Name: 肠脑神经通讯实时分析:响应肠道葡萄糖刺激的皮层宽钙动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: 学习利用新型低创伤导管固定技术在小鼠模型中实时监测肠脑神经通讯，通过宽场钙成像观察葡萄糖刺激对皮层钙动力学的快速调控机制。

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本研究由御茶水女子大学、KAKENHI 基金（18K14859，20K15895）、JST FOREST 计划（课题编号 JPMJFR204G）、光科学技术研究基金会、花王健康科学研究所研究助成、日本化学创新协会以及泰尔茂生命科学基金会资助。作者感谢高桥贵、原田和希和夏野明世提供的帮助。&#160;感谢他们对实验的监督。作者还感谢实验室成员提供的支持。

所有实验方案均经日本御茶水女子大学机构动物护理与使用委员会批准（动物研究方案编号 22017）。所有动物实验均依照御茶水女子大学动物实验指南开展，该指南符合日本文部科学省颁布的《学术研究机构动物实验及相关活动适当实施的基本指南》。研究过程中尽可能减少所用动物数量。本研究遵循 ARRIVE 指南进行。
1. 转基因小鼠的制备
<ol>
	<li>进行本实验时，使用成年雄性和雌性 BAC GLT-1-G-CaMP7 #817 转基因小鼠品系，即 G7NG817 小鼠24,25（年龄大于 8 周）。G7NG817 小鼠25的背景品系为 C57BL/6J。</li>
	<li>将小鼠饲养在 12 小时光照/12 小时黑暗的循环条件下，每笼最多饲养五只。</li>
</ol>
2. 导管的制备
<ol>
	<li>使用剪刀将硅胶管（内径 0.5 mm，外径 1.0 mm）裁剪至精确长度为 7 cm（图 1A-a）。 
	注意：操作前，剪刀和硅胶管均已灭菌。</li>
	<li>将微小的塑料珠（内径 3 mm，外径 5 mm）粘附于裁剪好的管子上，确保其距离管端 3 mm 处（图 1A-b）。使用氰基丙烯酸酯胶水（医用或普通型号均可）将珠子牢固固定。</li>
	<li>切除 23 G 针头的尖端，随后从针尖处截取 1.5 cm 长度的针段（图 1A-c）。</li>
	<li>将步骤 2.3 中截取的 23 G 针段从硅胶管未粘附珠子的一端插入管口（图 1A-d）。</li>
</ol>
3. 注射器的制备
<ol>
	<li>使用无菌镊子从针头尖端截取 1 cm（图 1B-a）。 
	注意：确保切断端的开口保持完整，未发生变形，因为任何形变都可能阻碍注射液的流动。</li>
	<li>将步骤 3.1.1 中改装好的 23 G 注射针连接至 2.5 mL 注射器（图 1B-b）。</li>
	<li>将硅胶管截成所需长度（本实验中为 15 cm），并套在 23 G 注射针外侧（图 1B-c）。 
	注意：所用管路长度会影响溶液的输送体积。例如，使用 15 cm 管路时，实验结束后约有 50 µL 溶液残留。</li>
	<li>从针头尖端起 1.5 cm 处切断 23 G 注射针。</li>
	<li>将步骤 3.4 中截取的针段与步骤 3.3 中制备的硅胶导管连接（图 1B-d）。 
	注意：确保步骤 3.1 和 3.4 中形成的开口在切割后未发生形变。若需校正，可使用镊子恢复其圆形结构。</li>
</ol>
4. 胃部定位
<ol>
	<li>通过专用麻醉舱以3.0%异氟烷吸入法对小鼠实施麻醉。涂抹眼用软膏以防止眼睛干燥。</li>
	<li>将麻醉后的小鼠从吸入麻醉室小心转移至手术台，确认小鼠已处于麻醉状态。在整个操作过程中提供保温支持。</li>
	<li>将小鼠仰卧放置，使其口部靠近吸入装置，并将异氟烷浓度从3.0%调节至2.0%。 
	注意：将异氟烷面罩的下段与其上段分离，并使用胶带将分离后的面罩（上段）固定在手术台上。</li>
	<li>使用胶带将小鼠的口腔、前肢和后肢固定于手术台上。 
	注意：即使小鼠已麻醉，通过将其固定在手术台上也可防止因动物移动而导致的手术误差。</li>
	<li>使用脱毛膏去除小鼠左上腹部的毛发（手术区域周围150%范围）。在手术部位局部涂抹局部镇痛剂，等待5分钟后继续操作。</li>
	<li>在腹部皮肤上涂抹局部麻醉凝胶，等待5至10分钟。随后，用碘伏和70%乙醇交替对术区进行三次消毒。通过夹趾反应确认麻醉深度，用无菌手术巾覆盖动物。做一长约1.5 cm的皮肤切口图1C- b，位于腹部正中线右侧1 cm、剑突下5 mm处（图1C- c然后，在与初始皮肤切口相同的位置，于腹壁上做一个1.5 cm的切口。 
	注意：操作时需谨慎，避免对下方肝脏造成损伤。</li>
	<li>使用钝头镊子将肝左叶轻柔地向侧方移位，以暴露其下方的胃。</li>
</ol>
5. 导管插入
<ol>
	<li>抬起胃部，并小心地通过切口将其取出。 
	注意：务必格外小心，以保护邻近器官（尤其是肝脏）的完整性，避免对胃部施加过度的力。</li>
	<li>使用剪刀在幽门窦处制造一个微小穿孔（直径约1.5 mm）。</li>
	<li>将导管末端插入穿孔中，确保导管上的小珠与幽门窦直接接触。 
	注意：导管在插入前需用0.1%至0.5%的葡萄糖酸氯己定溶液进行消毒。</li>
	<li>使用医用级氰基丙烯酸酯胶水将导管上的小珠粘附于胃壁上。 
