Name: 血栓剖析测定：基于微流控的平台，用于全面表征生物力学血栓形成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-09T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 学习基于微流控芯片的血栓剖析测定方法，利用多色荧光成像技术全面表征生物力学血栓形成过程。该方法可实时监测血小板聚集、纤维蛋白原等七种关键参数，为评估人体促血栓倾向和筛选抗血栓药物提供可靠平台。

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本论文相关研究及陈实验室血栓分析检测方法的开发得到了美国国立心肺血液研究所资助项目R00HL153678（Y.C.）、美国国立老龄化研究所、克劳德·D·佩珀老年美国人独立中心奖#P30-AG024832（Y.C.）、德克萨斯大学医学分部团队科学试点研究奖（Y.C.）、美国心脏协会博士后奖学金20POST35080023（Y.C.）以及美国心脏协会变革性项目奖25TPA1471420（Y.C.）的支持。部分工作在加州大学圣地亚哥分校的圣地亚哥纳米技术基础设施（SDNI）完成，SDNI是国家纳米技术协调基础设施的成员，由美国国家科学基金会资助（项目编号ECCS-2025752）。

本方案遵循德克萨斯大学医学分部人类研究伦理委员会的指南，并已获得其批准。实验硬件装置包括一个微流控设备、灌注组件（连接器、管路、注射器和注射泵）以及一台倒置显微镜，该显微镜配备光学部件，可实现明场和多色荧光成像。显微镜使用一个多通道LED光源和一个多通道滤光立方体，以分离四个荧光通道并最大程度减少相互串色：激发光波长分别为391/32、479/33、554/24、638/31，发射光波长分别为435/30、519/25、594/32、695/58。所有实验操作均需佩戴个人防护装备，包括手套、护目镜和实验服。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 微流控装置制备
<ol>
	<li>设计一个主模具，包含矩形微通道（200 µm 宽 × 50 µm 高），并在其中设置一个管腔狭窄80%的部位。每个通道均设有独立的进样口和出样口，用于连接管路。图1；参见 补充文件 1 用于原始设计文件）。</li>
	<li>根据设计，使用硅片制备SU-8光刻胶母模 通过 标准光刻技术。将模具固定在直径15厘米的培养皿底部（图2A).</li>
	<li>按10:1的质量比将硅弹性体试剂盒中的预聚物基质与固化剂混合，制备PDMS混合物。将混合物倒入主模具中图2B).</li>
	<li>将含有PDMS混合物的培养皿置于真空干燥器中，以脱气并去除截留的气泡。 
	注意：将培养板置于真空环境中至少2小时，直至气泡完全去除。</li>
	<li>将PDMS混合物在75 °C下孵育2 h以进行热固化。</li>
	<li>小心地将固化的PDMS从母模上切下（图2C，D）并将其切割成独立的芯片单元。</li>
	<li>使用探针针头在指定位置打孔，以创建入口和出口图2E). 
	注意：使用压缩空气除尘器清除打孔中残留的任何碎屑。为尽量减少表面污染，在键合前使用压敏胶密封胶带清洁PDMS装置。</li>
	<li>在化学通风橱中，将75%乙醇喷洒在擦拭布上，用湿润的擦拭布擦拭并清洁载玻片，然后让载玻片自然晾干。</li>
	<li>在化学通风橱中，使用高频发生器分别对玻璃载片和PDMS芯片处理30秒和20秒，然后将每个芯片与玻璃载片对齐。轻轻按压芯片使其与玻璃载片表面结合。 
	注意：此步骤必须在通风橱中进行，因为高频发生器在使用过程中会产生臭氧，对人体健康有害。</li>
	<li>将装置在 150 °C 下孵育 15 分钟以进行热键合。冷却后，装置即可使用（图 2F).</li>
	<li>在无尘条件下于室温保存设备。</li>
	<li>使用镊子取下探针针头的塑料部分，并将金属管弯曲成90°。这些弯曲的金属管将用作微流控装置的连接件。</li>
</ol>
2. 荧光传感器的制备
