Name: 小鼠骨髓间充质干细胞的纯化、扩增和基于流式细胞术的表型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 10 s
Description: 学习小鼠骨髓间充质干细胞的纯化、扩增与流式细胞术表型分析方法。该低成本方案可获得高纯度、具有强增殖与分化能力的BMSCs，为再生医学与临床前研究提供可靠细胞来源。

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本工作获得了国家重点研发计划项目资助&amp;中国国家重点研发计划（2020YFE0201600）和国家自然科学基金（82174408 和 82374477）。

动物实验已根据上海中医药大学的实验动物伦理指南获得批准（伦理批准编号：PZSHUTCM2211070009）。本研究使用8周龄雌性BALB/c小鼠（SPF级，体重20 ± 1 g）。本方案概述了小鼠来源的骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离纯化、传代培养、基于流式细胞术的表型鉴定，以及成骨和成脂分化。所用试剂与仪器列于材料表中。
1. 动物处理
<ol>
	<li>在独立通风笼具中饲养无特定病原体（SPF）条件下的小鼠，每笼五只。提供SPF级饲料和无菌水。维持12小时光照/12小时黑暗的循环周期。 
	注：该方法已在BALB/c和C57BL/6小鼠品系中经过测试并证实可行。本文主要以BALB/c为例进行说明。</li>
</ol>
2. 从小鼠后肢收获股骨和胫骨
<ol>
	<li>处死动物 通过 CO2&#160;窒息后颈椎脱位7 遵循伦理准则。</li>
	<li>将小鼠浸泡于75%乙醇中5分钟（图1A). 
	注意：干细胞需在30分钟内采集完毕2 安乐死后立即进行操作，整个过程（包括骨髓冲洗、过滤及接种至培养板）在2小时内完成，以确保细胞活性最佳。 
	注意：为获得最佳骨髓间充质干细胞（BMSC）产量，应使用成年小鼠（≥8周龄）；8–12周龄小鼠最为理想8.</li>
	<li>用无菌解剖剪在跟腱处的后肢做约1厘米的切口图1B).</li>
	<li>用无菌剪刀在跟腱周围的后肢做环形切口以暴露&#160;远端&#160;胫骨（图1C).</li>
	<li>从切口处向臀部方向剥离皮肤，以去除后肢两侧的皮肤图1D).</li>
	<li>沿髂骨切开，将股骨头从髋骨分离图2A). 
	注意：解剖过程中应避免损伤股骨的双侧关节，以防骨髓丢失。</li>
	<li>将收集的股骨和胫骨置于含有含2%青霉素/链霉素的无菌预冷PBS的60 mm培养皿中图2B).</li>
	<li>使用无菌手术刀尽可能切除胫骨和腓骨上的肌腱和肌肉，以便后续冲洗图2C).</li>
	<li>将处理后的骨骼放回含有2%青霉素/链霉素的PBS中，并转移至无菌操作台以进行后续分离步骤。</li>
</ol>
3. 小鼠骨髓间充质干细胞的分离纯化与培养
<ol>
	<li>将 αMEM 与 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素混合，配制用于骨髓间充质干细胞（BMSC）培养的完全 MEM Alpha 改良（αMEM）培养基。 
	注意：选择αMEM培养基，因其含有1000 mg/L葡萄糖，属于相对较低的浓度，有助于防止高糖环境可能引起的细胞增殖抑制9</li>
	<li>取一个50 mL注射器，并安装随注射器附带的针头。</li>
	<li>将20 mL αMEM培养基吸入50 mL注射器中，然后更换为1 mL注射器附带的针头。 
	注意：使用 1 mL&#160;注射器针头应根据骨的大小进行选择，以尽量减少细胞损伤。使用50 mL注射器可高效冲洗骨髓，同时降低细胞污染的风险。&#160;来自重复插入。</li>