	注意：确保胃部不与周围器官粘连。</li>
	<li>确认导管牢固附着于胃部后，轻柔地将胃复位至左肝叶下方的自然位置。</li>
	<li>使用聚对二氧环己酮（PDS）缝线缝合腹壁，使导管可延伸至体外；随后以类似方式缝合皮肤切口。</li>
	<li>将小鼠轻柔地放回洁净的笼子中。 
	注意：术后小鼠应单独饲养。在伤口闭合处局部涂抹镇痛药，并按照当地机构指南推荐的镇痛方案进行处理。</li>
	<li>在标准环境中至少恢复48小时。 
	注意：插入小鼠胃内的导管一端用尖端封闭的23G针头封闭，以防止异物进入并避免被咬。由于从腹部伸出的导管较短，可防止小鼠在垫料中拖拽导管，从而避免导管松动或缠绕。</li>
</ol>
6. 准备工作 在体 经颅钙2+ 成像
<ol>
	<li>使用异氟烷对小鼠进行麻醉（诱导浓度为 2%；维持浓度在 0.8% 至 1.0% 之间）。</li>
	<li>使用辅助耳杆将小鼠固定在立体定位仪平台上，以减轻脉动和呼吸的影响。随后，将小鼠置于荧光体视显微镜下。</li>
	<li>采用宽带蓝色荧光滤光片组（激发光波长为 460–490 nm，发射光波长为 520 nm），并配合汞灯光源使用。</li>
	<li>使用相机采集图像，并通过指定的成像软件进行处理。</li>
	<li>使用电动剃须刀或脱毛膏小心去除头皮上的毛发。 
	注意：若使用剃刀，需确保其已彻底消毒，并注意避免划伤皮肤。</li>
	<li>使用浸有稀释至 0.1–0.5% 的葡萄糖酸氯己定溶液的棉签或其他类似工具对头皮表面进行消毒，随后用酒精再次消毒，交替重复此过程 3 次。</li>
	<li>涂抹局部麻醉凝胶，并等待 5–10 分钟。</li>
	<li>准备涂抹牙科丙烯酸水泥。
	<ol>
		<li>使用无菌手术刀片切开头皮，可选择完全移除头皮或从头后部至前额做一直线切口。</li>
		<li>使用夹子牵拉多余皮肤，暴露颅骨。</li>
		<li>使用棉签清除骨膜的结缔组织。</li>
		<li>在去除骨膜后立即涂抹丙烯酸水泥。操作需迅速，以防止暴露的骨面因水分蒸发而变得不透明。</li>
		<li>等待约 5 分钟，使水泥干燥。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 经颅 Ca2+ 成像结合十二指肠内葡萄糖给药
<ol>
	<li>将实验溶液和生理盐水均平衡至室温。对小鼠进行特定时长的饮食限制（例如，2 小时）。</li>
	<li>在开始注射前，使用约 0.03 mL 生理盐水冲洗小鼠端导管中的任何残留内容物。</li>
	<li>将实验溶液（例如，用 300 µL 水配制的 10% 葡萄糖溶液，并额外加入 300 µL 水）吸入注射器中，然后将其连接至导管。根据特定实验目的确定溶液的最佳剂量。 
	注意：在此阶段，需谨慎操作，避免对导管施加过度张力，以免损伤小鼠内部解剖结构。应尽量轻柔地操作连接小鼠端的管路。此外，在吸入溶液后，确保注射器内无空气残留，因为滞留的空气或气泡可能导致胃肠道膨胀。</li>
	<li>评估小鼠的生理状态，并通过点击软件应用程序中的 recording process 按钮启动成像软件的记录功能。</li>
	<li>以 512 x 512 像素、16 位 深度和 10 Hz 的 帧率 采集图像。 
	注意：记录参数可根据具体实验需求进行调整。</li>
	<li>采集自发性数据（例如，持续 50 秒），随后以适合实验的速率（此处为 0.035 mL/s）缓慢输注实验溶液。 
	注意：实验结束后，将在异氟烷麻醉下立即通过颈椎脱位法处死小鼠。</li>
</ol>
8. 图像数据处理与分析
<ol>
	<li>将图像数据合并为 64 × 64 像素。</li>
	<li>使用 ImageJ 手动绘制感兴趣区域（ROIs）。参考小鼠脑图谱，将感兴趣区域定义为额叶区（M2）、包含桶状区的体感区（Somato）、枕叶区（Visual）以及后扣带皮层区（RSC）。</li>
	<li>使用 MATLAB 函数 ReadImageJROI 提取对应于感兴趣区域的坐标。通过以下链接获取该 MATLAB 函数：https://jp.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/32479-readimagejroi</li>
	<li>使用 MATLAB 计算感兴趣区域内荧光强度变化的平均速率。
	<ol>
		<li>根据公式（1）定义荧光强度变化率（ΔF/F）： 
		<img alt="静态平衡公式 ΔF/F=(Ft–F0)/F0，用于数据分析与实验中的关键公式。" src="/files/ftp_upload/65902/65902eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1">     (1) 
		其中 Ft 表示特定时间点的荧光强度值，F0 表示从记录开始至注射后 50 秒期间的平均荧光强度值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>考虑注射溶液到达器官的时间延迟。以注射后三秒内的平均强度值作为基线。在注射后 3 秒或更晚出现的、超过基线强度值 +1 SD 的波形作为分析目标。</li>
</ol>