注意：本实验共使用7种荧光传感器：SZ22-FITC、fibrinogen-Alexa Fluor 405、2.2.9-Alexa Fluor 555、AK4-Alexa Fluor 647、Annexin V-Pacific Blue、MBC 370.2-Alexa Fluor 555、PAC-1-Alexa Fluor 647。其中，fibrinogen、2.2.9 和 MBC 370.2 仅能以未偶联形式商业购得，需在实验室中进行荧光标记偶联。
<ol>
	<li>将纤维蛋白原与 Alexa Fluor 405 进行偶联：
	<ol>
		<li>新鲜配制 0.1 M 碳酸氢钠缓冲液，pH 8.5。</li>
		<li>用磷酸盐缓冲液（PBS；137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4，pH 7.4）将纤维蛋白原储备液稀释至 1 mg/mL。</li>
		<li>向纤维蛋白原溶液中加入 1/10 体积的碳酸氢钠缓冲液。</li>
		<li>将 1 mL 纤维蛋白原与 1 mg Alexa Fluor 405 NHS-酯混合，在旋转仪上室温孵育 1 小时。避&#160;光操作。</li>
		<li>通过在 1,100 × g 条件下离心 2 分钟去除纯化柱中的保存缓冲液，并弃去流出液。将反应液上样至柱中，将柱安装到合适的收集管上，在 1,100 × g 条件下离心 5 分钟，收集纤维蛋白原-Alexa Fluor 405。</li>
		<li>使用分光光度计测定 280 nm（A280；蛋白信号）和 405 nm（A405；染料信号）处的吸光度。计算蛋白浓度和 F/P 比值（荧光染料与蛋白的摩尔比）。 
		注：F/P 比值应在 8–10 范围内。</li>
		<li>将纤维蛋白原-Alexa Fluor 405 在 4 °C 避光保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 2.2.9 和 MBC 370.2 抗体与 Alexa Fluor 555 进行偶联：
	<ol>
		<li>新鲜配制 0.1 M 碳酸氢钠缓冲液，pH 8.5。</li>
		<li>用无胺缓冲液将抗体储备液稀释至 1 mg/mL。</li>
		<li>向抗体溶液中加入 1/10 体积的碳酸氢钠缓冲液。</li>
		<li>将 100 µL 抗体与 1 瓶（100 µg）Alexa Fluor 555 NHS-酯混合，在旋转仪上室温孵育 1 小时。避&#160;光操作。</li>
		<li>通过在 1,100 × g 条件下离心 2 分钟去除纯化柱中的保存缓冲液，并弃去流出液。将反应液上样至柱中，将柱安装到合适的收集管上，在 1,100 × g 条件下离心 5 分钟，收集 2.2.9-或 MBC 370.2-Alexa Fluor 555。</li>
		<li>使用分光光度计测定 280 nm（A280；蛋白信号）和 555 nm（A555；染料信号）处的吸光度。计算抗体浓度和 F/P 比值（荧光染料与抗体的摩尔比）。 
		注：F/P 比值应在 1–1.5 范围内。</li>
		<li>将 2.2.9-和 MBC 370.2-Alexa Fluor 555 在 4 °C 避光保存。 
		注：避免过度标记——高 F/P 比值可能损害其生物学功能。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 采集人类受试者的血液
注意：此操作必须由具备资质的医务人员（例如，持证护士、认证采血员）进行。此外，需获得参与研究的个体签署的知情同意书。
<ol>
	<li>通过吸取500 µL Tyrode缓冲液（12 mM NaHCO₃）来准备注射器3，10 mM Hepes、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、5.5 mM D-葡萄糖、0.5% 牛血清白蛋白，pH 7.4）中，每收集 10 mL 血液加入 0.32 U/mL 肝素。</li>
	<li>采集血液 通过 静脉穿刺。先用空注射器采集最初的2 mL血液并弃去。然后更换为含肝素的注射器以采集血样。缓慢抽吸注射器，以尽量减少血小板活化。</li>
	<li>将采集的血液转移至15 mL离心管中，并在37 °C条件下保存。 
	注意：血液样本应在采集后6小时内用于实验。</li>
</ol>
4. 血栓分析检测