	<li>使用剪刀剪断&#160;在无菌操作台中处理分离后的股骨或胫骨的两端。</li>
	<li>沿切缘将针头插入骨内，冲洗骨髓至含有完全αMEM培养基的100 mm培养皿中（图 2D).</li>
	<li>反复冲洗骨腔，直至骨片呈现苍白，以确保大部分骨髓已被去除（图2E).</li>
	<li>用移液枪头轻柔地上下吹打40次，以尽可能分散聚集的细胞。</li>
	<li>将细胞悬液通过40 μm细胞滤器过滤至50 mL离心管中，以去除碎片、组织残片及未分散的细胞团块。</li>
	<li>将过滤后的细胞悬液转移至100 mm细胞培养皿中，每皿加入完全αMEM培养基至终体积15 mL。 
	注意：将每只小鼠股骨和胫骨中收集的全部骨髓细胞培养于一个100 mm培养皿中，以促进细胞生长。根据前期实验结果，约1 × 107&#160;BMC 可从一只 8 周龄小鼠（来自两根股骨和两根胫骨）中分离获得。将这些细胞以 1.8 × 10⁶5&#160;细胞/厘米²2&#160;用于原代培养。</li>
	<li>用双手握住培养皿，轻轻以“8”字形旋转摇晃&#160;轻轻晃动培养皿15次，以确保细胞在皿内均匀分布。</li>
	<li>将培养皿置于37 °C、5% CO₂的培养箱中2 培养箱中培养5天（图 3A). 
	注意：在此期间避免移动培养皿，以确保细胞均匀生长。</li>
</ol>
4. BMSC 培养中 αMEM 培养基的更换
<ol>
	<li>在显微镜下观察细胞，判断其是否已达到80%融合度。若未达到，请继续进行第5天的培养基更换操作th 天</li>
	<li>用无菌巴斯德吸管吸取3 mL PBS，从培养皿上方1 cm高度的不同位置滴加。 
	注意：避免将液体沿培养皿一侧加入，以免因冲击力过大导致贴壁细胞脱落，并影响对不需要细胞的有效清除。</li>
	<li>加入3 mL PBS后，轻轻摇动培养皿以充分洗涤细胞，并用移液器吸除培养皿中的PBS。重复洗涤一次，以确保细胞被彻底清洗。</li>
	<li>用无菌巴斯德吸管吸取15 mL完全αMEM培养基，从距离培养皿上方1 cm处的不同位置滴加。</li>
	<li>将培养皿放回培养箱，继续培养并观察，直至细胞融合度达到80%后再进行传代培养（图3B).</li>
</ol>
5. BMSCs 的传代
<ol>
	<li>用 PBS 清洗 80% 汇合度的细胞两次（图3C). 
	注意：在消化前用 PBS 清洗细胞有助于去除残留的培养基和细胞分泌物，并减少间充质干细胞（MSC）对培养皿的黏附。</li>
	<li>用1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA在37 °C、5% CO₂条件下孵育消化细胞2 孵育 2–3 分钟。</li>
	<li>通过向细胞悬液中加入4 mL完全αMEM培养基来中和胰蛋白酶。</li>
	<li>用1 mL移液器吸头吸出培养皿中的细胞悬液，并轻轻冲洗皿底，以脱离所有贴壁细胞。</li>
	<li>将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在300 × g 室温下孵育5分钟。</li>
	<li>使用移液器弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于2 mL完全αMEM培养基中。 
	注意：传代培养时，接种密度约为 4 × 104&#160;细胞/厘米²2&#160;被发现最有利于持续生长和增殖。</li>
	<li>以1:1至1:2的比例将细胞分种至新的100 mm细胞培养皿中（此为第1代）st 传代，P1）（图3D).</li>
	<li>当细胞达到80%融合度时，大约每三天以1:1.5的比例进行一次传代，以获得第二代（P2）细胞。图3E）以及第三代（P3）（图 3F骨髓间充质干细胞的数量。</li>