Studying Gut-Brain Interaction via Transcranial Calcium Imaging in Mice

<ol><li>Buchanan, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preference+for+sugar+over+sweetener+depends+on+a+gut+sensor+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The preference for sugar over sweetener depends on a gut sensor cell.</a> Nature Neuroscience. 25 (2), 191-200 (2022).</li>
<li>Reimann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+underlying+nutrient+detection+by+incretin-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Dairy+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms underlying nutrient detection by incretin-secreting cells.</a> International Dairy Journal. 20 (4), 236-242 (2010).</li>
<li>Kreuch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+mechanisms+linking+intestinal+sweet+sensing+to+glycemic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Gut mechanisms linking intestinal sweet sensing to glycemic control.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 741(2018).</li>
<li>Gorboulev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%28%2B%29-D-glucose+cotransporter+SGLT1+is+pivotal+for+intestinal+glucose+absorption+and+glucose-dependent+incretin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Na(+)-D-glucose cotransporter SGLT1 is pivotal for intestinal glucose absorption and glucose-dependent incretin secretion.</a> Diabetes. 61 (1), 187-196 (2012).</li>
<li>Harada, N., Inagaki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+sodium-glucose+transporters+in+glucose+uptake+of+the+intestine+and+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Investigation%22%5BJournal%5D)">Role of sodium-glucose transporters in glucose uptake of the intestine and kidney.</a> Journal of Diabetes Investigation. 3 (4), 352-353 (2012).</li>
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<li>Stanley, S., Wynne, K., McGowan, B., Bloom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+regulation+of+food+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hormonal regulation of food intake.</a> Physiological Reviews. 85 (4), 1131-1158 (2005).</li>
<li>Larsen, P. J., Tang-Christensen, M., Jessop, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+administration+of+glucagon-like+peptide-1+activates+hypothalamic+neuroendocrine+neurons+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Central administration of glucagon-like peptide-1 activates hypothalamic neuroendocrine neurons in the rat.</a> Endocrinology. 138 (10), 4445-4455 (1997).</li>
<li>Alhadeff, A. L., Rupprecht, L. E., Hayes, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLP-1+neurons+in+the+nucleus+of+the+solitary+tract+project+directly+to+the+ventral+tegmental+area+and+nucleus+accumbens+to+control+for+food+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">GLP-1 neurons in the nucleus of the solitary tract project directly to the ventral tegmental area and nucleus accumbens to control for food intake.</a> Endocrinology. 153 (2), 647-658 (2012).</li>
<li>Raybould, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+chemosensing%3A+interactions+between+gut+endocrine+cells+and+visceral+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Autonomic+Neuroscience%3A+Basic+%26+Clinical%22%5BJournal%5D)">Gut chemosensing: interactions between gut endocrine cells and visceral afferents.</a> Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 153 (1-2), 41-46 (2010).</li>
