Name: 使用电容式生物传感器进行动态多参数血小板功能评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: 了解使用电容式生物传感器在半刚性微环境中进行动态多参数血小板功能评估的方法。该技术可同时测量血小板计数、刺激强度和激活通路，为止血研究提供更全面的评估工具。

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作者感谢Moritz Stolla博士和Jason Acker博士提供的宝贵讨论和技术支持。同时感谢华盛顿大学生物成像中心提供的基础设施与支持。本工作部分由华盛顿大学CoMotion创新基金资助（项目编号：682548，D.Y.G.）。

本研究方案已获得华盛顿大学机构审查委员会（UW-IRB；研究编号：STUDY00005211）人类受试者分部（HSD）的批准。所有参与本研究的志愿者均签署了书面知情同意书。本研究中所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 膜电容传感器（MCS）的制备步骤
注意：MCS 传感器采用传统的微加工技术制备而成。该生物传感器由顶部（T-）和底部（B-）膜电容芯片（MCC）组成。简而言之，制备步骤如图1所示。
<ol>
	<li>T-MCC 微加工步骤（图1A)
	<ol>
		<li>使用标准的CAD布局软件为4英寸硅片衬底设计T-MCC的布局。</li>
		<li>使用标准掩模制备工艺将设计转移至铬玻璃光掩模上29,30.</li>
		<li>在一块洁净的双面抛光硅基底（400 µm 厚）上沉积 500 nm 厚的 Si3N4 采用标准的低压化学气相沉积（LPCVD）技术31使用手动匀胶机以2000 rpm转速旋涂AZ 9260光刻胶12 µm，持续25 s。</li>
		<li>采用标准的紫外光刻技术32，使用紫外光刻机将光刻胶与铬玻璃掩膜版对准曝光，然后在显影液中显影，以去除光刻胶中经紫外光照射的区域。</li>
		<li>使用反应离子刻蚀工艺对底层500 nm厚的氮化硅层进行图形化，以暴露硅衬底。</li>
		<li>使用标准的博世工艺（Bosch process）：深反应离子硅刻蚀工艺，去除暴露的400µm厚硅基底33.</li>
		<li>计算去除 400 µm 硅所需的蚀刻循环次数。 
		注意：这将根据所使用的工具而有所不同，因为不同工具会影响刻蚀速率（在本例中为1.8 µm/循环）。</li>
		<li>为防止意外蚀刻硅3N4 在到达该层前至少10 µm处（即在390 µm处）停止干法刻蚀。使用传统的高选择性KOH在80 °C下处理5分钟，去除剩余的硅。</li>
		<li>使用电子束蒸发工艺依次沉积20 nm的Cr层和150 nm的Au金属层34 以及使用掩膜板在T-MCC中制备传感电极。</li>
		<li>此时，晶圆中的T-MCC通过微小的硅固定架连接。通过小心穿刺这些微小固定架，将T-MCC分离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>B-MCC 微加工步骤（图1B)
	<ol>
		<li>在洁净的热氧化硅基底（400 µm 厚）上，使用与步骤 1.1.9 类似的遮蔽掩模，沉积 Cr/Au（20 nm，150 nm）金属层。</li>
		<li>使用标准光刻技术32 通过背面校准，随后进行KOH湿法刻蚀以释放B-MCCs。 
		注意：T型和B型MCC的接触垫尺寸为2.5 × 1.5 cm。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 电容式传感器的生物功能化
注意：简而言之，此步骤是用人类纤连蛋白（Fn）包被T-MCC电极，以促进血小板在传感器上的黏附。
<ol>
	<li>在进行生物分子包被之前，使用氧气等离子体在100 W功率下对传感电极进行45秒的清洗处理。</li>
	<li>将1 mM的1-十二硫醇（1-Dodecanethiol）溶于200-proof乙醇中，加入T-MCCs的样品孔内。</li>
	<li>将T-MCCs置于充满干燥氮气的容器中，密封后用Parafilm封口膜包裹，孵育24–48小时。</li>
	<li>用去离子水和200-proof乙醇冲洗金表面，随后在室温下用氮气吹干。此阶段，将传感器储存在2–8 °C的干燥氮气环境中，直至进行下一步操作。</li>
	<li>在测量前12小时，向孔中加入磷酸盐缓冲液（PBS）配制的Fn溶液（50 µg/mL），于37 °C孵育2–8小时。</li>
</ol>
3. 电容传感器设置
注意：图2 为实验装置的照片。
<ol>
	<li>使用配备微调定位器和针状探针的LCR表与传感器建立电接触。</li>
	<li>使用3D打印塑料夹具（见材料表）将T-MCC和B-MCC牢固固定。底部夹具在x-y轴上配有止动装置，以确保T-MCC与B-MCC精确对准，形成电容器。 
	注意：所有使用的3D打印机均来自华盛顿大学。</li>
	<li>施加频率为100 kHz、幅值为0.5 V的正弦信号，采样率为8 Hz。</li>
</ol>
4. 枸橼酸盐抗凝血小板富集血浆（c-PRP）的制备
注意：所有血液样本均来自参与本研究的志愿者。所有参与者此前均无已知的血小板异常或凝血功能障碍，并且在采样前两周内未服用任何影响血小板的药物，包括非甾体抗炎药（NSAIDs）。由持证采血员使用21 G针头将血液采集至标准的3.2%枸橼酸盐采血管中。首1 mL血液被弃去，以避免组织因子污染。样本置于聚苯乙烯容器中运输，所有检测均在采血后6小时内完成。
<ol>
	<li>在 20 °C 条件下，以 200 × g 离心全血样本 10 分钟，以获得富血小板血浆（c-PRP）。</li>
	<li>将 c-PRP 转移至无菌容器中，并进行血小板计数。对于抑制剂研究，将 c-PRP 与特定制浓度的药物在 Tyrode 缓冲液中孵育（详见结果部分）。</li>
</ol>
5. 血小板功能检测
注意：本实验所用血小板功能检测的示意图见图3。
<ol>
	<li>将T型和B型MCC组装到3D打印的固定装置中。</li>
	<li>进行5分钟的基础电容测量，然后向T型MCC的样品孔中加入45 µL的c-PRP。</li>
	<li>静置30分钟，使血小板在T型MCC中附着于纤维连接蛋白（Fn）包被的电极上。</li>
	<li>小心移除30 µL的c-PRP，避免触碰附着在膜上的血小板，并立即用Tyrode's缓冲液补足。以20秒间隔重复洗涤至少5次，以确保激活后无额外血小板或大聚集体附着于传感电极上。</li>
	<li>加入10 µL所需浓度的激动剂溶液（凝血酶或ADP），并允许80分钟的平衡时间。</li>
</ol>
6. 信号标志物的数据与统计分析
注意：电容从步骤 5.2 至 5.5 持续测量。
<ol>
	<li>在黏附阶段（步骤 5.3）的电容信号中，测量 30 分钟平衡时间后的最大电容变化值，该值称为 Δ​Cadh。</li>
	<li>同样，在激活阶段（步骤 5.5）中，测量最大电容变化值，该值称为 ΔCact，并测量激活后 200–300 秒期间曲线的斜率&#160;，该斜率称为 Sact。</li>
	<li>采用方差分析（ANOVA）结合 Tukey 事后检验对各组间结果进行比较。使用 Shapiro-Wilk 拟合优度检验进行正态分布分析。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无竞争利益。