</ol>
6. 准备P3代骨髓间充质干细胞用于表型鉴定及成骨分化
<ol>
	<li>弃去细胞培养基。</li>
	<li>用3 mL的P3代BMSCs进行洗涤&#160;mL PBS &#160;两次。</li>
	<li>用1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA在37 °C、5% CO₂条件下消化P3代BMSCs2 当细胞达到80%融合度时，在培养箱中孵育2–3分钟。</li>
	<li>通过向细胞悬液中加入4 mL完全αMEM培养基来中和胰蛋白酶。</li>
	<li>将细胞悬液转移至15 mL离心管中，300 × g 室温孵育5分钟，弃去上清液。 
	注意：此处制备的P3代BMSC细胞球将用于表型鉴定 通过 流式细胞术以及成骨或成脂分化评估。</li>
</ol>
7. 通过流式细胞仪对骨髓间充质干细胞进行表型鉴定
<ol>
	<li>用含有 2% FBS 的 1.5 mL PBS 溶液重悬 P3 代 BMSCs 细胞沉淀，并调整细胞浓度至 5 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>将 100 μL 细胞悬液分装至 11 支试管中，每管含 5 × 105 个细胞。准备以下分组：空白对照、CD29 同型对照、CD29、CD44 同型对照、CD44、Sca-1 同型对照、Sca-1、CD31 同型对照、CD31、CD45 同型对照和 CD45。 
	注意：本研究中使用的荧光染料如下：CD29-FITC、CD29 同型-FITC、CD44-APC、CD44 同型-APC、Sca-1-PECy7、Sca-1 同型-PECy7、CD45-PerCPcy5.5、CD45 同型-PerCPcy5.5、CD31-PE 和 CD31 同型-PE（见材料表）。可根据不同流式细胞仪的配置调整所用荧光染料。</li>
	<li>向各组分别加入以下试剂：向空白对照组加入 2 μL PBS，向 CD29 同型对照组加入 2 μL CD29 同型抗体（1:50 稀释），向 CD29 组加入 2 μL CD29 抗体（1:50 稀释），向 CD44 同型对照组加入 0.5 μL CD44 同型抗体（1:200 稀释），向 CD44 组加入 0.5 μL CD44 抗体（1:200 稀释），向 Sca-1 同型对照组加入 0.5 μL Sca-1 同型抗体（1:200 稀释），向 Sca-1 组加入 0.5 μL Sca-1 抗体（1:200 稀释），向 CD31 同型对照组加入 2 μL CD31 同型抗体（1:50 稀释），向 CD31 组加入 2 μL CD31 抗体（1:50 稀释），向 CD45 同型对照组加入 2 μL CD45 同型抗体（1:50 稀释），向 CD45 组加入 2 μL CD45 抗体（1:50 稀释）。 
	注意：抗体使用量依据生产商推荐的最佳流式细胞术条件。预实验已验证染色效果和靶细胞特异性。请参考生产商提供的剂量指南，并根据需要进行滴定预实验。</li>
	<li>轻轻混匀，使用掌上离心机离心后，在 4 °C 避光条件下孵育 30 分钟。</li>
	<li>向每管中加入 900 μL PBS，通过翻转混匀，于 4 °C 以 300 × g 离心 5 分钟。弃去上清液以去除未结合的抗体。</li>
	<li>用 300 μL PBS 重悬每管中的细胞沉淀，并立即进行流式细胞仪分析。 
	注意：若流式细胞仪检测可在 1–2 小时内完成，则无需使用 2.5% 中性甲醛固定细胞。若无法在 1–2 小时内完成检测，应使用 2.5% 中性缓冲甲醛&#160;（按 10% 中性缓冲甲醛&#160;与 PBS 以 1:3 比例混合配制）固定细胞，并于 4 °C 避光过夜保存，以备后续流式检测。</li>