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<li>Zhang, L., Han, W., Lin, C., Li, F., de Araujo, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar+metabolism+regulates+flavor+preferences+and+portal+glucose+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Integrative+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sugar metabolism regulates flavor preferences and portal glucose sensing.</a> Frontiers in Integrative Neuroscience. 12, 57(2018).</li>
<li>Goldstein,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+detection+of+macronutrients+via+multiple+gut-brain+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic detection of macronutrients via multiple gut-brain pathways.</a> Cell Metabolism. 33 (3), 676-687.e5 (2021).</li>
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<li>Yamada, S., Wang, Y., Monai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+cortex-wide+Ca2%2B+imaging+for+the+functional+mapping+of+cortical+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transcranial cortex-wide Ca2+ imaging for the functional mapping of cortical dynamics.</a> Frontiers in Neuroscience. 17, 1119793(2023).</li>
<li>Monai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+reveals+glial+involvement+in+transcranial+direct+current+stimulation-induced+plasticity+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain.</a> Nature Communications. 7 (1), 11100(2016).</li>
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<li>Schwalm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+states+shape+the+spatiotemporal+representation+of+local+and+cortex-wide+neural+activity+in+mouse+sensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Functional states shape the spatiotemporal representation of local and cortex-wide neural activity in mouse sensory cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 128 (4), 763-777 (2022).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文介绍了如何将导管连接至肠道并观察经颅皮层广泛的钙信号2+ 表达基因编码钙指示剂的转基因小鼠中的信号2+ 指示剂。在本实验中，我们未获得使用光源第二波长的成像数据。这是因为本研究中所使用的转基因小鼠在感觉刺激下会表现出非常高的荧光强度变化率（约百分之几十），这是由于Ca2+ 所采用的指示蛋白（G-CaMP7）表明，血流动力学的干扰可忽略不计。此外，我们关注的神经反应在数秒内迅速发生，因此无需考虑后续产生的局部功能性充血。该导管植入方法可与其他转基因小鼠结合使用，以观察不同脑区和不同时间尺度下的神经元活动。然而，若使用其他转基因小鼠，则应进行上述对照实验。
这种将导管连接到肠道的方法适用于低成本的单剂量注射，且比之前提出的方法更简便、侵入性更小29。传统上，使用吸水棉包裹消化器官并进行缝合。然而，缝合可能会影响小鼠术后的恢复。因此，我们采用了这种固定方法。我们选择塑料珠的原因在于，它们使用我们所用的氰基丙烯酸酯胶水时，能更好地与硅胶粘合。
传统观点认为，大脑对葡萄糖的感知依赖于血浆血糖水平的升高以及随之发生的激素释放。因此，大脑需要数分钟至数小时才能在葡萄糖从肠道吸收后检测到其存在4。一些研究表明，除了口腔对甜味的感知外，肠道感知还调控小鼠的味觉偏好1,3,17,22。例如，研究人员已提供证据表明，与经胃（IG）给予葡萄糖配对的带味道非营养性溶液，以及与经胃给予不可代谢的α-甲基-D-吡喃葡萄糖苷（MDG）配对的带味道非营养性溶液，均能引起小鼠对相应带味道非营养性溶液的偏好，相较于与经胃给予水配对的对照组。由于腹腔注射葡萄糖并未促进非营养性溶液的摄入30，因此推测肠道营养感知在小鼠的食物选择中起着关键作用1,19,22。
最近的一项研究发现肠道中存在一种电兴奋性细胞，被称为“&#34;Neuropod细胞&#34;”，该细胞利用分子受体检测感觉刺激，并通过谷氨酸能突触将其转导至迷走神经。尽管以往的研究主要关注GLP-1在调控小鼠摄食行为中的作用，但近期研究表明，Neuropod细胞对迷走神经的激活可调节小鼠的食欲。迷走神经随后激活孤束核，进而引起多巴胺能神经元的激活19。然而，目前尚不清楚多巴胺能神经元的激活是否也会激活大脑皮层。为了分类胃内葡萄糖灌注后的大脑反应，我们优化了导管固定技术以适用于成像实验。在使用该技术时，必须格外谨慎以避免器官损伤，尤其应注意肝脏，因其在确定胃部位置所需的操作过程中易受损伤。
我们的研究结果表明，胃内注射葡萄糖可在数秒内激活前额叶皮层。然而，胃内葡萄糖给药会同时启动多种信号通路，例如激素途径、迷走神经以及脊髓传入神经。这些信号在脑干中以不同的时间尺度被处理。因此，未来的研究应探讨这些复杂的信号在大脑中是如何被处理与整合的。
此外，本研究中所采用的BAC GLT-1-G-CaMP7转基因小鼠品系在神经元和星形胶质细胞中均表达Ca2+传感器G-CaMP7。原则上，通过经颅皮层大范围Ca2+成像所获得的前额叶Ca2+升高信号来源于神经元和/或星形胶质细胞。然而，由于星形胶质细胞表达多巴胺受体，若涉及多巴胺信号传导，则提示星形胶质细胞IP3/Ca2+信号通路可能存在激活。鉴于星形胶质细胞IP3/Ca2+信号通路可调控突触可塑性，其也可能在葡萄糖感知后蔗糖偏好改变及摄食行为变化中发挥重要作用。因此，在未来的研究中，需利用双光子显微镜进行细胞分辨率水平的成像，以明确葡萄糖给药后前额叶皮层所观察到的反应究竟源自神经元还是星形胶质细胞。另一种有效方法是通过腺相关病毒（AAV）在小鼠中实现细胞特异性Ca2+指示剂表达，并结合光纤光度法进行观测。此外，还需利用电生理技术验证肠道葡萄糖刺激是否确实激活了迷走神经。若神经足细胞通过感知葡萄糖向迷走神经传递信号，则在给予SGLT-1抑制剂后，我们预期迷走神经将不再产生反应。最后，还需使用多种多巴胺受体拮抗剂进行验证，以确认迷走神经向孤束核（NTS）的投射是否激活了多巴胺能神经元，从而增强前额叶皮层的Ca2+信号。总体而言，该系统能够全面探究从肠道到大脑的快速神经传导效应，是一种极具前景的研究方法，有望揭示诸如应激如何通过肠-脑相互作用改变蔗糖偏好的潜在机制。

