血栓特征分析检测：一种基于微流控技术的生物力学血栓形成全面表征平台

我们开发了一种新方法，能够充分捕捉血栓形成的生物力学特性，并检测人类的血栓前异常状态。首先，根据设计通过标准光刻技术使用硅片制备SU8光刻胶主模具，并用胶带将主模具固定在直径15厘米的培养皿底部。通过将硅弹性体试剂盒中的预聚物基质与固化剂按10:1的质量比混合，制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）混合物。

将PDMS混合物倒入主模具中。然后将含有PDMS混合物的培养皿置于真空干燥器中脱气。将该培养皿放入设定为75°C的培养箱中加热固化两小时，完成PDMS混合物的热固化。

从培养箱中取出样品后，小心地将固化的PDMS从主模具上切割下来，并将固化的PDMS分割成独立的芯片单元。使用探针针头在指定位置打孔，以形成进样口和出样口。在化学通风橱中，使用浸有75%乙醇的擦拭布清洁载玻片，然后将其干燥。

接下来，使用高频发生器对载玻片处理30秒，对PDMS芯片处理20秒。将每个芯片与载玻片对齐，并轻轻按压芯片使其与载玻片表面结合。随后，将装置置于设定为150摄氏度的烘箱中加热15分钟，以完成热键合。

键合后，将装置在无尘条件下于室温保存。然后使用镊子取下探针针头的塑料部分，并将金属管弯曲成90度，以制成微流控装置的连接器。完成纤维蛋白原及所需抗体与Alexa Fluor的偶联反应设置后，将纯化柱在1,100 G条件下离心2分钟，以去除保存缓冲液。

弃去穿流液后，将反应液上样至安装在适配套收集管中的纯化柱，于1,100 G离心5分钟以收集所需混合物。使用分光光度计测定蛋白质和染料信号的吸光度。计算蛋白质浓度及荧光染料与蛋白质的摩尔比。

将染料在避光条件下于 4 摄氏度保存。向 Tyrode 缓冲液中加入肝素，使其终浓度为每 10 毫升待采集血液中含 0.32 单位肝素，并通过抽吸 500 微升 pH 7.4 的 Tyrode 缓冲液来预处理注射器。通过含肝素的注射器经静脉穿刺采集血液后，将其转移至 15 毫升离心管中，并于 37 摄氏度下保存。

将血管性血友病因子单体用 PBS 稀释至 2 微克/毫升。用稀释后的血管性血友病因子单体预包被微流控装置，并在室温下孵育 1 小时。随后将血液样本与荧光传感器组 1 或组 2 在室温下孵育 10 分钟。

接下来，连接带有进样口和出样口接头及管路的微流控装置。将进样口接头的另一端连接至含有磷酸盐缓冲液（PBS）的管路，然后将出样口接头的另一端连接至注射器。将注射器固定在注射泵上，并将微流控装置安装在倒置显微镜上。

手动调节显微镜载物台以定位狭窄部位。使用注射泵以每分钟0.5毫升的流速向微流控通道和管路中注入磷酸盐缓冲液。检查装置，确保狭窄部位周围无气泡存在。

将进样管路连接至血液样本，并使用注射泵以 0.018 毫升/分钟的流速将血液样本灌注通过微流控通道。在倒置显微镜下，通过软件设置每个荧光通道的曝光时间和增益。通过在四个通道之间交替切换，并依次激发一种 fluoro-4，进行实时多色荧光成像。

调整焦平面至血栓位置，并在狭窄部位记录15至30分钟的荧光信号。进行数据分析时，使用ImageJ 1.53版本打开数据文件。使用SZ 22拟合C通道识别血栓的轮廓。

然后使用多边形选区，大致选择血栓区域。对于每个通道，通过选择图像、点击“调整”（Adjust），然后选择“阈值”（Threshold）来消除背景信号。最后，通过选择“分析”（Analyze）并点击“测量”（Measure），测定血栓内的面积和平均信号强度。

代表性图像显示，在狭窄通道内健康血液中形成了血栓，使用传感器组1可观察到血小板、纤维蛋白原、血管性血友病因子和P-选择素，使用传感器组2可观察到血小板、磷脂酰丝氨酸、E阳性整合素αIIbβ3以及活化的整合素αIIbβ3。通过对单个荧光通道图像选择血栓区域、去除背景信号，并测量信号面积和平均亮度，实现定量分析。对随时间变化的荧光信号强度进行连续分析，可生成血栓形成过程中血小板聚集的信号-时间曲线。

对于每个时间点，分别获取了传感器组一中四个生物标志物和传感器组二中四个生物标志物的总信号强度。计算了血栓大小，并生成了七维血栓特征谱。目前尚无可用于评估人类患者血栓形成倾向的生物检测方法，而本研究工作旨在填补这一空白。

通过检测血液样本的生物力学活性，我们的检测方法可全面评估受试者的促血栓特性。该检测方法可开发为一种临床检测手段，用于检测患者的促血栓倾向，也可用于筛选下一代抗血栓药物。