	<li>使用空白对照组调节流式细胞仪电压，确保细胞自发荧光信号控制在坐标轴范围的约 1/4–1/3 区间内。依次上样 CD29 同型对照、CD29、CD44 同型对照、CD44、Sca-1 同型对照、Sca-1、CD31 同型对照、CD31、CD45 同型对照和 CD45 组的细胞样本。在 FSC/SSC 图中设定 P1 门，采集 10,000 个细胞，以中等流速运行。 
	注意：确保流式细胞仪配备适当的检测通道，例如本实验中常用的 FITC、PE、PerCp-Cy5.5、PE-Cy7 和 APC 通道，或其他与荧光偶联抗体相匹配的通道。</li>
</ol>
8. BMSCs 的成骨分化
<ol>
	<li>用完全αMEM培养基重悬P3代BMSC细胞团，并调整细胞浓度至1 × 105 个细胞/mL。</li>
	<li>向24孔细胞培养板中每孔加入1 mL含1 × 105 个细胞的完全αMEM培养基，接种P3代BMSC细胞。</li>
	<li>将P3代BMSC细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中培养3–5天，直至细胞融合度超过90%。每隔2天更换一次新鲜的完全αMEM培养基。</li>
	<li>将不同孔均等地分为两组：阴性对照组（不进行成骨诱导分化）和成骨诱导分化组。</li>
	<li>通过在完全αMEM培养基中添加10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/L L-抗坏血酸和10-8 mol/L 地塞米松，配制成骨诱导分化培养基。</li>
	<li>弃去细胞培养液，用1 mL PBS洗涤P3代BMSC细胞。</li>
	<li>向成骨诱导分化组各孔中加入成骨诱导分化培养基（1 mL/孔），以诱导成骨分化。</li>
	<li>向对照组各孔中加入完全αMEM培养基（1 mL/孔）。</li>
	<li>将P3代BMSC细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中培养7天或21天，每隔3天更换一次新鲜的成骨诱导分化培养基或完全αMEM培养基。 
	注：培养7天的细胞用于碱性磷酸酶（ALP）染色，培养21天的细胞用于茜素红S染色检测。</li>
</ol>
9. 通过ALP染色鉴定分化的成骨细胞
<ol>
	<li>用 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤 24 孔板中每个孔的细胞一次。</li>
	<li>加入 0.5 mL 10% 缓冲福尔马林溶液固定细胞，并于室温孵育 20 分钟。</li>
	<li>再次用 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤每个孔中的细胞一次。</li>
	<li>向每个孔中加入 0.5 mL 碱性磷酸酶染色试剂 1-Step NBT/BCIP，用铝箔包裹避光，于 37 °C 孵育 30 分钟。</li>
	<li>弃去染色液，用 1 mL 蒸馏水洗涤每个孔中的细胞一次，然后将培养板晾干。</li>
	<li>使用相机观察并采集染色克隆的图像，以鉴定呈现黑色-紫色沉淀物的碱性磷酸酶（ALP）阳性细胞。 
	注意：碱性磷酸酶（ALP）染色试剂 1-Step NBT/BCIP 与 ALP 反应后可产生强效、不溶性的黑色-紫色沉淀物，易于观察。</li>
</ol>
10. 通过茜素红S染色法鉴定分化的成骨细胞
<ol>
	<li>用 1 mL PBS 将 24 孔板中每个孔的细胞洗涤一次。</li>
	<li>通过加入0.5 mL 10%缓冲福尔马林固定细胞&#160;溶液并孵育20分钟。</li>
	<li>用 1 mL PBS 将 24 孔板中每个孔的细胞洗涤一次。</li>