注意：建议在处理血液的所有操作过程中尽可能在生物安全柜内进行，以避免血液溅到实验人员身上。如果无法做到，则应使用台面防溅屏蔽装置。
<ol>
	<li>将VWF单体用PBS稀释至2 µg/mL。用VWF单体预包被微流控装置，并在室温下孵育1小时。</li>
	<li>将血液样本与荧光探针Set 1或Set 2在室温下孵育10分钟：
	<ol>
		<li>Set 1：SZ22-FITC（0.5 µg/mL）、纤维蛋白原-Alexa Fluor 405（60 µg/mL）、2.2.9-Alexa Fluor 555（1 µg/mL）、AK4-Alexa Fluor 647（1 µg/mL）。</li>
		<li>Set 2：SZ22-FITC（0.5 µg/mL）、Annexin V-Pacific Blue（1 µg/mL）、MBC 370.2-Alexa Fluor 555（1 µg/mL）、PAC-1-Alexa Fluor 647（1 µg/mL）。 
		注：由于两种探针组需分别使用，每份血液样本至少需检测两次（一次使用探针Set 1，一次使用探针Set 2），以获得完整的数据集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将微流控装置连接进样口和出样口接头及管路。将进样口接头的另一端连接含有PBS的管路，出样口接头的另一端连接注射器。将注射器安装至注射泵上。将微流控装置固定于倒置显微镜载物台上，并手动调节载物台位置，在显微镜下找到狭窄部位（图3A）。</li>
	<li>使用注射泵以0.5 mL/min的流速向微流控通道和管路中灌注PBS。确保狭窄部位周围无气泡存在。</li>
	<li>将进样管路与血液样本连接，使用注射泵以0.018 mL/min的流速将血液样本灌注通过微流控通道（图3A）。</li>
	<li>设定各荧光通道的曝光时间和增益。通过在4个通道之间交替激发，每次激发一种荧光染料，进行实时多色荧光成像。同时，确定血栓的焦平面，并记录狭窄部位的信号，通常持续15–30分钟（图4）。 
	注：需调整各通道的曝光时间，使荧光信号易于分辨，同时避免信号饱和（图4）。在当前系统中，健康受试者的血液样本在形成的血栓中通常产生以下信号强度范围：SZ22-FITC，70–110；纤维蛋白原-Alexa Fluor 405，60–100；2.2.9-Alexa Fluor 555，70–110；AK4-Alexa Fluor 647，45–75；Annexin V-Pacific Blue，35–65；MBC 370.2-Alexa Fluor 555，45–85；PAC-1-Alexa Fluor 647，10–30。然而，少数健康受试者可能产生非典型读数。因此，建议至少检测5份健康受试者的血液样本，以确保为各通道选择合适的曝光时间。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>使用 ImageJ 1.53 版本（Fiji，美国国立卫生研究院）打开数据文件。 
	注意：每个文件应包含来自 4 个不同通道的总共 4 段视频。以下步骤通常适用于用户希望分析的任意时间点。</li>
	<li>使用 SZ22-FITC 通道识别血栓的轮廓，并使用“多边形选区”粗略选择血栓区域（图 5A、B）。</li>
	<li>对于每个通道，依次使用 图像 -&#62; 调整 -&#62; 阈值 消除背景（图 5C），然后使用 分析 -&#62; 测量 测量血栓区域内信号的面积和平均强度。 
	注意：SZ22-FITC 标记血小板，因此反映血栓大小。在第一组实验中，纤维蛋白原-Alexa Fluor 405 反映纤维蛋白原富集水平，2.2.9-Alexa Fluor 555 反映血管性血友病因子（VWF）富集水平，AK4-Alexa Fluor 647 反映 P-选择素表达水平。在第二组实验中，Annexin V-Pacific Blue 反映磷脂酰丝氨酸（PS）暴露情况，MBC 370.2-Alexa Fluor 555 反映整合素 αIIbβ3 激活至伸展构象（E+ αIIbβ3），PAC-1-Alexa Fluor 647 反映整合素 αIIbβ3 的完全激活状态（Act. αIIbβ3）21。</li>
</ol>