肠道对葡萄糖的感知主要通过位于肠腔内肠内分泌细胞中的甜味受体（Tas1r2、Tas1r3）和钠-葡萄糖共转运蛋白1（SGLT-1）实现1,2,3,4,5,6。大脑对葡萄糖的感知则是一个通常在葡萄糖从肠道吸收后数分钟至数小时内发生的过程，这一过程主要基于血浆血糖水平的升高以及激素的释放7,8,9,10,11（例如胰高血糖素样肽-1 [GLP-1]、肽YY（PYY）和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽 [GIP]）。这些激素通过血流和迷走神经（副交感神经）到达下丘脑弓状核（ARC），并与其中的前阿黑皮素原（POMC）神经元和刺鼠相关蛋白（AgRP）神经元结合12,13,14。这些神经元活动的变化进而调控代谢和摄食行为15,16。
近期文献日益强调葡萄糖吸收后肠-脑神经信号传导的重要性。这一复杂通路大致可分为两种主要机制。第一种机制涉及脊髓传入神经的激活，最终影响下丘脑弓状核（ARC）中AgRP神经元的活动。第二种机制则通过与上皮细胞的连接，刺激迷走神经。鉴于肠道上皮细胞可通过多种途径激活迷走神经13，其作用被认为具有多样性。
大量肠道迷走神经和脊髓传入神经的活动与摄食行为相关17,18,19。然而，新兴证据表明，某些投射至&#34;神经足细胞&#34;的迷走神经纤维参与了葡萄糖偏好。神经足细胞是一类肠内分泌细胞，其腔面表达SGLT-1，并通过谷氨酸能突触将感觉刺激传递给迷走神经2,20,21,22。迷走神经的激活可在数秒内触发腹侧被盖区（VTA）中的多巴胺能神经元19。值得注意的是，在小鼠中使用谷氨酸拮抗剂抑制迷走神经激活，特别是十二指肠区域的激活，可降低其对蔗糖的偏好1。这凸显了葡萄糖摄入后神经足细胞激活在调节食物选择行为中的关键作用2。
尽管取得了这些进展，人们对肠道快速感知葡萄糖的机制及其对皮层活动的影响仍缺乏透彻理解，这一问题依然十分复杂。虽然由AgRP神经元控制的大脑激活不包括大脑皮层23，但已知腹侧被盖区（VTA）的多巴胺能神经元会投射至大脑皮层。然而，葡萄糖感知后VTA多巴胺能神经元的快速激活是否真正引起大脑皮层的激活，目前尚不清楚。为了阐明这一机制，我们研究了经胃内给予葡萄糖是否能够快速影响表达基因编码钙指示剂的转基因小鼠大脑皮层的Ca2+动态变化。
本文介绍了一种低成本且侵入性较小的方法，通过在小鼠中进行全皮层Ca2+成像，全面了解经胃内给予葡萄糖后皮层活动的变化。近年来，利用表达基因编码钙指示剂的转基因小鼠，透过完整颅骨进行经颅全皮层Ca2+成像的技术已日益普及24。值得注意的是，本研究中使用的BAC GLT-1-G-CaMP7 #817转基因小鼠品系（也称为G7NG817小鼠）可在神经元和星形胶质细胞中表达Ca2+传感器G-CaMP725。由于该转基因小鼠品系在大脑皮层中具有高表达密度，因此特别适用于使用标准落射荧光显微镜进行经颅全皮层Ca2+成像。

<table><tbody><tr><td>2.5 mL TERUMO 注射器</td><td>TERUMO</td><td>ss-02Sz</td><td></td></tr><tr><td>23 G 注射针头</td><td>TERUMO</td><td>4987350390691</td><td></td></tr><tr><td>麻醉剂（异氟烷吸入溶液）</td><td>viatris</td><td>871119</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td></td><td></td><td>本地公司</td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯胶（AronArufa A）</td><td>TOAGOSEI</td><td>7990700Q1022</td><td></td></tr><tr><td>牙科丙烯酸树脂水泥 C&amp;amp;B&amp;nbsp;</td><td>Sun Medical&amp;nbsp;</td><td>221AABZX00115000</td><td></td></tr><tr><td>脱毛膏</td><td>Kracie</td><td></td><td>本地公司</td></tr><tr><td>数字CMOS相机&amp;nbsp;</td><td>Hamamatsu Photonics&amp;nbsp;</td><td>ORCA-Spark</td><td></td></tr><tr><td>耳杆</td><td>NARISHIGE</td><td>EB-5N</td><td></td></tr><tr><td>滤光片组（U-MWB2）</td><td>Evident</td><td>U-MWB2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>Fine Dcience Tools</td><td>14040-10</td><td></td></tr><tr><td>G7NG817 小鼠</td><td>RIKEN BRC</td><td>RBRC09650</td><td></td></tr><tr><td>图像软件</td><td>Hamamatsu Photonics&amp;nbsp;</td><td>HC Image软件</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷挥发器</td><td>shinanoseisakusyo</td><td>SN-487-0T</td><td></td></tr><tr><td>光源（U-HGLGPS）</td><td>Evident</td><td>U-HGLGPS</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜（MVX10）</td><td>Evident</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塑料珠（内径 3 mm，外径 5 mm）</td><td></td><td></td><td>本地公司</td></tr><tr><td>钳子</td><td></td><td></td><td>本地公司</td></tr><tr><td>聚对二氧环己酮缝线，monodiox</td><td>Alfresa Pharma</td><td>HR1305MV45-KF2R</td><td>该可吸收单股PDS缝线用于关闭手术切口</td></tr><tr><td>圆头镊子</td><td>F.S.T.&amp;nbsp;</td><td>11617-12</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>Otsuka Pharmaceutical Factory</td><td>35061311</td><td></td></tr><tr><td>硅胶管（内径 0.5 mm，外径 1.0 mm）</td><td>AS ONE&amp;nbsp;CORPORATIO</td><td>33151413</td><td>本地公司</td></tr><tr><td>小型手术针</td><td>Natsume Seisakusho Co., Ltd.</td><td>AC03DNT</td><td></td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>NARISHIGE</td><td>MA-6N</td><td></td></tr><tr><td>利多卡因凝胶 2%</td><td>Sandoz K.K.</td><td>614429303</td><td>该凝胶用作局部镇痛剂以缓解手术疼痛</td></tr></tbody></table>