	<li>每孔加入0.5 mL 0.1%茜素红S溶液（溶于0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.3），37 °C孵育30–60分钟。</li>
	<li>弃去溶液，用1 mL蒸馏水洗涤每孔一次，然后将培养板晾干。</li>
	<li>使用相机观察并采集染色菌落的图像，以鉴定茜素红S阳性细胞。 
	注意：茜素红S检测可显示间充质干细胞向成熟矿化骨细胞的分化，其原理是形成茜素红S-钙复合物，产生肉眼可见的亮红色染色。</li>
</ol>
11. 骨髓间充质干细胞成脂诱导分化培养基A的制备
注意：根据说明书，通常使用小鼠骨髓间充质干细胞成脂分化试剂盒（见材料表）进行骨髓间充质干细胞（BMSCs）的脂肪细胞分化。
<ol>
	<li>将胎牛血清（试剂盒组分，以下简称血清）置于 4 °C 冰箱中，至少 6 小时，直至完全解冻。</li>
	<li>将添加剂 A-I（试剂盒组分）在使用前至少 30 分钟置于 4 °C 冰箱中；将添加剂 A-II（试剂盒组分）置于室温下，直至完全解冻。</li>
	<li>轻轻颠倒或轻弹试剂管，以混匀管内内容物。</li>
	<li>将添加剂 A-II 试剂管在室温下以 300 × g 离心 30 秒，确保试剂沉降至管底，便于取用。</li>
	<li>用 75% 医用酒精彻底清洁所有组分的外包装，并在生物安全柜内打开。</li>
	<li>将血清、添加剂 A-I 和添加剂 A-II 加入培养基中。 
	注意：为确保充分溶解，建议将基础培养基（试剂盒组分）预热至 37 °C，否则添加剂 A-II 可能因低温而析出沉淀。</li>
	<li>用少量基础培养基冲洗每个瓶和管，确保将所有组分完全转移至基础培养基中。</li>
	<li>拧紧基础培养基瓶盖，轻轻摇晃，充分混匀。</li>
	<li>用石蜡膜密封瓶口，再用铝箔包裹，并贴上标签注明名称、配制日期及其他相关信息。</li>
</ol>
12. 骨髓间充质干细胞成脂诱导分化培养基B的制备
<ol>
	<li>将胎牛血清置于 4 °C 冰箱中至少 6 小时，直至完全解冻。</li>
	<li>将试剂盒组分 Supplement B 置于 4 °C 冰箱中，至少放置 30 分钟直至完全解冻，再进行配制。</li>
	<li>倒置或轻轻敲击试剂管，以混匀管内内容物。</li>
	<li>对 Supplement B 管进行离心，使试剂集中于管底，便于吸取。</li>
	<li>用 75% 医用酒精彻底清洁所有组分的外包装，并在生物安全柜中打开。</li>
	<li>将血清和 Supplement B 加入基础培养基中。</li>
	<li>取少量基础培养基冲洗每个瓶子和试管，确保所有组分完全转移至培养基中。</li>
	<li>拧紧基础培养基瓶盖，轻轻振荡以充分混匀。</li>
	<li>用封口膜密封瓶口，包裹铝箔，并贴上标签注明名称、配制日期及其他信息。</li>
</ol>
13. BMSCs 的脂肪细胞分化
<ol>
	<li>向六孔板中每孔加入 1 mL 0.1% 明胶，轻轻摇动使孔底均匀覆盖。</li>
	<li>将涂有 0.1% 明胶的六孔板置于无菌操作台或 CO2 培养箱中，静置至少 30 分钟。</li>
	<li>吸除明胶溶液，六孔板即可用于细胞接种；或在 30 分钟后等待孔内干燥后再进行接种。</li>
	<li>以 4 × 104&#160;个细胞/cm2&#160;的密度将 P3 代 BMSCs 接种至六孔板各孔中，每孔加入 2 mL 完全培养基。</li>
	<li>将细胞置于 37 °C、5% CO2 及饱和湿度的 CO2 培养箱中培养。</li>
	<li>当细胞达到 100% 汇合时，小心吸除培养基，每孔加入 2 mL 成脂分化诱导培养基 A。</li>