本研究开创了一种基于电容的新型血小板功能评估方法，可在单一装置内同时评估血小板的黏附性及激活后的动态行为，这是首次报道此类方法。该新型实验方案引入了一种相对简便的技术，通过洗涤步骤消除纤维蛋白形成和血浆凝血因子的影响，从而获得能够区分多种影响血小板功能因素的测量结果。与传统的基于光学的检测方法相比，这种电容传感器有望通过整合黏附和聚集特性，实现对血小板功能更动态的评估。尤为重要的是，它具备以独特模式检测多种血小板功能障碍的能力，使其区别于现有的评估方法。
通过采用微加工技术、标准化测试方案以及全面的数据分析，所提出的传感器系统能够实现对血小板功能的动态多参数评估，确保高准确性、可靠性和稳定性。该系统实现了简化的校准与表征流程，任意随机选取的传感器所得校准值可普遍适用于整批大规模生产的设备。此外，芯片设计保护了底部硅芯片免受生物样本污染，使其可重复用于多次测量，从而减少系统一次性耗材的使用。血小板检测中的关键步骤是洗脱程序（步骤5.4），即移除30 µL的富血小板血浆（c-PRP）并补充血小板无Tyrode缓冲液。此步骤至关重要，可确保在血小板激活后无额外血小板附着于电极或微血栓上，...

