斑马鱼长期光片显微镜成像的多层封片技术

本实验的总体目标是将斑马鱼胚胎进行装片，以实现长期的活体光片显微镜观察。首先需清洁氟化乙烯丙烯共聚物（FEP）管，并用甲基纤维素进行包被。随后，对目标斑马鱼胚胎进行包被处理。

然后将胚胎先转移至融化的琼脂糖中，再转移至涂覆好的FEP管中。最后，用琼脂糖塞封闭管底，并仔细检查固定后胚胎的方向。最终，可通过活体光片显微镜获得结果，显示斑马鱼胚胎在数天内未受干扰的发育过程，具有高空间和时间分辨率。

与现有技术相比，其主要优势在于我们现在可以对斑马鱼胚胎进行持续数天的观察，而不再仅限于数小时。该方法利用光片显微镜，能够为斑马鱼的长期胚胎发育过程提供有价值的见解，也可应用于其他小型生物，例如小型海洋生物。

它也可与其他显微技术联用，例如光学投影断层成像、宽场显微镜或共聚焦显微镜。初学者可能在操作中遇到困难，因为该方案包含若干时间敏感的步骤，且判断胚胎最终位置需要一定经验。制备氟化乙烯丙烯共聚物（FEP）管时，首先用一摩尔氢氧化钠反复冲洗以清洁管子，然后将管子转移至装有0.5摩尔氢氧化钠的50毫升离心管中，超声处理10分钟。

将聚合物管转移至盛有去离子蒸馏水的小容器中并冲洗，随后用70%乙醇冲洗，再将其转移至新的离心管中。使用乙醇进行超声处理。

将试管超声处理10分钟，然后转移至盛有去离子蒸馏水的小容器中并再次冲洗。将洁净的FEB管切成三厘米长的片段，必要时将其拉直。将清洗后的管子储存于装有去离子蒸馏水的洁净50毫升离心管中。

配制Trica储备溶液。根据文本方案配制3%甲基纤维素以及1.5%和0.1%的Aros。熔化1.5%琼脂糖，倒入培养皿中，形成厚度约为两毫米的凝胶层。

在体视显微镜下，收集处于所需发育阶段且稳定表达目标荧光基因的斑马鱼胚胎，并将其转移至新的 E three 培养皿中。使用两把尖头镊子，用其中一把夹住胚胎的卵膜，另一把将其撕开并轻轻剥离，以完成多层包埋前的去膜操作。戴手套操作，将钝头套管连接至注射器上。

将套管小心插入一段已清洁的FEP管一端约三毫米深处。接着，将FEP管的自由端浸入3%甲基纤维素溶液中，使溶液充满管内。然后缓慢推动注射器，使用E3培养基排出甲基纤维素，重复浸入和排出步骤。

同时，在金属浴中将一份0.1% aros 加热至70摄氏度。在将反应管转移至设定为38摄氏度的金属浴之前，先短暂涡旋混匀。加热后，让反应管短暂冷却，然后加入 trica，使其终浓度为133至200毫克/升，并进行涡旋。

再次使用玻璃巴斯德移液管，将一个包被的胚胎转移至反应管中，同时预热 AROS，尽可能减少 E3 的转移量。使用 FEP 管及连接的注射器，先轻轻吸取少量 AROS，再吸取胚胎，并用 AROS 完全充满管道。

应将胚胎置于管子的一端，头部朝向管口。为防止内容物泄漏，保持管子水平以封住管口。使用剃刀刀片将其从套管上切下。

然后将管子垂直持握，缓慢将其末端穿过1.5%琼脂糖的整个层面，并轻微旋转。为避免干燥，将已固定的样品置于装有E3培养基的1.5毫升反应管中，成像前保持此状态。确认FEP管中的鱼体呈直线排列，且其头部正位于塞子上方，以便成像。

向成像室内的培养基中添加trica。图中显示的是受精后一天的转基因 K-G-R-L-G-F-P 斑马鱼胚胎，对其进行为期两天的成像以观察血管系统的发育过程。

斑马鱼的发育不受封片介质的限制，能够正常发育。例如，其头部抬起、尾部伸展，血管出芽也未受阻碍。

如果操作得当且所有材料均 readily available，该技术可在10分钟内完成。请记住，执行所有主要步骤时不要有任何延误。保持所有溶液清洁，因为污物可能会影响最终的图像质量。