	<li>诱导 3 天后吸除培养基 A，每孔加入 2&#8239;mL 成脂分化维持培养基 B。</li>
	<li>培养基 B 培养 1 天后吸除，并切换回培养基 A 继续诱导。</li>
	<li>交替使用培养基 A 与 B，并每日观察细胞状态；若在使用培养基 A 诱导期间出现细胞收缩或死亡现象，应及时切换至培养基 B。</li>
	<li>重复诱导与维持过程，直至出现足够数量且大小合适的脂滴，随后准备进行染色。</li>
</ol>
14. 油红O（ORO）染色
注意：所有操作步骤均应尽可能轻柔，以避免脂滴脱落。
<ol>
	<li>脂肪向诱导分化完成后，从6孔板中吸除诱导分化培养基，用1×PBS轻轻洗涤2–3次。</li>
	<li>每孔加入2 mL 10%中性缓冲福尔马林&#160;，室温固定20分钟。</li>
	<li>按3:2比例将Oil Red O储备液与蒸馏水混合，配制Oil Red O工作液。混合后，在250 × g 条件下离心4分钟，取上清液使用。</li>
	<li>吸除固定液，用PBS轻轻洗涤2–3次，确保彻底去除残留固定液。&#160;</li>
	<li>每孔加入0.8 mL Oil Red O染色液，室温孵育30分钟。</li>
	<li>吸除染色液，用1 mL 75%乙醇洗涤两次。</li>
	<li>每孔加入1 mL苏木精复染液，复染2分钟，然后吸除。</li>
	<li>每孔加入2 mL PBS，于显微镜下观察脂肪向分化染色结果。</li>
	<li>用封口膜密封染色后的6孔板，并于4 °C保存。 
	注意：请&#160;勿保存超过1周，否则脂滴可能发生融合，导致染色状态丢失。</li>
</ol>

<ol><li>Chu, D. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+the+progress+of+isolation%2C+culture%2C+storage%2C+and+clinical+application+of+human+bone+marrow+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">An update on the progress of isolation, culture, storage, and clinical application of human bone marrow mesenchymal stem/stromal cells.</a> Int J Mol Sci. 21 (3), 708(2020).</li>
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</ol>

作者声明本研究不存在利益冲突。

干细胞治疗因其在再生医学领域的革命性潜力而受到广泛关注。临床前研究已提供了大量证据，支持干细胞尤其是骨髓间充质干细胞（BMSCs）的临床应用13。然而，细胞产量低、污染风险以及生长缓慢等挑战限制了其临床应用。因此，亟需开展针对BMSC制备流程标准化的研究，以提高细胞产量和功能，从而拓展其临床应用范围2。
该方法在骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离与培养中具有多项显著优势。首先，通过在无任何操作条件下持续培养5天，最大限度地减少了对新鲜分离骨髓细胞的干扰，使造血细胞能够为BMSCs提供营养支持和维持环境。此外，通过采用换液和连续传代等技术对BMSCs进行纯化，并采用低比例（1:1–1:2）的慢速传代方法，既促进BMSCs的增殖，又提高其纯度。其次，该技术操作简便且干扰最小，能够使间充质干细胞（MSCs）保留在其天然微环境中，维持关键的基质细胞、细胞外基质成分及分泌因子14。这种保留有助于MSC的自我更新与分化能力，对其功能发挥至关重要。第三...