血小板是一类特化的血细胞，在血管损伤后启动止血反应以阻止出血，并促进血管修复过程中发挥关键作用1。此外，血小板还在血栓形成中充当重要介质，而血栓形成是全球范围内导致血栓栓塞性疾病死亡的主要原因2,3,4,5,6。当发生血管损伤时，血小板会经历一系列复杂、受调控且多阶段的功能过程，包括黏附于内膜基质、胞内钙离子 influx 引发血小板构象改变、活化、颗粒分泌、聚集以及细胞骨架收缩，最终形成并稳定止血栓子，封闭受损部位以防止出血7,8。尽管抗血小板药物和治疗策略已取得显著进展9,10,11，血栓形成的风险仍然存在。抗血小板治疗的管理面临诸多挑战，包括医源性出血风险、在维持止血功能的同时实现抗血栓疗效的困难，以及患者对药物反应的个体差异，包括药物抵抗现象12,13。
尽管调控血小板反应阶段的分子机制已有充分文献记载，但目前检测血小板功能的方法仍不理想。传统的基于实验室的检测方法往往存在局限性，因其仅能评估血小板早期至中期活动的有限方面，例如黏附、聚集或凝块黏度7,14,15,16,17,18。这种部分性分析可能导致信息不足。此外，这些检测方法无法在单次实验中同时、连续且快速地评估多个关键的血小板功能要素。因此，这一局限性阻碍了临床与实验血液学领域的进展。长期以来，已开发出大量阻抗式或电容式传感器，用于各种生物医学应用19,20,21,22,23,24,25,26,27,28。
本文介绍了一种利用电容式生物传感器进行多重血小板功能评估的实验方案。该方法具有显著优势，能够灵敏地在细胞水平上监测血小板多种功能的动态变化。本方案所采用的生物传感器由两个微芯片组成：顶部为一次性硅胶芯片，设有用于容纳枸橼酸抗凝血小板富集血浆的样品孔，其感应电极表面包被有人纤维连接蛋白（Fibronectin），以促进血小板黏附；底部为可重复使用的硅芯片，内置参比电极。在整个凝血过程中——包括血小板黏附、活化及活化后阶段——对动态电容变化进行连续测量，从而实现对血小板计数、活化水平以及活化通路抑制情况的高灵敏度分析。通过使用相关的人体血浆样本，已验证该方法在临床上的可行性和实用性，凸显其在临床环境中进行可靠血小板功能评估的潜力。

<table><tbody><tr><td>1-十二硫醇</td><td>Sigma-Aldrich, MO, U.S.A</td><td>471364-100ML</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>200度乙醇</td><td>Sigma-Aldrich, MO, U.S.A</td><td>EX0276-1</td><td></td></tr><tr><td>3D打印机</td><td>深圳市创想三维科技有限公司</td><td>Ender-3 V3</td><td></td></tr><tr><td>3D打印材料</td><td>HATCHBOX 3D, CA, U.S.A</td><td>3D PLA-1KG-1.75</td><td></td></tr><tr><td>腺苷5&amp;prime;-二磷酸</td><td>Sigma Aldrich, U.S.A</td><td>01905-250MG-F</td><td>ADP</td></tr><tr><td>阿司匹林&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, MO, U.S.A</td><td>A2093-100G</td><td></td></tr><tr><td>深反应离子刻蚀</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>SPTS Rapier DRIE</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich, MO, U.S.A</td><td>D8418-50ML</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>高真空沉积系统</td><td>CHA&amp;nbsp;</td><td>SEC-600</td><td></td></tr><tr><td>人纤维连接蛋白</td><td>Sigma-Aldrich, MO, U.S.A</td><td>CLS356008-1EA</td><td>Fn</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich, MO, U.S.A</td><td>P1767-250G</td><td></td></tr><tr><td>LCR表&amp;nbsp;</td><td>Keithley Instruments, Inc., OH, U.S.A</td><td>Keithley EL 4980AL</td><td></td></tr><tr><td>LCR表探针夹具</td><td>Signatone Corporation, CA, U.S.A</td><td>SCA-50-4</td><td></td></tr><tr><td>掩模对准系统</td><td>ABM, U.S.A, Inc.</td><td>ABM/6/350/NUV/DCCD/SA</td><td></td></tr><tr><td>微位移调节器</td><td>Signatone, CA, U.S.A</td><td>S-725</td><td></td></tr><tr><td>针式探针</td><td>Signatone Corporation, CA, U.S.A</td><td>SCAT5T-4</td><td>12.5 &amp;mu;m 半径</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich, MO, U.S.A</td><td>P4474-1L</td><td>PBS, pH 7.4</td></tr><tr><td>反应离子刻蚀</td><td>Plasma-Therm,U.S.A</td><td>RIE Vision 320</td><td></td></tr><tr><td>硅基片</td><td>Wafer World Inc</td><td>SKU# 1766</td><td></td></tr><tr><td>标准3.2%枸橼酸钠试管</td><td>Tiger Medical, NJ, U.S.A.</td><td>Covidien / Cardinal Health 8881340478 Monoject</td><td></td></tr><tr><td>凝血酶</td><td>Enzyme Research Laboratories, U.S.A</td><td>HT 1002a</td><td></td></tr><tr><td>替格瑞洛</td><td>Sigma-Aldrich, MO, U.S.A</td><td>PHR2788-400MG</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode&amp;rsquo;s缓冲液</td><td>Boston Bioproducts, U.S.A</td><td>BSS-375</td><td></td></tr><tr><td>紫外光刻胶</td><td>AZ电子材料公司, NC, U.S.A.</td><td>AZ 9260</td><td>15μm</td></tr></tbody></table>

