 L/min的流速维持1%-2%异氟烷浓度。通过脚趾夹捏反射消失确认麻醉深度。</li>
	<li>将小鼠固定在立体定位仪上，耳杆固定头部。整个手术过程中，定期在小鼠眼睛上涂抹眼用软膏以防角膜干燥，并使用恒温加热垫维持其体温在37 °C。</li>
	<li>剃除头部毛发，用碘伏和75%乙醇消毒皮肤表面。皮下注射利多卡因（5 mg/kg）、替利定（2 mg/kg）和美洛昔康（2 mg/kg）。 
	注意：不同机构在手术灭菌、镇痛和局部麻醉方面的操作可能有所不同。</li>
	<li>使用手术剪去除覆盖上丘（SC）区域的皮肤以暴露颅骨，用棉签清洁颅骨表面。</li>
	<li>调整立体定位仪，使颅骨表面保持水平。在λ点前0.42 mm、外侧0.5 mm处钻孔，直至暴露硬脑膜。</li>
	<li>使用斜面玻璃微移液管（尖端斜面25°，直径40–50 µm），在距λ点深度1 mm和1.6 mm处注射表达GCaMP6m的腺相关病毒（AAV）（rAAV2/9-hsyn-GCaMP6m；1 × 1013 基因组拷贝/mL，溶于1× PBS中）。</li>
	<li>每个深度注射100 nL，注射速度为50 nL/min，每次注射后等待5分钟。注射完成后，缓慢撤出注射针头。</li>
</ol>
4. 头部固定板的植入
<ol>
	<li>清理颅骨上的肌肉和组织，并用刀片轻刮颅骨表面。若出现出血，使用明胶海绵止血并清除血液。使用自凝牙科粘接树脂水泥将头固定板（图1C）粘附至颅骨。具体操作为：在冰上的陶瓷碗中，混合3/4勺聚合物、3滴单体和1滴催化剂。将混合物涂抹于头固定板和颅骨表面，将两者贴合，并静置5分钟使粘合剂固化。</li>
	<li>注射抗生素（头孢噻呋钠，5 mg/kg，皮下注射）以预防感染。将小鼠从立体定位仪上取下，置于加热垫上恢复。待其从麻醉状态恢复后，放回原有饲养笼。术后3天内提供含布洛芬的饮用水（0.5 mL/50 mL）以进行疼痛管理。</li>
</ol>
5. 植入栓塞（图2）
<ol>
	<li>在病毒注射后3周植入插件。按照步骤3.2-3.5所述，将小鼠麻醉并固定在立体定位仪上。准备用生理盐水浸湿的明胶海绵，以防止可能的出血。</li>
	<li>使用微型钻头在人字缝后0.5 mm处钻出一个3 mm × 2 mm的椭圆形孔，中心位于该位置。将椭圆边缘区域磨薄至出现裂纹。将椭圆记录窗口前方的颅骨磨薄，使盖玻片尽可能接近上丘（SC）。</li>
	<li>使用精细镊子移除骨瓣。在横窦后方切开硬脑膜，并移除该部分硬脑膜。如有需要，使用3 mL注射器向脑部添加人工脑脊液（ACSF），以防止组织干燥。用明胶海绵和棉签将颅骨及记录窗口彻底干燥。</li>
	<li>在记录窗口内滴加一滴硅胶粘合剂。使用吸杯在负压下固定插件。利用电动显微操作器移动吸杯，将插件缓慢下降至硅胶粘合剂中，直至盖玻片接触颅骨。随后将插件向前移动约1 mm，推开横窦以暴露上丘（SC）。此步骤应在硅胶粘合剂变粘之前1-2分钟内完成。</li>
	<li>清洁头固定板，并在插件边缘周围涂抹丁基氰基丙烯酸酯和树脂类牙科水泥，以将插件牢固固定于头固定板上。 
	注意：按照步骤4.2所述提供术后护理。</li>
</ol>
6. 双光子成像（图3）
<ol>
	<li>将动物头部固定在带有头板的旋转跑轮上。将跑轮置于双光子显微镜下，并调整至合适高度。在物镜与头板之间放置一个黑色铝制锥形罩，以防止视觉刺激显示器的光线干扰。让小鼠适应环境约15分钟。</li>
	<li>使用16倍放大、0.8数值孔径（NA）、3 mm工作距离（WD）的物镜在显微镜上进行双光子成像。采用由两个检流计扫描镜控制的钛宝石激光器，以920 nm激发GCaMP6m。调节样品平面处的激光功率在20–80 mW之间。</li>
	<li>以4.8 Hz的频率扫描600 µm × 600 µm的视野，空间分辨率为2.4 µm/像素，并在深度方向上最多成像至350 µm。 
	注意：采样频率和空间分辨率适用于检流计扫描镜，若使用谐振扫描镜需相应调整。</li>
	<li>通过二向色镜收集发射荧光，并经带通滤光片后由光电倍增管（PMT）检测。</li>
	<li>使用旋转编码器记录小鼠在跑轮上的运动情况。采用配备50 mm镜头的相机记录其瞳孔大小和位置。通过记录刺激计算机发送的触发信号，将这些记录与图像采集和视觉刺激同步。</li>
</ol>
7. 双光子成像测量的钙反应分析
<ol>
	<li>使用 SIMA21 或 NoRMCorre22 在成像过程中校正脑组织的运动。</li>
	<li>使用 ImageJ 中的细胞魔棒工具（Cell Magic Wand tool）手动绘制感兴趣区域（ROI），并在 MATLAB 中拟合为椭圆。在去除神经毡污染后，提取每个 ROI 的荧光信号轨迹： 
	<img alt="计算真实荧光的公式：Ftrue=Fraw−r×Fneuropil。" src="/files/ftp_upload/65181/65181eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1"> 
	Ftrue 和 Fraw 分别为 ROI 校正后和原始的荧光强度，Fneuropil 为周围神经毡的荧光强度，r 为离焦神经毡污染因子（本实验系统的取值为 0.7）。该 r 值通过测量血管上的信号进行估算，因血管处的真实荧光 Ftrue = 0，方法如前所述23,24。</li>
	<li>通过减去以每一帧为中心的 15 秒时间窗内的第八百分位数值，去除缓慢的基线漂移25。</li>
	<li>将神经元的视觉反应定义为刺激期间其 ROI 荧光强度相对于基线的相对变化： 
	<img alt="比值公式 \( R = (F_{peak} - F_{baseline}) / F_{baseline} \)；用于数据分析的公式。" src="/files/ftp_upload/65181/65181eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 2"> 
	Fpeak 为视觉刺激期间荧光信号轨迹的峰值强度，Fbaseline 为刺激前 0.5 秒时间段内的平均强度。</li>
</ol>
8. 宽场成像与数据分析（图4）
<ol>
	<li>使用双镜头构建宽视场宏镜