骨髓间充质干细胞（BMSCs）因其多向分化潜能特性而广为人知，且由于具有自我更新、分化和免疫调节特性，已被广泛应用于多种疾病的治疗1,2。BMSCs易于获取，可大量扩增，具有免疫抑制特性，且不会引发即刻的免疫反应3，因此在组织工程应用及作为细胞治疗的有效载体方面具有广阔前景。
在骨髓中，两种主要的干细胞群体及其后代——造血干细胞和骨髓间充质干细胞（BMSCs）——是骨髓的主要常驻细胞4。传统上，BMSCs通过靶向骨髓穿刺获取，并在体外鉴定为贴壁生长的细胞in vitro。然而，该方法不足以将BMSCs与其他骨髓亚群（包括内皮细胞、周细胞、白细胞和造血干细胞）区分开来5。因此，亟需一种简便且有效的BMSC分离方案。
本研究详细描述了通过骨髓间充质干细胞（BMSCs）对塑料细胞培养板的物理贴壁特性进行分离与纯化的方法。采用第三代BMSCs进行流式细胞术实验，检测细胞表面标志物CD29、CD44和Sca-1的表达，实验方案遵循国际细胞治疗学会（International Society for Cell &amp;#38; 基因治疗（ISCT）间充质基质细胞（MSC）委员会6根据国际细胞治疗学会（ISCT）标准，小鼠间充质干细胞（MSCs）的特征为表达CD29、CD44和干细胞抗原1（Sca-1），不表达造血细胞标志物CD45和内皮细胞标志物CD31。此外，骨髓间充质干细胞（BMSCs）应具备多向分化潜能，能够分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。在本实验中，对分离获得的BMSCs诱导成骨分化，于第7天进行碱性磷酸酶（ALP）染色，第21天进行茜素红S染色以评估成骨分化效果。同时对分离纯化的BMSCs诱导成脂分化，并于第21天进行油红O染色以评估成脂分化情况。

<table><tbody><tr><td>1 mL注射器（22G针头）</td><td>KINDLY GROUP（KDL）</td><td>60017031</td><td></td></tr><tr><td>1-步法 NBT/BCIP&amp;nbsp;</td><td>Pierce Biotechnology, Inc.</td><td>34042</td><td>碱性磷酸酶染色</td></tr><tr><td>10%中性缓冲福尔马林</td><td>Wexis</td><td>5200250</td><td>细胞固定</td></tr><tr><td>6孔板</td><td>Labselect</td><td>11110</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Labselect</td><td>11310</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m细胞筛</td><td>科尼格</td><td>352340</td><td>过滤以去除团聚物</td></tr><tr><td>50 mL 注射器</td><td>KINDLY GROUP(KDL)</td><td>60017040</td><td></td></tr><tr><td>75% 乙醇&amp;nbsp;</td><td>上海年悦生物科技有限公司</td><td>31009001</td><td>对小鼠皮肤进行消毒</td></tr><tr><td>茜素红S</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A5533</td><td>钙沉积与钙化结节检测</td></tr><tr><td>APC 标记 CD44 单克隆抗体（克隆号：IM7）</td><td>eBioscience</td><td>17-0441-82</td><td>流式细胞术&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>APC 标记大鼠 IgG2b κ 同型对照（克隆：eB149/10H5）</td><td>eBioscience</td><td>17-4031-82</td><td>流式细胞术&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>高压灭菌</td><td>日本平山公司</td><td>HVE-50</td><td>手术器械灭菌</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>赛默飞世尔科技（中国）有限公司</td><td>300583057</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>Cytoflex 流式细胞仪</td><td>Beckman Coulter&amp;nbsp;</td><td>A00-1-1102</td><td>流式细胞术&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D4902</td><td>骨髓间充质干细胞成骨分化</td></tr><tr><td>培养皿（100 mm）</td><td>康宁</td><td>430167</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>培养皿（60 mm）</td><td>康宁</td><td>430166</td><td>移植过程中的样本放置&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>消毒棉球</td><td>上海宏龙工业有限公司</td><td>20230627</td><td>对小鼠皮肤进行消毒</td></tr><tr><td>一次性无菌手套</td><td>上海宏龙工业有限公司</td><td>YT21131</td><td>无菌操作</td></tr><tr><td>双狮辐照啮齿类动物饲料</td><td>苏州双实实验动物饲料科技有限公司</td><td>GB 14924.3</td><td>动物饲料</td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>上海拜森生物科学&amp;amp;Tech 公司</td><td>BS-0002-500</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>FITC 豚鼠抗大鼠 CD29（克隆：Ha2/5）</td><td>BD 