利用电容式生物传感器进行动态多参数血小板功能评估

Dynamic Multiparameter Platelet Function Assessment Using a Capacitive Biosensor

血小板通过一系列受调控的反应在血液凝固中发挥基础性作用，包括黏附、铺展、颗粒分泌、聚集以及细胞骨架收缩。然而，目前的检测方法仅能在非生理条件下对血小板功能进行部分分析。因此，亟需一种能够更真实反映生理环境下血小板功能动态性和多面性的改进检测方法。在此背景下，本文介绍了一种新方法，相较于传统检测手段，该方法可在更接近生理条件的体外半刚性微环境中测量多个与血小板功能相关的关键参数。该方法采用一种先进的电学生物传感器——膜电容传感器（MCS），通过三种不同的读数方式，为凝血过程提供独特的洞察。这些读数对血小板计数、刺激强度以及特定激活通路的变化具有高度敏感性。作为一种纯电学传感平台，MCS在检测初级止血功能障碍、评估治疗干预效果以及深入理解血小板在止血和血栓形成中的作用方面展现出重要的诊断潜力。

本研究旨在对血小板功能进行动态评估。按照上述方案制备c-PRP溶液后，将血小板接种至T-MCC中纤维连接蛋白（Fn）包被的电极上。通过洗涤步骤去除未贴壁的游离血小板，随后加入激动剂以激活已贴壁的血小板。详细结果与讨论可参见我们此前的报告28。
图 4A 代表预定血小板计数（250 x 10）的富血小板血浆（c-PRP）溶液的实验结果3 血小板 µL-1）。在测量的黏附阶段（图 4B)，电容随时间线性下降。在用凝血酶激活附着的血小板后（终浓度：3.5 U/mL-1），电容读数呈指数下降并趋于稳定状态（图4C）。按照上述数据处理方案所述步骤，三种不同的信号标记名称 ΔCadh，ΔC活动, 和 ΔS活动...

本文介绍了一种利用电容式生物传感器进行新型动态多参数血小板功能检测的实验方案。该方法在半刚性微环境中设计，以增强生理相关性，可提供三个对血小板计数、刺激强度和活化通路敏感的输出参数。