宽视场宏镜，双镜头，显微成像，光学设计，生物成像，实时成像，低倍率高分辨率，组织成像，活体成像，荧光成像4 (图 4A）。串联透镜宏观成像系统由两个相机镜头（50 mm 和 105 mm）连接而成 通过 一个适配器，放大倍数约为 2 倍。</li>
	<li>制备部分皮层突变小鼠，方法如步骤 3.2–3.5 所述。在深度为 200 µm 位于SC每侧的中央。</li>
	<li>约3周后，在脊髓（SC）上方植入一个直径为5 mm的盖玻片。在SC中心位置进行一个4 mm × 3 mm的椭圆形颅骨开窗，周围骨质减薄。随后将盖玻片直接压在脊髓（SC）上，并用树脂水泥固定。</li>
	<li>使用蓝色发光二极管（LED）结合激发滤光片（469 nm ± 35 nm）激发GCaMP6m。通过发射滤光片（525 nm ± 39 nm）后，以10 Hz的频率使用互补金属氧化物半导体（CMOS）相机采集图像。该相机成像区域为5.36 mm × 2.85 mm，空间分辨率为 2.63 µm/pixel.</li>
	<li>将每幅采集的图像与归一化的方框滤波器进行卷积，并将其下采样至原始尺寸的1/4。针对图像中的每个像素，按照步骤7.4所述定义其响应值。 
	注意：按照步骤 4.2 中所述提供术后护理。</li>
</ol>