<ol><li>Lindstrom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+cardiovascular+diseases+and+risks+collaboration%2C+1990-2021%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Global burden of cardiovascular diseases and risks collaboration, 1990-2021.</a> J Am Coll Cardiol. 80 (25), 2372-2425 (2022).</li>
<li>Lim, H. Y., O'malley, C., Donnan, G., Nandurkar, H., Ho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+global+coagulation+assays+-+is+there+a+role+in+thrombosis+risk+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">A review of global coagulation assays - is there a role in thrombosis risk prediction.</a> Thromb Res. 179, 45-55 (2019).</li>
<li>Paniccia, R., Priora, R., Liotta, A. A., Abbate, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+function+tests%3A+A+comparative+review%5BTitle%5D)+AND+%22Vasc+Health+Risk+Manag%22%5BJournal%5D)">Platelet function tests: A comparative review.</a> Vasc Health Risk Manag. 11, 133-148 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., Jiang, F., Chen, Y., Ju, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+mechanobiology+inspired+microdevices%3A+From+hematological+function+tests+to+disease+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Platelet mechanobiology inspired microdevices: From hematological function tests to disease and drug screening.</a> Front Pharmacol. 12, 779753(2021).</li>
<li>Gorog, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+direct+comparison+of+platelet+reactivity+and+thrombolytic+status+between+Japanese+and+Western+volunteers%3A+Possible+relationship+to+the+%26%2334%3BJapanese+paradox%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">First direct comparison of platelet reactivity and thrombolytic status between Japanese and Western volunteers: Possible relationship to the &#34;Japanese paradox&#34.</a> Int J Cardiol. 152 (1), 43-48 (2011).</li>
<li>Gorog, D. A., Becker, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-care+platelet+function+tests%3A+Relevance+to+arterial+thrombosis+and+opportunities+for+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Thrombolysis%22%5BJournal%5D)">Point-of-care platelet function tests: Relevance to arterial thrombosis and opportunities for improvement.</a> J Thromb Thrombolysis. 51 (1), 1-11 (2021).</li>
<li>Lopez-Jaime, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clot+stiffness+measured+by+seer+sonorheometry+as+a+marker+of+poor+prognosis+in+hospitalized+COVID-19+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Appl+Thromb+Hemost%22%5BJournal%5D)">Clot stiffness measured by seer sonorheometry as a marker of poor prognosis in hospitalized COVID-19 patients.</a> Clin Appl Thromb Hemost. 28, 10760296221112085(2022).</li>
<li>Bochsen, L., Wiinberg, B., Kjelgaard-Hansen, M., Steinbruchel, D. A., Johansson, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+TEG+platelet+mapping+assay+in+blood+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+J%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the TEG platelet mapping assay in blood donors.</a> Thromb J. 5, 3(2007).</li>
<li>Lipets, E. N., Ataullakhanov, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+assays+of+hemostasis+in+the+diagnostics+of+hypercoagulation+and+evaluation+of+thrombosis+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+J%22%5BJournal%5D)">Global assays of hemostasis in the diagnostics of hypercoagulation and evaluation of thrombosis risk.</a> Thromb J. 13 (1), 4(2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Thromboelastography+loinc+code+67790-6%22">Thromboelastography loinc code 67790-6</a>. , LOINC Committee. (2022).</li>
<li>Volod, O., Viola, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantra+system%3A+System+description+and+protocols+for+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The quantra system: System description and protocols for measurements.</a> Methods Mol Biol. 2663, 743-761 (2023).</li>
<li>Nesbitt, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shear+gradient-dependent+platelet+aggregation+mechanism+drives+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation.</a> Nature Medicine. 15 (6), 665-673 (2009).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrin+alphaiibbeta3+intermediate+affinity+state+mediates+biomechanical+platelet+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">An integrin alphaiibbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation.</a> Nat Mater. 18 (7), 760-769 (2019).</li>
<li>Li, M., Hotaling, N. A., Ku, D. N., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+thrombosis+under+multiple+shear+rates+and+antiplatelet+therapy+doses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Microfluidic thrombosis under multiple shear rates and antiplatelet therapy doses.</a> PLoS One. 9 (1), e82493(2014).</li>
<li>Colace, T. V., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+von+Willebrand+factor+elongation+and+fiber+formation+on+collagen+during+acute+whole+blood+exposure+to+pathological+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct observation of von Willebrand factor elongation and fiber formation on collagen during acute whole blood exposure to pathological flow.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (1), 105-113 (2013).</li>
<li>Westein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerotic+geometries+exacerbate+pathological+thrombus+formation+poststenosis+in+a+von+Willebrand+factor-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (4), 1357-1362 (2013).</li>
<li>Brazilek, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+strain+rate+gradient+microfluidic+device+to+von+Willebrand%27s+disease+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Application of a strain rate gradient microfluidic device to von Willebrand's disease screening.</a> Lab Chip. 17 (15), 2595-2608 (2017).</li>
<li>Tovar-Lopez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidics+device+to+monitor+platelet+aggregation+dynamics+in+response+to+strain+rate+micro-gradients+in+flowing+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidics device to monitor platelet aggregation dynamics in response to strain rate micro-gradients in flowing blood.</a> Lab Chip. 10 (3), 291-302 (2010).</li>
<li>Kim, D. A., Ku, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+shear-induced+platelet+aggregated+clot+formed+in+an+in+vitro+arterial+thrombosis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">Structure of shear-induced platelet aggregated clot formed in an in vitro arterial thrombosis model.</a> Blood Adv. 6 (9), 2872-2883 (2022).</li>
<li>Receveur, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+rate+gradients+promote+a+bi-phasic+thrombus+formation+on+weak+adhesive+proteins%2C+such+as+fibrinogen%2C+in+a+vwf-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Shear rate gradients promote a bi-phasic thrombus formation on weak adhesive proteins, such as fibrinogen, in a vwf-dependent manner.</a> Haematologica. 105 (10), 2471-2483 (2020).</li>
<li>Din, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-parametric+thrombus+profiling+microfluidics+detects+intensified+biomechanical+thrombogenesis+associated+with+hypertension+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multi-parametric thrombus profiling microfluidics detects intensified biomechanical thrombogenesis associated with hypertension and aging.</a> Nat Commun. 15, 9067(2024).</li>
<li>Stein, P. D., Sabbah, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measured+turbulence+and+its+effect+on+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Measured turbulence and its effect on thrombus formation.</a> Circ Res. 35 (4), 608-614 (1974).</li>
<li>Mahalingam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numerical+analysis+of+the+effect+of+turbulence+transition+on+the+hemodynamic+parameters+in+human+coronary+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">Numerical analysis of the effect of turbulence transition on the hemodynamic parameters in human coronary arteries.</a> Cardiovasc Diagn Ther. 6 (3), 208-220 (2016).</li>
<li>Thomson, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gigapixel+imaging+with+a+novel+multi-camera+array+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Gigapixel imaging with a novel multi-camera array microscope.</a> Elife. 11, e74988(2022).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