肠道-脑神经通讯的实时分析：肠道葡萄糖刺激下的全皮层钙动力学

Real-time Analysis of Gut-brain Neural Communication: Cortex wide Calcium Dynamics in Response to Intestinal Glucose Stimulation

营养物质吸收后，胃肠道与大脑之间的相互作用在食物偏好、代谢及摄食行为中发挥着关键作用。特别是针对特定营养物质，许多研究已阐明，葡萄糖在肠道上皮细胞内的同化会引发多种信号分子的激活。例如胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1）等激素被公认为典型的信号介导分子。由于激素主要通过循环途径影响大脑，因此对脑活动的调节较为缓慢。
然而，最近的研究表明，自主神经系统介导了两条快速的肠-脑通路。其中一条通过脊髓传入神经通路发挥作用，另一条则由迷走神经介导。因此，胃肠道内葡萄糖吸收后引发的脑部反应十分复杂。此外，由于肠道刺激最终会诱发多种皮层活动，包括感觉、伤害性感受、奖赏以及运动反应，因此有必要采用能够可视化局部脑回路和全皮层活动的方法，以全面理解肠-脑神经传递过程。一些研究已表明，肠道刺激后可通过不同通路独立引起下丘脑和腹侧被盖区钙离子（Ca2+）浓度的急剧变化。然而，大脑皮层活动是否发生变化尚不清楚。
为了观察经胃内注射葡萄糖后大脑皮层的活动，我们开发了一种成像技术，可在完整颅骨条件下实时可视化全皮层范围的 Ca2+ 动态变化，该技术使用表达基因编码 Ca2+ 指示剂的转基因小鼠。本研究提供了一套完整的实验方案，用于通过植入式导管进行胃内注射葡萄糖后，监测肠道刺激诱导的经颅全皮层 Ca2+ 成像。初步数据显示，将葡萄糖溶液注入肠道可激活额叶皮层，而给予水则无法引起该区域的响应。