Two-Photon and Wide-Field Calcium Imaging in the Superior Colliculus

<ol><li>May, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+superior+colliculus%3A+laminar+structure+and+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The mammalian superior colliculus: laminar structure and connections.</a> Progress in Brain Research. 151, 321-378 (2006).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+with+cellular+resolution+reveals+precise+micro-architecture+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex.</a> Nature. 433 (7026), 597-603 (2005).</li>
<li>Ratzlaff, E. H., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tandem-lens+epifluorescence+macroscope%3A+Hundred-fold+brightness+advantage+for+wide-field+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A tandem-lens epifluorescence macroscope: Hundred-fold brightness advantage for wide-field imaging.</a> Journal of Neuroscience Methods. 36 (2-3), 127-137 (1991).</li>
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<li>Mrsic-Flogel, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+map+of+visual+space+in+the+superior+colliculus+of+mice+lacking+early+retinal+waves%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Altered map of visual space in the superior colliculus of mice lacking early retinal waves.</a> The Journal of Neuroscience. 25 (29), 6921-6928 (2005).</li>
<li>Cang, J., Wang, L., Stryker, M. P., Feldheim, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+ephrin-as+and+structured+activity+in+the+development+of+functional+maps+in+the+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Roles of ephrin-as and structured activity in the development of functional maps in the superior colliculus.</a> The Journal of Neuroscience. 28 (43), 11015-11023 (2008).</li>
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<li>Ahmadlou, M., Heimel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preference+for+concentric+orientations+in+the+mouse+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Preference for concentric orientations in the mouse superior colliculus.</a> Nature Communications. 6, 6773(2015).</li>
<li>de Malmazet, D., Kühn, N. K., Farrow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinotopic+separation+of+nasal+and+temporal+motion+selectivity+in+the+mouse+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinotopic separation of nasal and temporal motion selectivity in the mouse superior colliculus.</a> Current Biology. 28 (18), 2961-2969 (2018).</li>
<li>Li, Y. T., Turan, Z., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+motion+direction+in+the+mouse+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of motion direction in the mouse superior colliculus.</a> Current Biology. 30 (17), 3304-3315 (2020).</li>
<li>Gribizis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+cortex+gains+independence+from+peripheral+drive+before+eye+opening%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Visual cortex gains independence from peripheral drive before eye opening.</a> Neuron. 104 (4), 711-723 (2019).</li>
<li>Inayat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+in+the+most+superficial+lamina+of+the+mouse+superior+colliculus+are+highly+selective+for+stimulus+direction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurons in the most superficial lamina of the mouse superior colliculus are highly selective for stimulus direction.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (20), 7992-8003 (2015).</li>
<li>Barchini, J., Shi, X., Chen, H., Cang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+encoding+of+motion+contrast+in+the+mouse+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Bidirectional encoding of motion contrast in the mouse superior colliculus.</a> eLife. 7, 35261(2018).</li>
<li>Savier, E. L., Chen, H., Cang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+locomotion+on+visual+responses+in+the+mouse+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Effects of locomotion on visual responses in the mouse superior colliculus.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (47), 9360-9368 (2019).</li>
<li>Schröder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arousal+modulates+retinal+output%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Arousal modulates retinal output.</a> Neuron. 107 (3), 487-495 (2020).</li>
<li>Ge, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+waves+prime+visual+motion+detection+by+simulating+future+optic+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retinal waves prime visual motion detection by simulating future optic flow.</a> Science. 373 (6553), (2021).</li>
<li>Chen, H., Savier, E. L., DePiero, V. J., Cang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+evidence+for+stereotypical+direction+columns+in+the+mouse+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Lack of evidence for stereotypical direction columns in the mouse superior colliculus.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (3), 461-473 (2021).</li>
<li>Kasai, M., Isa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+light+isoflurane+anesthesia+on+organization+of+direction+and+orientation+selectivity+in+the+superficial+layer+of+the+mouse+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Effects of light isoflurane anesthesia on organization of direction and orientation selectivity in the superficial layer of the mouse superior colliculus.</a> The Journal of Neuroscience. 42 (4), 619-630 (2022).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+apical+complex+couples+cell+fate+and+cell+survival+to+cerebral+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The apical complex couples cell fate and cell survival to cerebral cortical development.</a> Neuron. 66 (1), 69-84 (2010).</li>
<li>Kaifosh, P., Zaremba, J. D., Danielson, N. B., Losonczy, A. S. I. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Python+software+for+analysis+of+dynamic+fluorescence+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">Python software for analysis of dynamic fluorescence imaging data.</a> Frontiers in Neuroinformatics. 8, 80(2014).</li>
<li>Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NoRMCorre%3A+An+online+algorithm+for+piecewise+rigid+motion+correction+of+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data.</a> Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).</li>
<li>Kerlin, A. M., Andermann, M. L., Berezovskii, V. K., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+tuned+response+properties+of+diverse+inhibitory+neuron+subtypes+in+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Broadly tuned response properties of diverse inhibitory neuron subtypes in mouse visual cortex.</a> Neuron. 67 (5), 858-871 (2010).</li>
<li>Göbel, W., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcium+imaging+of+neural+network+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">In vivo calcium imaging of neural network function.</a> Physiology. 22 (6), 358-365 (2007).</li>
<li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake%2C+mobile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).</li>
<li>Evans, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synaptic+threshold+mechanism+for+computing+escape+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synaptic threshold mechanism for computing escape decisions.</a> Nature. 558 (7711), 590-594 (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