通过将微流控狭窄检测与多色荧光成像相结合，血栓分析检测为研究生物力学介导的血栓形成及血小板机械生物学提供了一种便捷而强大的方法。同时，该检测具有广泛的应用价值。例如，可用于筛选特异性抑制生物力学诱导血小板聚集的抗血栓药物，其分子靶点和作用机制可通过效应条形码进行推断21。该方法还可用于研究特定人群的促血栓倾向，以识别和表征心血管疾病风险因素的影响，并评估个体的促血栓倾向。我们相信，血栓分析检测在临床转化方面具有广阔前景，可用于评估个体的促血栓倾向，并协助临床医生为患者制定个性化的抗血栓治疗方案。
血栓分析检测具有高度灵活性。分子传感器可根据定制需求自由更换或移除。例如，若实验者仅关注血栓大小和 E+ αIIbβ3 水平，则只需进行一次实验，使用含有 SZ22-FITC 和 MBC 370.2-Alexa Fluor 555 的血液样本即可。如果实验者希望检测此处列出的传感器组1和组2中未包含的其他生物标志物，只要所标记的荧光染料与通道的光学设置兼容，即可添加相应的分子传...

血栓形成是心血管疾病的主要原因，每年在全球范围内导致数百万人死亡1。目前，在标准临床环境中尚无可用于评估血栓形成风险的生物检测方法。在已商业化的实验室和床旁血液功能检测中，传统的凝血检测和聚集测定法已被证明在预测血栓形成或主要不良心血管事件方面不可靠2,3,4。全球血栓检测5、PFA-100/2006以及全局凝血检测7,8,9,10,11的支持其性能的数据也十分有限。
根据目前的认识，血栓形成过程主要由三种机制促成。除了通常公认的两种机制——即生化介导的血小板聚集和凝血作用——第三种机制是剪切力驱动的血小板聚集，该机制研究较少且常被低估，也被称为 &#34;生物力学血小板聚集&#34;12,13在生物力学血小板聚集过程中，高剪切应力和剪切梯度是驱动血小板交联的主要因素 通过&#160;GPIbα-血管性血友病因子（VWF），整合素αIIbβ3-VWF 和整合素 αIIbβ3-纤维蛋白原相互作用。在动脉血栓形成中，生物力学介导的血小板聚集可能是最关键的机制，因为动脉狭窄引起的高剪切血流会显著增强这一过程。因此，由生物力学介导的血小板聚集所驱动的血栓形成被称为“生物力学血栓形成”。12,14.
在以往的研究中，实验观察生物力学血小板聚集的常用方法是微流控狭窄检测，即在直通道中嵌入一个严重狭窄的区域。当血液在生理壁面剪切应力下流经该通道时，狭窄部位周围会产生病理性的高剪切应力，从而驱动血小板聚集形成血栓。然而，以往的研究仅使用单一读数（用于血小板，反映血栓大小）15,16,17,18,19，或最多两种读数（一种用于血小板，另一种用于其他生物标志物）13,20，因此无法实现对血栓的全面表征。
最近开发了一种血栓特征分析检测方法，该方法将多色荧光成像技术整合到微流控狭窄检测中，可实时追踪血栓内7种生物标志物（血小板、纤维蛋白原水平、血管性血友病因子水平、P-选择素表达水平、磷脂酰丝氨酸暴露水平、伸展型整合素 αIIbβ3 表达水平、完全活化型整合素 αIIbβ3 表达水平），为全面表征生物力学介导的血栓形成奠定了基础21。本文提供了血栓特征分析检测的详细操作流程，包括实验准备、检测实施及相关数据分析方法。该检测所需的硬件设备包括倒置多色荧光显微镜和微流控系统。该方法仅需相对少量的人全血（少于2 mL），具有较高的成本效益（每样本约12美元），并在30分钟内即可获得结果。该检测能够准确识别个体多维度的促血栓异常状态，并评估抗血栓药物对血栓大小、组成及血小板活化状态的影响，因而有望在未来广泛应用于科研与临床领域21。值得注意的是，该检测必须使用新鲜采集的肝素抗凝血液。将血液储存在4 °C条件下或超过6小时，或使用除肝素以外的其他抗凝剂，均可能导致血栓无法形成或结果不准确。