使用异氟烷麻醉的 G7NG817 小鼠进行全皮层经颅 Ca2+ 成像 
我们按照图1所示的步骤制备导管。在准确定位胃部位置后，将导管固定于该位置（图1）。导管植入后给予充分恢复时间（约 48 小时），随后在轻度异氟烷麻醉（0.8–1.0%）条件下测量自发神经活动，以建立后续肠道刺激观察的基线荧光强度变化。结果显示，整个皮层范围内均观察到随机的 Ca2+ 振荡模式（图2A）。图2展示了导管预先植入后自发脑活动的代表性示例。我们将注射后在 M2 区域首次观察到的 Ca2+ 瞬态峰值时间定义为 0.0 秒。伪彩图将该 Ca2+ 瞬态峰值显示为最大值，最小值则设定为平均值加一个标准差（1 SD）。显然，左右半球在所有区域均表现出同步性活动。
接下来，我们建立了感兴趣区域（ROI），以表征每个功能区内神经活动波的特征。如图2B所示，我们展示了每个ROI的荧光强度变化率随时间的变化情况（图2B）。这些观察到的皮层表面Ca2+振荡呈现出爆发-抑制模式，即在低活动期与高幅度荧光变化期之间交替。该活动模式与先前同时记录皮层表面脑电图（EEG）和Ca2+动态的研究结果一致26。
尽管全脑或局部脑表面的钙离子（Ca2+）活动在抑制状态与爆发状态之间存在波动，但引发钙离子激增的特定皮层区域可能有所不同。如先前报道所述，当某一信号刺激局部皮层区域时，该区域预期会被激活，进而驱动皮层整体状态的全局性转变27,28。
经胃内注射葡萄糖后皮层 Ca2+ 动态的变化 
接下来，为了阐明葡萄糖或水的给予如何影响皮层活动，我们在注射过程中及注射后监测了广泛皮层区域的 Ca2+ 动态。结果发现，胃内注射葡萄糖后，皮层 Ca2+ 动态发生了改变。与皮层不同区域所呈现的自发性活动不同，当通过导管直接向肠道注射葡萄糖时，我们观察到前额叶区域或次级运动皮层（M2）立即出现激活，而胃内注射水则未引起该效应（图 3A-C）。此外，我们观察到这些短暂而显著的 Ca2+ 事件在胃内注射葡萄糖后倾向于持续约 10 秒连续发生。而在给予水后，未见此类持续性现象（图 3D-F）。
通过计算每个感兴趣区域（ROI）在葡萄糖给药完成后4-8秒内首次峰值时的荧光强度变化比率，并以听觉皮层（参考区域）作为参照，来表征Ca2+事件。结果表明，在注射葡萄糖后，以听觉皮层为参考比较M2区域在注射前后的反应，观察到显著变化。
相比之下，注射水时未观察到类似变化（图3G，水组 N = 7：注射前 vs. 注射后，2.38 ± 2.53 vs. 2.05 ± 1.84，p > 0.05；葡萄糖组 N = 7：注射前 vs. 注射后，2.48 ± 0.97 vs. 3.76 ± 2.76，p < 0.01，Wilcoxon 符号秩检验）。接下来，通过计算每次注射后与注射前的比值来定义各皮层区域的激活水平，仅在 M2 区域观察到显著差异（图3H，M2：0.92 ± 0.89 vs. 1.30 ± 0.32，p = 0.006；体感皮层：0.95 ± 0.076 vs. 1.04 ± 0.13，p = 0.27；视觉皮层：0.92 ± 0.3 vs. 1.00 ± 0.06，p = 0.89；压后皮层：0.97 ± 0.27 vs. 1.10 ± 0.27，p = 0.60，t-检验）。
<img alt="小鼠手术准备示意图；注射针头改装、切口、氰基丙烯酸酯胶使用。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65902/65902fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：方法概览。 （A）导管制备：（a）剪切硅胶管。（b）使用医用氰基丙烯酸酯胶将塑料珠固定在硅胶管上。（c）从针尖起1.5 cm处剪断23 G针头。（d）将剪断端的针头连接至硅胶管。 （B）注射装置组装：（a）将23 G注射针头剪短1 cm。（b）将剪短后的注射针头连接至2.5 mL注射器。（c）用硅胶管包裹注射针头的剪断部分。（d）从针尖起1.5 cm处剪断23 G针头。（e）将剪断端的针头连接至硅胶管。 （C）手术操作：（a）去除手术区域的毛发。（b）切开皮肤和腹壁，切口长约1.5 cm。（c）使用剪刀在幽门窦处制造一个小穿孔（直径约1.5 mm），插入导管（硅胶管），并使用医用氰基丙烯酸酯胶将导管固定于幽门窦。 （d）使用5/0丝线缝合腹壁和皮肤。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65902/65902fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠脑活动分析；荧光成像；神经反应的时间图；脑区。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65902/65902fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：连接导管的 G7NG817 小鼠全皮层自发性 Ca2+ 振荡。（A）以 0.2 秒为间隔显示的全皮层 Ca2+ 振荡代表性示例。荧光强度变化以伪彩叠加形式表示。在 B 中虚线圈出的时间窗口显示了首次出现的 Ca2+ 瞬变信号，以其峰值作为时间 0 点。伪彩表示中，该 Ca2+ 瞬变信号的峰值设为最大值，均值加 1 个标准差（SD）设为最小值。（B）示例中各 ROI 荧光强度的时间序列变化。线条颜色对应不同皮层区域：红色代表 M2 区；品红色代表体感区（Somato）；蓝色代表视觉区（Visual）；绿色代表压后皮层区。鲑鱼色条带表示注射时间。（C）虚线轮廓内的单个峰被单独分离并以放大视图显示。缩写：SD = 标准差；ROI = �感兴区；RSC = 压后皮层区。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65902/65902fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="葡萄糖注射实验；脑部反应成像、数据分析图、区域活动比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65902/65902fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：注射葡萄糖或水期间及之后全皮层的 Ca2+ 反应。（A）葡萄糖给药的代表性示例，以 0.2 s 为间隔显示。荧光强度的变化以伪彩色叠加表示。图 B 中虚线圈出的时间窗口显示了注射后首次出现的 Ca2+ 瞬变信号，以其峰值作为时间 0。伪彩色表示基于注射后首次 Ca2+ 瞬变信号的峰值为最大值，以均值加 1 个标准差（mean +1 SD）为最小值。（B）示例中各 ROI 荧光强度的时间序列变化。线条颜色对应不同的皮层区域：红色代表 M2 区，品红色代表体感区（Somato），蓝色代表视觉区（Visual），绿色代表后扣带回区域。（C）虚线框内单个峰被单独分离并放大显示。分析目标钙波为注射后 4–8 s 内最早出现的波形。（D）作为葡萄糖对照数据的水注射代表性示例。（E）示例中各 ROI 荧光强度的时间序列变化。线条颜色同图 B 所示。（F）虚线框内单个峰被单独分离并放大显示。分析目标钙波为注射后 4–8 s 内最早出现的波形。（G）M2 区自发活动（注射前）与注射后反应的比较。计算注射前 50 s 内平均荧光强度变化，以及注射后 4–8 s 期间 M2 区的峰值反应，并以听觉皮层作为参考。（H）给予水或葡萄糖后各皮层区域激活水平的比较。根据图 G 中确定的注射后与注射前数值之比，对每个区域进行计算。N.S. 表示无显著性差异（p &gt; 0.05）；** &lt;0.01。误差棒定义为均值的标准误。缩写：SD = 标准差；ROI = 感兴趣区域；RSC = 后扣带回区域。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65902/65902fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