实验方案中的关键步骤 
最关键的步骤是第5.2和5.3步中的开颅操作。首先，位于人字缝后方0.5 mm处的颅骨较厚，且内部含有血管，在钻孔过程中容易引起出血，因此应充分准备明胶海绵以止血。其次，在横窦上方去除骨片时，极易发生血管破裂。针对该问题，一种替代方法是先将椭圆形区域内的骨质磨薄，再分片移除；另一种技巧是在抬起骨片前用液体浸润骨质，以更轻松地使硬脑膜与颅骨分离，从而避免出血。
另一个关键步骤是第5.4步中的插头植入，整个过程应持续1-2分钟。若出现问题，可首先使用显微操作器将插头移动至ACSF中的合适位置，并确定插头的最终位置。然后，加入硅胶粘合剂，并以适当速度将插头移至最终位置。
意义 
本方案具有两个优点。首先，它提供了在皮层完整的野生型小鼠中以单细胞分辨率成像后内侧上丘（SC）的详细步骤，而以往的报道中需吸除覆盖的皮层以暴露前外侧上丘。其次，该方案详细描述了如何利用宽场钙成像技术对部分皮层缺失突变小鼠的整个上丘进行成像。这两种方...

上丘（SC）是所有脊椎动物中一个重要的视觉中枢。在哺乳动物中，它直接接收来自视网膜和视觉皮层的输入1。尽管光学记录技术已广泛应用于大脑皮层2,3,4,5，但由于光学通路受限，该技术在上丘中的应用受到阻碍6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19。本实验方案旨在详细介绍两种互补的方法，用于在上丘中进行神经活动的光学记录。
上丘（SC）位于皮层和横窦下方，这限制了对丘脑神经元的光学通路。克服这一限制的一种方法是吸除覆盖的皮层，暴露前外侧上丘7,9,10,13,14,19。然而，由于上丘接收来自皮层的输入，此类操作可能会影响上丘神经元对视觉刺激的反应。为了克服这一限制，本文详细描述了一种替代方案，即使用硅塞对后内侧上丘的浅层进行成像，同时保持皮层完整8,11。具体而言，为实现单细胞分辨率，我们采用双光子显微镜对野生型小鼠后内侧上丘中的钙反应进行成像。此外，为实现大范围覆盖，我们采用宽场显微镜对一只后侧皮层未发育的突变小鼠的整个上丘进行成像20。
本方案中描述的两种方法相互补充。无需消融皮层的双光子钙成像适用于记录神经元活动&#160;在保持皮层输入完整的前提下实现单细胞分辨率。宽场钙成像适用于记录整个上丘（SC）的神经活动，但会牺牲空间分辨率。