<table><tbody><tr><td>10 mL 注射器</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>5100-X00V0</td><td>血液样本采集</td></tr><tr><td>15 mL 圆底离心管</td><td>Genesee Scientific</td><td>28-101</td><td>血液样本储存</td></tr><tr><td>1 mL 气密玻璃注射器</td><td>Hamilton</td><td>81331</td><td>硬件组装</td></tr><tr><td>2.2.9</td><td>MERU VasImmune</td><td></td><td>血栓染色</td></tr><tr><td>20 号 1/2 英寸探针针头</td><td>McMaster-Carr</td><td>M919</td><td>制备 PDMS 装置</td></tr><tr><td>20 mL 注射器</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>5200-X00V0</td><td>血液样本采集</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EX0281-1</td><td>气密注射器消毒及载玻片清洁</td></tr><tr><td>AK4-Alexa Fluor 647</td><td>BioLegend</td><td>304918</td><td>血栓染色</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 405 NHS 酯</td><td>Invitrogen</td><td>A30000</td><td>纤维蛋白原标记</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 抗体标记试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>A88065</td><td>MBC 370.2 和 2.2.9 标记</td></tr><tr><td>Annexin V-Pacific Blue</td><td>Invitrogen</td><td>501121505</td><td>血栓染色</td></tr><tr><td>清洁除尘刷</td><td>Office Depot</td><td>911245</td><td>制备 PDMS 装置</td></tr><tr><td>带木盒手工美工刀套装</td><td>Excel Blades</td><td>44282</td><td>制备 PDMS 装置</td></tr><tr><td>去离子水&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>751-628</td><td>气密注射器清洗</td></tr><tr><td>干燥器</td><td>Bel Art</td><td>F420270000</td><td>PDMS 脱气</td></tr><tr><td>一次性多功能实验室刮刀</td><td>LevGo</td><td>17211</td><td>混合硅橡胶基质与固化剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>染料和生物素去除离心柱</td><td>Zeba</td><td>A44296S</td><td>纤维蛋白原标记</td></tr><tr><td>纤维蛋白原</td><td>Innovative Research</td><td>IHUFBG25MG</td><td>血栓染色</td></tr><tr><td>Fusion 200-X 注射泵</td><td>Chemyx Inc.</td><td>0720X</td><td>硬件组装</td></tr><tr><td>肝素&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td>血液样本抗凝</td></tr><tr><td>高频发生器</td><td>Electro-technic product Inc.</td><td>BD-20</td><td>制备 PDMS 装置</td></tr><tr><td>人 VWF 单体</td><td>Sino Biological Inc.</td><td>10973-H08C</td><td>微流控装置包被</td></tr><tr><td>Image J v1.53 软件</td><td>Fiji, 国立卫生研究院</td><td></td><td>数据分析</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Leica</td><td>DM IL LED；滤光立方体：Leica DFT51010；光源：LED5</td><td>硬件组装</td></tr><tr><td>Kimwipes 擦镜纸</td><td>Kimberly- Clark Professional</td><td>34120</td><td>载玻片清洁</td></tr><tr><td>鲁尔锁紧帽</td><td>International Medical Industries, Inc.</td><td>57100B</td><td>血液样本采集</td></tr><tr><td>MBC 370.2</td><td>Kerafast</td><td>EBW104</td><td>血栓染色</td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>Paul Marienfeld GmbH &amp; Co. KG</td><td>ES0107222</td><td>制备 PDMS 装置</td></tr><tr><td>迷你剃须刀片刮铲</td><td>Stanley</td><td>28-100</td><td>制备 PDMS 装置</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 紫外-可见分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>蛋白质浓度及 F/P 比值测定</td></tr><tr><td>烘箱</td><td>Lab-Line Instruments</td><td>3512</td><td>制备 PDMS 装置</td></tr><tr><td>PAC-1-Alexa Fluor 647</td><td>BioLegend</td><td>362806</td><td>血栓染色</td></tr><tr><td>塑料杯</td><td>ThermoFisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>S04589</td><td>混合硅橡胶基质与固化剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SU-8 光刻胶主&amp;nbsp;模具</td><td>加州大学圣地亚哥分校 Nano3 纳米制造洁净室设施</td><td></td><td>制备 PDMS 装置</td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅橡胶试剂盒</td><td>Krayden Dow</td><td>DC4019862</td><td>PDMS</td></tr><tr><td>SZ22-FITC&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM 1756U</td><td>血栓染色</td></tr><tr><td>管路</td><td>Cole -Palmer Instrument Co.</td><td>06422-01</td><td>硬件组装</td></tr></tbody></table>

血栓特征分析检测：一种基于微流控技术的生物力学血栓形成全面表征平台

Thrombus Profiling Assay: A Microfluidics-Based Platform for Comprehensively Characterizing Biomechanical Thrombogenesis

血栓形成是一种描述血小板和凝血因子在血管内异常积聚的病理状态。尽管许多研究集中于可溶性激动剂诱导的血小板活化作为血栓形成的潜在机制，但血液流动在促进血栓形成过程中的作用却常常被忽视。特别是在动脉中，血栓形成通常与动脉狭窄相关，后者会增加血流中的剪切应力，从而促进血栓生成过程，这一现象被称为生物力学性血栓生成。长期以来，尚无一种生物检测方法能够全面且详细地揭示生物力学性血栓生成的全过程。为解决这一问题，研究人员开发了一种血栓特征分析检测方法，该方法结合了微流控技术与多色荧光成像技术，能够通过七个检测指标对生物力学性血栓生成进行系统表征，涵盖血栓的大小、组成以及血小板活化水平。该血栓特征分析检测可用于评估人类的促血栓倾向及抗血栓药物的疗效，同时也有助于进一步理解动脉血栓形成的潜在机制。

血栓分析实验通过狭窄通道灌注血液，以实现剪切力驱动的血栓形成，并进行实时多色荧光成像，从而获取所形成血栓的多维信息。通过使用第1组和第2组传感器完成实验，可对血栓的多个方面进行表征，包括血栓大小、交联蛋白（血管性血友病因子、纤维蛋白原）的富集程度，以及血小板活化水平（通过P-选择素表达、磷脂酰丝氨酸外翻和整合素αIIbβ3活化反映）21。
从每次实验中收集的数据均可进行深入分析，以获得“信号” 与. 时间”曲线（参见， 图6）。然而，这种方法耗时较长。另一种方法是选择单个时间点，即每个通道仅选取一幅图像进行数据分析。例如，在血栓形成开始后7.5 min，健康血液中的血栓通常已趋于相对稳定，因此可将该时间点选作数据分析的代表性时间点。21如果仅使用一个时间点进行数据分析，则可采用以下步骤获得一个7维血栓特征谱，全面表征血液样本的生物力学促血栓倾向。首先，将每个通道荧光信...