迷走神经介导的肠-脑通信对于胃肠道内分泌系统与大脑之间的信息传递至关重要。然而，胃内注射葡萄糖是否能够改变皮层活动仍不清楚。本文提供了一种全面的实验方案，用于观察葡萄糖注入十二指肠后皮层活动的变化。

营养吸收后胃肠道与大脑之间的通信在食物偏好、代谢以及...中起着至关重要的作用

我们的研究范围揭示了肠-脑神经通讯，尤其是其在食物偏好中的作用。以往涉及迷走神经的实验常将其视为单一的神经束，但近期研究发现，迷走神经具有特定的属性选择性和器官特异性。因此，我认为探究其统计学特征，您知道的，未来将引起广泛关注。这种将导管连接到肠道的方法成本较低、侵入性更小，且比之前提出的方法更简便。传统上，导管与肠道的连接是通过缝合完成的。在此，我们通过使用氰基丙烯酸酯胶水替代缝合，减轻了对小鼠的手术损伤。在我们的实验室中，我们正在探究生理和心理压力如何影响小鼠的肠-脑神经通讯机制。首先，使用剪刀将硅胶管剪成精确的七厘米长度。使用氰基丙烯酸盐胶水，在距离硅胶管末端约三毫米处固定微小的塑料珠。切除23号针头的尖端，并从针尖处截取1.5厘米长的一段。将截下的针头段从珠子的另一侧插入硅胶管中。使用镊子，从针尖处切除1厘米。将改造后的23号注射针头连接到2.5毫升注射器上。将一段15厘米长的硅胶管套在23号注射针头上。从针尖起1.5厘米处剪断针头，并将其连接至硅胶管。首先，将麻醉后的小鼠仰卧于手术台上，使其口腔靠近吸入麻醉装置。使用胶带将小鼠的口腔、前肢和后肢固定在手术台上。在左上腹部涂抹脱毛膏，以去除局部毛发。在腹部右侧、剑突下方五毫米处做一个1.5厘米长的皮肤切口。然后在腹壁的相同位置做一个1.5厘米长的切口。用钝头镊子轻轻将左肝叶向侧方牵拉，以暴露胃部。现在，提起胃部并轻柔地通过切口将其取出。使用剪刀在幽门窦处制造一个微小的穿孔。将带有小珠的导管末端插入该穿孔中。确认导管牢固连接至胃部后，小心地将胃复位至原始位置。缝合腹壁，使导管从体外引出。然后以类似于腹壁缝合的方式关闭皮肤切口。使用氯己定葡萄糖酸盐溶液清洁手术区域，并将小鼠置于已消毒的笼子中。首先，使用辅助耳杆将麻醉后的小鼠固定在立体定位仪平台上，以减轻脉动和呼吸造成的影响。使用电动剃须刀或脱毛膏，小心去除头皮上的毛发。使用0.1%至0.5%的葡萄糖酸氯己定溶液对头皮表面进行消毒。在头皮上涂抹局部麻醉凝胶，并等待5至10分钟。接着，使用剪刀从头部后侧向前额方向做一条直线切口。使用夹子将多余的皮肤向后拉，暴露颅骨。用棉签去除骨膜的结缔组织。立即将丙烯酸水泥涂抹到颅骨上，并等待五分钟使其干燥。将小鼠置于荧光体视显微镜下观察。成像时，使用宽带蓝色荧光滤光片组，并结合汞灯光源。随后，从导管末端移除导管针。使用约 0.03 毫升生理盐水冲洗小鼠端导管内的任何残留内容物。随后将导管从小鼠身上移除。用注射器吸取适量的 10% 葡萄糖溶液，并将其连接到导管上。在成像软件中，检查相机识别状态，并将帧率设置为 10 赫兹。将分辨率设为 512 × 512 像素，位深度设为 16 位。点击录制过程按钮，采集 50 秒的自发数据。最后，通过逐步输注葡萄糖溶液，记录小鼠的生理状态数据。自发性神经活动显示出大脑皮层内随机的钙振荡。时间上的荧光强度变化表明钙振荡呈现出爆发-抑制模式。葡萄糖注射在完成给药后4至8秒内即引起皮层钙动力学的显著变化，并立即激活次级运动皮层。然而，在给予水后未观察到此类变化。与水给药相比，葡萄糖注射后在次级运动皮层区域观察到荧光强度比值的显著改变。注射后不同皮层区域的激活水平仅在次级运动皮层区域显示出显著差异。

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科研

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