<table><tbody><tr><td>16倍物镜</td><td>尼康</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mm镜头</td><td>Computar</td><td>M5018-MP2</td><td></td></tr><tr><td>5 mm 盖玻片</td><td>沃纳仪器</td><td>CS-5R</td><td></td></tr><tr><td>带通滤光片</td><td>Chroma Technology</td><td>HQ575/250 m-2p</td><td></td></tr><tr><td>氰基丙烯酸丁酯</td><td>Vetbond，世界精密仪器公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于监测瞳孔的相机</td><td>FLIR</td><td>BFS-U3-04S2M-CS</td><td></td></tr><tr><td>用于宽场成像的相机</td><td>巴斯勒</td><td>acA2000-165&amp;micro;m</td><td></td></tr><tr><td>电晕处理机</td><td>Electro-Technic Products</td><td>BD-20AC</td><td></td></tr><tr><td>二向色镜</td><td>Chroma Technology</td><td>T600/200dcrb&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>检流计</td><td>剑桥科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃珠灭菌器</td><td>真实世界数据</td><td>RS1502</td><td></td></tr><tr><td>微型钻孔器</td><td>真实世界数据</td><td>78001</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>四极杆</td><td></td></tr><tr><td>光电倍增管</td><td>滨松</td><td>R3896</td><td></td></tr><tr><td>旋转编码器</td><td>USdigital</td><td>MA3-A10-125-N</td><td></td></tr><tr><td>自固化牙科粘接树脂水门汀&amp;nbsp;</td><td>SuperBond C&amp;amp;B，Sun Medical Co, Ltd.，日本守山</td><td></td><td></td></tr><tr><td>恒温加热垫&amp;nbsp;</td><td>RWD</td><td>69020</td><td></td></tr><tr><td>钛宝石激光器</td><td>Spectra-Physics</td><td>Mai Tai HP DeepSee</td><td></td></tr><tr><td>半透明硅酮粘合剂&amp;nbsp;</td><td>Kwik-Sil，World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>跑步机</td><td>Xinglin Biology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;病毒株&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m</td><td>中国北京脑科学研究院病毒载体中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;动物&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J野生型</td><td>北京脑科学研究院中国实验室动物资源中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Emx1-Cre</td><td>杰克逊实验室&amp;nbsp;</td><td>5628</td><td></td></tr><tr><td>Pals1flox/wt</td><td>Christopher A. Walsh 实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH Image</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labview</td><td>国家仪器公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠上丘钙成像

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

上丘（SC）是所有脊椎动物中进化上保守的中脑结构，是在大脑皮层出现之前最复杂的视觉中枢。它直接接收来自约30种视网膜神经节细胞（RGCs）的输入，每种细胞编码特定的视觉特征。目前尚不清楚上丘仅仅是继承了视网膜的特征，还是在上丘中发生了额外的、甚至是从头开始的信息处理。为了揭示上丘中视觉信息的神经编码机制，本文提供了一种在清醒小鼠中使用两种互补方法进行光学记录视觉反应的详细方案。其中一种方法采用双光子显微镜，在不剥离覆盖皮层的情况下以单细胞分辨率成像钙活动；另一种方法则利用宽场显微镜对皮层大部分未发育的突变小鼠的整个上丘进行成像。本方案详细描述了这两种方法，包括动物准备、病毒注射、头固定板植入、插件植入、数据采集和数据分析。代表性结果表明，双光子钙成像可在单细胞分辨率下揭示视觉诱发的神经元反应，而宽场钙成像则可揭示&#160;整个上丘范围内的神经活动。通过结合这两种方法，可以在不同空间尺度上揭示上丘中的神经编码，这种联合策略也可应用于其他脑区的研究。