本研究描述了一种微流控检测方法，该方法利用剪切应力诱导血液中血栓形成，并通过多维度读数对血栓进行表征。该检测可测量血液样本的促血栓倾向，因此在血栓相关疾病的诊断、药物研发以及基础机制研究中具有重要应用价值。

血栓形成是一种病理状态，描述血 vessel 中血小板和凝血因子异常积聚的现象。尽管许多研究集中于……

我们开发了一种新方法，能够充分捕捉血栓形成的生物力学特性，并检测人类的血栓前异常状态。首先，根据设计通过标准光刻技术使用硅片制备SU8光刻胶主模具，并用胶带将主模具固定在直径15厘米的培养皿底部。通过将硅弹性体试剂盒中的预聚物基质与固化剂按10:1的质量比混合，制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）混合物。将PDMS混合物倒入主模具中。然后将含有PDMS混合物的培养皿置于真空干燥器中脱气。将该培养皿放入设定为75°C的培养箱中加热固化两小时，完成PDMS混合物的热固化。从培养箱中取出样品后，小心地将固化的PDMS从主模具上切割下来，并将固化的PDMS分割成独立的芯片单元。使用探针针头在指定位置打孔，以形成进样口和出样口。在化学通风橱中，使用浸有75%乙醇的擦拭布清洁载玻片，然后将其干燥。接下来，使用高频发生器对载玻片处理30秒，对PDMS芯片处理20秒。将每个芯片与载玻片对齐，并轻轻按压芯片使其与载玻片表面结合。随后，将装置置于设定为150摄氏度的烘箱中加热15分钟，以完成热键合。键合后，将装置在无尘条件下于室温保存。然后使用镊子取下探针针头的塑料部分，并将金属管弯曲成90度，以制成微流控装置的连接器。完成纤维蛋白原及所需抗体与Alexa Fluor的偶联反应设置后，将纯化柱在1,100 G条件下离心2分钟，以去除保存缓冲液。弃去穿流液后，将反应液上样至安装在适配套收集管中的纯化柱，于1,100 G离心5分钟以收集所需混合物。使用分光光度计测定蛋白质和染料信号的吸光度。计算蛋白质浓度及荧光染料与蛋白质的摩尔比。将染料在避光条件下于 4 摄氏度保存。向 Tyrode 缓冲液中加入肝素，使其终浓度为每 10 毫升待采集血液中含 0.32 单位肝素，并通过抽吸 500 微升 pH 7.4 的 Tyrode 缓冲液来预处理注射器。通过含肝素的注射器经静脉穿刺采集血液后，将其转移至 15 毫升离心管中，并于 37 摄氏度下保存。将血管性血友病因子单体用 PBS 稀释至 2 微克/毫升。用稀释后的血管性血友病因子单体预包被微流控装置，并在室温下孵育 1 小时。随后将血液样本与荧光传感器组 1 或组 2 在室温下孵育 10 分钟。接下来，连接带有进样口和出样口接头及管路的微流控装置。将进样口接头的另一端连接至含有磷酸盐缓冲液（PBS）的管路，然后将出样口接头的另一端连接至注射器。将注射器固定在注射泵上，并将微流控装置安装在倒置显微镜上。手动调节显微镜载物台以定位狭窄部位。使用注射泵以每分钟0.5毫升的流速向微流控通道和管路中注入磷酸盐缓冲液。检查装置，确保狭窄部位周围无气泡存在。将进样管路连接至血液样本，并使用注射泵以 0.018 毫升/分钟的流速将血液样本灌注通过微流控通道。在倒置显微镜下，通过软件设置每个荧光通道的曝光时间和增益。通过在四个通道之间交替切换，并依次激发一种 fluoro-4，进行实时多色荧光成像。调整焦平面至血栓位置，并在狭窄部位记录15至30分钟的荧光信号。进行数据分析时，使用ImageJ 1.53版本打开数据文件。使用SZ 22拟合C通道识别血栓的轮廓。然后使用多边形选区，大致选择血栓区域。对于每个通道，通过选择图像、点击“调整”（Adjust），然后选择“阈值”（Threshold）来消除背景信号。最后，通过选择“分析”（Analyze）并点击“测量”（Measure），测定血栓内的面积和平均信号强度。代表性图像显示，在狭窄通道内健康血液中形成了血栓，使用传感器组1可观察到血小板、纤维蛋白原、血管性血友病因子和P-选择素，使用传感器组2可观察到血小板、磷脂酰丝氨酸、E阳性整合素αIIbβ3以及活化的整合素αIIbβ3。通过对单个荧光通道图像选择血栓区域、去除背景信号，并测量信号面积和平均亮度，实现定量分析。对随时间变化的荧光信号强度进行连续分析，可生成血栓形成过程中血小板聚集的信号-时间曲线。对于每个时间点，分别获取了传感器组一中四个生物标志物和传感器组二中四个生物标志物的总信号强度。计算了血栓大小，并生成了七维血栓特征谱。目前尚无可用于评估人类患者血栓形成倾向的生物检测方法，而本研究工作旨在填补这一空白。通过检测血液样本的生物力学活性，我们的检测方法可全面评估受试者的促血栓特性。该检测方法可开发为一种临床检测手段，用于检测患者的促血栓倾向，也可用于筛选下一代抗血栓药物。