血小板通过一系列受调控的反应在血液凝固中发挥关键作用，包括黏附、铺展、颗粒分泌……

我们正在设计一种检测方法，用于在生理条件下评估血小板功能，通过在具有膜容量传感器的半刚性微环境中激活血小板，以克服现有检测方法的局限性。该检测方法可测量血小板计数、刺激强度以及激活通路。此工具为研究止血过程中的血小板机制提供了全面的方法。我们的方案可在生理条件下通过单次检测评估血小板的多个参数。我们将致力于优化该方案，并开发其他止血评估传感器。首先，使用标准的CAD布局软件设计团队膜电容芯片（MCC）的布局，用于四英寸硅片基底的微加工工艺，具体步骤如论文中所述。进行生物功能化时，使用氧气等离子体在100瓦功率下处理TMCC的传感电极45秒以进行清洁。将一份十二醛的200 proof乙醇溶液加入TMCC的样品孔中。将TMCC置于充满干燥氮气的容器中。将容器密封，并用封口膜包裹，静置 24 至 48 小时。两天后，用去离子水和 200 proof 乙醇冲洗 TMCC 的金表面。在室温下用氮气吹干 TMCC。将 PBS 中的人纤维连接蛋白溶液加入 TMCC 的样品孔中，在 37 摄氏度孵育 2 至 8 小时。对于电容传感器的设置，使用配备微调定位装置和针状探针的 LCR 表与传感器建立电接触。采用 3D 打印的塑料夹具，以牢固放置 TMCC 和 BMCC。确保底部夹具在 XY 轴上装有止动器，以将 TMCC 精确定位在 BMCC 上方，形成电容器。施加 0.5 伏特、100 千赫兹的正弦信号，采样率为 8 赫兹。为获得浓缩血小板血浆（CPRP），对人血液样本进行离心处理。将CPRP转移至无菌容器中，并进行血小板计数。对于抑制剂研究，将CPRP与特定制浓度的阿司匹林在Tyrode缓冲液中孵育。对于血小板功能检测，将TMCC和BMCC组装至3D打印的固定装置中。测量组装好的MCCs的基线电容5分钟，然后向TMCC的样品孔中加入45微升CPRP，并等待30分钟，使血小板在TMCC中黏附于纤维连接蛋白包被的电极上。接着，在不扰动已黏附血小板的情况下，从样品孔中移除30微升CPRP，并用Tyrode's缓冲液重新填充孔内液体。最后一次洗涤后，加入10微升所需浓度的激动剂溶液，并使样品平衡80分钟。测量细胞贴附30分钟后电容的最大变化值，以确定贴附阶段的电容变化量（delta C adhesion）。在激活阶段，测量电容的最大变化值，称为激活阶段电容变化量（delta C activation）。计算激活后200至300秒间电容曲线的斜率，以确定激活阶段斜率（S activation）。使用方差分析（ANOVA）结合Tukey事后检验进行组间结果比较的统计分析。采用Shapiro-Wilk拟合优度检验评估数据是否符合正态分布。含有预定血小板计数的CPRP溶液在黏附过程中表现出电容的线性下降。凝血酶激活后观察到呈指数稳态下降。在不同血小板计数范围内，Delta C 黏附值与血小板计数表现出强相关性，在 1.3 毫摩尔阿司匹林浓度下显著降低。血小板刺激后电容的指数下降速率随细胞浓度增加而升高。电容损失的幅度也随浓度升高而增大，delta C 激活呈现明显的上升趋势。S 激活和血小板计数也观察到类似趋势。随着阿司匹林剂量的增加，电容、delta C 激活和 S 激活均呈现下降趋势。高剂量与中剂量之间S激活的差异具有统计学显著性，而delta C激活在两者之间未发现显著差异。使用凝血酶激活的CPRP样本的电容信号显示，随着凝血酶浓度的增加，电容降低更加明显。delta C激活和S激活均随凝血酶水平呈现出具有统计学显著性的趋势。

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本视频展示了评估剪切应力对血小板影响的方法。抗体处理可诱导机械感受器复合物的解离和构象改变，从而激活血小板并在其表面表达标志物。这些标志物可通过免疫染色和流式细胞术进行观察。...

剪切应力对经机械感应受体抗体处理的血小板的影响

采用血液重建和微流控流动腔模拟血小板输注与止血过程，以研究血液库保存血小板的功能。体外实验数据展示了血小板储存损伤对止血功能的影响。...

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本文描述了一种同时测量血小板功能和凝血功能的止血实验模型。该模型可实时检测血小板和纤维蛋白的荧光信号，并测定血小板黏附速率、凝血速率以及凝血启动时间。该模型用于评估输注用浓缩制剂中血小板在流动条件下的促凝血特性。...

一种用于血小板输注与止血研究的微流控流动腔模型可实时测量血小板沉积与纤维蛋白形成

微流控流动腔, 血小板输注, 止血, 血小板沉积, 纤维蛋白形成, 实时监测, 血栓形成, 凝血功能评估, 体外模型, 血液动力学

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通过检测人纯化血小板磷脂酰丝氨酸暴露及微囊泡释放表征促凝血血小板

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通过多色流式细胞术分析血小板亚群

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表现出坏死、凋亡和血小板活化特征的促凝血性血小板的综合分析

本研究描述了一种微流控检测方法，该方法利用剪切应力诱导血液中血栓形成，并通过多维度读数对血栓进行表征。该检测可测量血液样本的促血栓倾向，因此在血栓相关疾病的诊断、药物研发以及基础机制研究中具有重要应用价值。...

血栓特征分析检测：一种基于微流控技术的生物力学血栓形成全面表征平台

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