图1A、B 分别展示了如何制作吸盘和插头。图2 展示了成功植入插头的方法。植入插头后，后内侧上丘（SC）被暴露，如图2D所示。图3 展示了使用双光子显微镜成像的一个野生型小鼠上丘神经元的钙反应。三角棱镜在显微镜下易于识别，可用于定位成像位置（图3B）。视觉反应以单细胞分辨率显示（图3C、D 及 视频1）。图4 展示了使用宽场显微镜成像的一个部分皮层突变型小鼠上丘神经元的钙反应。所获取的图像首先被下采样至原始尺寸的四分之一（图4B）。视觉诱发的钙反应显示于上丘两侧（<...

本方案详细描述了在清醒小鼠上丘（SC）中成像钙反应的实验流程，包括在野生型小鼠中利用双光子显微镜对单个神经元活动进行成像，同时保持皮层完整；以及在部分皮层缺失的突变型小鼠中利用宽场显微镜对整个上丘进行成像。

上丘（SC）是所有脊椎动物中一种在进化上保守的中脑结构，是视觉信息在到达大脑皮层之前最复杂的视觉中枢……

我的研究聚焦于视觉信息处理机制中的神经编码。我们致力于揭示视觉信息在大脑中，特别是在上丘中的编码方式及其潜在的神经机制。为了理解视觉信息处理过程，科学家们综合运用多种方法，包括神经元形态学、顺行和逆行示踪、IL测序、神经建模、机器学习等。挑战在于移除覆盖在SSA切口上的骨螺钉，并将骨片整体抬起，这种方法很可能失败，因为骨片与硬脑膜相连接。通过将两张图像合并到一幅宽场钙成像图中，我们近期的研究揭示了小鼠上丘（SC）在单细胞分辨率和全局尺度上对运动方向响应的功能架构。我们发现，在全局范围内，具有相似偏好性的神经元形成斑块状分布，其尺度可达500微米，这些神经元对朝向鼻侧向上的运动方向表现出响应偏好。通过本实验方案，我们解决了两项研究难题。首先，研究人员能够在不损伤皮层的情况下，以单细胞分辨率对小鼠上丘进行长期钙成像。其次，研究人员可以利用宽场显微镜记录上丘整个区域的神经活动。本方案提供了一种在皮层完整的野生型小鼠中，以单细胞分辨率对后内侧上丘进行成像的激光方法。同时，我们使用一种生物相容性塞子暴露上丘，从而减少对长期成像的影响。我们的结果为研究大视野范围内视觉信息的神经编码提供了一种途径。结合光遗传学技术，可研究来自不同脑区的半侧输入对上丘（SC）神经活动的调控作用。通过在丙烯酸培养皿中滴加一滴PBS开始制作吸管。使用21号平头针，利用毛细作用使针尖充满PBS。用半透明硅胶粘合剂覆盖针尖，并静置约10分钟。用剪刀将硅胶粘合剂裁剪成直径为2毫米的圆片。准备塞子时，取一片厚度为0.75毫米的塑料垫片，并在其中心裁出一个1厘米×1厘米的正方形孔。用酒精清洁垫片和两块丙烯酸块，并用镜头纸擦拭。将垫片材料放在一块丙烯酸块上，并在中心位置注入硅胶粘合剂，填充至开口的90%。再放上另一块丙烯酸块。施加约一千克的力，静置20分钟。在手术显微镜下，用手术刀将硅胶粘合剂切割成 1 × 1.5 毫米的三角棱柱。使用粘性塑料胶带去除三角棱柱上的任何灰尘，并将其放置在玻璃盖玻片上。将带有三角棱柱的盖玻片置于电晕处理仪下，然后开启仪器。将电晕处理仪移近盖玻片，直至出现电火花，并保持该位置数分钟，直到棱镜与盖玻片粘合。将插头放入培养皿后，在70摄氏度下孵育过夜。首先，使用耳杆将麻醉后的小鼠固定在立体定位仪上。