thrombus-profiling-assay-microfluidics-based-platform-for

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

血栓剖析测定：基于微流控的平台，用于全面表征生物力学血栓形成

本研究描述了一种新型的微孔板检测方法，用于测定人血浆中纤维蛋白凝块形成过程中未被先前报道过的V因子凝血活性。该方法利用动力学微孔板读板仪，在人血浆纤维蛋白凝块形成过程中连续监测405...

使用微孔板凝固试验测定人血浆中V因子活性

采用血液重建和微流控流动腔模拟血小板输注与止血过程，以研究血液库保存血小板的功能。体外实验数据展示了血小板储存损伤对止血功能的影响。...

使用重建血液的微流控流动腔室体外模拟止血和血小板输注 In Vitro

本文描述了一种同时测量血小板功能和凝血功能的止血实验模型。该模型可实时检测血小板和纤维蛋白的荧光信号，并测定血小板黏附速率、凝血速率以及凝血启动时间。该模型用于评估输注用浓缩制剂中血小板在流动条件下的促凝血特性。...

一种用于血小板输注与止血研究的微流控流动腔模型可实时测量血小板沉积与纤维蛋白形成

微流控流动腔, 血小板输注, 止血, 血小板沉积, 纤维蛋白形成, 实时监测, 血栓形成, 凝血功能评估, 体外模型, 血液动力学

我们提出一种体外血管疾病模型，用于研究全血与患者来源内皮细胞的相互作用。该系统可在不同条件下研究原代内皮细胞的血栓形成特性。该方法特别适用于评估凝血不同阶段的原位血栓形成能力及抗凝治疗效果。...

用于实时研究全血-内皮相互作用与血凝块动态的体外微流控疾病模型

纤维蛋白在止血和血栓形成过程中负责凝块的形成。浊度测定和血栓弹力图（TEG）可作为协同工具，对凝块提供互补性评估。这两种技术结合使用，能够更深入地揭示凝血条件如何影响纤维蛋白凝块的形成。...

利用浊度和血栓弹力图进行互补性凝块表征

体外 溶栓实验常常难以复制 体内 条件，无论是在血栓模型被消化的过程中，还是在溶栓发生的环境中。在此，我们探讨如何将钱德勒循环系统（Chandler loop）与实时荧光流动纤维蛋白溶解检测法（RT-FluFF）相结合 用于高保真，...

在体外溶栓模型中通过剪切流追踪钱德勒环路法形成的全血凝块的纤维蛋白溶解过程

利用微流控装置可评估血小板在流动条件下的功能，并模拟止血复苏过程，该技术在创伤和输血医学中具有应用价值。...

微流控技术在血小板功能评估中的应用

本方案描述了奈梅亨止血检测法，该方法能够同时、实时地测量凝血酶和纤溶酶的生成，从而对凝血和纤溶过程进行综合评估。该检测旨在超越传统止血检测的局限，进一步提升在科研和临床环境中对止血平衡状态的表征能力。...

奈梅亨止血检测：在单个孔中同时进行凝血酶和纤溶酶生成的荧光测定

本文描述了一种制备由I型胶原和原代人成纤维细胞组成的三维基质的方法。这种类器官凝胶能够模拟组织间质的基本特征，适用于多种显微镜观察，因此是评估细胞侵袭性迁移的有用基质。...

三维环境中的细胞行为评估：可调节的I型胶原类器官培养检测平台

本文概述了一种通过细胞自组装构建细胞来源组织环的多功能方法。将平滑肌细胞接种至环形琼脂糖孔中，细胞可在7天内聚集并收缩，形成坚固的三维（3D）组织。毫米尺度的组织环适用于力学测试，并可作为组织组装的基本单元。...

定向细胞自组装构建细胞来源组织环用于生物力学分析与组织工程

学习基于微流控芯片的血栓剖析测定方法，利用多色荧光成像技术全面表征生物力学血栓形成过程。该方法可实时监测血小板聚集、纤维蛋白原等七种关键参数，为评估人体促血栓倾向和筛选抗血栓药物提供可靠平台。

血栓特征分析检测：一种基于微流控技术的生物力学血栓形成全面表征平台

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