在小鼠眼部涂抹眼膏以防止干燥，并使用恒温加热垫将小鼠体温维持在37摄氏度。剃除毛发并对手术部位进行消毒后，注射利多卡因、替利定和美洛昔康。去除脊髓上方皮肤后，用棉签清洁颅骨。调整立体定位仪，直至颅骨表面平整。使用钻头在人字缝外侧0.5毫米、前方0.42毫米处钻孔，直至暴露硬脑膜。使用斜面玻璃微移液管，在距人字缝深度1毫米和1.6毫米处注射表达GCaMP6m的腺相关病毒（AAV）。注射后，缓慢撤出注射器，随后进行头板植入。将病毒载体注射到小鼠脑内后，清理覆盖在颅骨上的肌肉和组织，并用刀片轻刮颅骨表面。在冰上的陶瓷碗中，通过混合四分之三勺聚合物、三滴单体和一滴催化剂来配制牙科粘合树脂胶泥。将混合物涂抹于头板和颅骨上，进行固定，并等待粘合剂固化五分钟。最后，注射抗生素以预防感染。将小鼠从立体定位仪上取下后，将其置于加热垫上恢复，并在麻醉苏醒后放回饲养笼。病毒注射三周后，对小鼠进行麻醉，并使用头固定板将其固定在立体定位仪上。用生理盐水浸湿明胶海绵，以防止可能的出血。使用微型钻头在人字缝后0.5毫米处创建一个3毫米×2毫米的椭圆形区域。将椭圆形边缘区域磨薄至出现裂纹，然后进一步磨薄椭圆记录窗前方的颅骨，以便将盖玻片紧密贴近脊髓。使用精细镊子取下骨瓣。在横窦后方沿硬脑膜做一切口，并移除该部分硬脑膜组织。用明胶海绵和棉签将颅骨和记录窗干燥，然后在记录窗内滴加一滴硅胶粘合剂。使用吸杯通过负压固定塞子，并利用电动显微操作器移动吸杯，将塞子缓慢下降至硅胶粘合剂中，直至盖玻片接触颅骨。头板清洁后，在塞子边缘涂抹丁基氰基丙烯酸酯和树脂水泥，以将塞子固定在头板上，随后进行成像。植入头板和堵头后，将动物固定在带有头板的旋转跑轮上。将跑轮置于双光子显微镜下方，并调节至适当高度。在物镜与头板之间放置一个黑色铝制锥形罩，以防止视觉刺激显示器产生的光线干扰。进行双光子成像时，将样品平面上的激光功率调节至20至80毫瓦之间。以4.8赫兹的频率扫描600乘以600微米的视野，空间分辨率为每像素2.4微米，并对深度达350微米范围内的神经活动进行成像。使用旋转编码器记录小鼠在跑步机上的运动情况。使用配备50毫米镜头的相机记录其瞳孔大小和位置。最后，通过记录刺激计算机发送的触发信号，将这些记录和图像采集与视觉刺激同步。展示了野生型小鼠上丘神经元的钙反应以及荧光在各图像间的标准差投影。首先，在大脑皮层后部未能发育的突变小鼠中，向上丘（SC）每侧中心部位深度200微米处注射100纳升表达GCaMP6M的腺相关病毒（AAV）。约三周后，在上丘上方植入直径为5毫米的盖玻片。固定盖玻片后，通过发射滤光片以10赫兹的频率使用CMOS相机采集图像。采用宽场显微镜对部分皮层缺失突变小鼠上丘神经元的钙反应进行成像。获取的图像被下采样至原始尺寸的四分之一，并展示了视觉诱发的钙反应。

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神经科学

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小鼠上丘钙成像

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