生物科学</td><td>555003</td><td>流式细胞术&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FITC 仓鼠 IgM &amp;lambda;1 同型对照（克隆号：G235-1）</td><td>BD 生物科学</td><td>553960</td><td>流式细胞术&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>明胶（0.1%）</td><td>OriCell</td><td>GLT-11301</td><td>增强细胞的黏附能力</td></tr><tr><td>IVCs 小鼠笼具</td><td>苏州美诺克动物实验设备科技有限公司</td><td>HH-MMB-2</td><td>动物屏障</td></tr><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A8960</td><td>骨髓间充质干细胞成骨分化</td></tr><tr><td>记号笔</td><td>Zebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd.&amp;nbsp;</td><td>YYST5</td><td>在培养皿上标记细胞信息</td></tr><tr><td>MEM α 改良培养基（1×）</td><td>上海年悦生物科技有限公司</td><td>SH30265</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>小鼠骨髓间充质干细胞成脂分化试剂盒</td><td>Cyagen</td><td>MUXMX-90031</td><td>骨髓间充质干细胞成脂分化&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>尼康Eclipse Ti2倒置显微镜 Synstem</td><td>日本尼康公司</td><td>Ti2-U</td><td>观察细胞并拍照</td></tr><tr><td>眼科剪&amp;nbsp;</td><td>上海年悦生物科技有限公司</td><td>Y00030 JZ</td><td>切开皮肤</td></tr><tr><td>眼科镊子</td><td>上海年悦生物科技有限公司</td><td>BS-ZER-S-100 Biosharp</td><td>获取小鼠骨组织。</td></tr><tr><td>巴斯德移液管</td><td>上海年悦生物科技有限公司</td><td>BS-XG-03M</td><td>吸除培养基</td></tr><tr><td>PE 大鼠抗小鼠 CD31（克隆：Ha2/5）</td><td>BD 生物科学</td><td>553373</td><td>流式细胞术&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PE 大鼠 IgG2a， &amp;kappa; 同型对照（克隆：R35-95）</td><td>BD 生物科学</td><td>553930</td><td>流式细胞术&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PE-Cyanine7 Ly-6A/E (Sca-1) 单克隆抗体（克隆号：D7）</td><td>eBioscience</td><td>25-5981-82</td><td>流式细胞术&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PE-Cyanine7 大鼠 IgG2a κ 同型对照（克隆：eBR2a）</td><td>eBioscience</td><td>25-4321-82</td><td>流式细胞术&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>上海年悦生物科技有限公司</td><td>2585636</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 大鼠抗小鼠 CD45（克隆：Ha2/5）</td><td>BD 生物科学</td><td>561869</td><td>流式细胞术&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 大鼠 IgG2b &amp;kappa; 同型对照（克隆：A95-1）</td><td>BD 生物科学</td><td>550764</td><td>流式细胞术&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>上海医疗器械（集团）有限公司外科器械厂&amp;nbsp;</td><td>J11010-10# JZ</td><td>分离小鼠的后肢和躯干，并去除骨骼上的多余组织</td></tr><tr><td>无菌操作台</td><td>赛默飞世尔科技（中国）有限公司</td><td>ECO0.9</td><td>手术操作台</td></tr><tr><td>无菌手术巾</td><td>河南华誉医疗器械有限公司</td><td>20160900</td><td>提供无菌手术区域</td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>上海拜赛生物科技有限公司&amp;nbsp;</td><td>BLD-BL2002500</td><td>储存过滤后的细胞悬液</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>消化贴壁细胞</td></tr><tr><td>&amp;beta;-甘油磷酸盐</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G5422</td><td>骨髓间充质干细胞成骨分化</td></tr></tbody></table>

小鼠骨髓间充质干细胞的分离、扩增及基于流式细胞术的表型分析

Purification, Expansion, and Flow Cytometry-Based Phenotyping of Mouse Derived Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

间充质干细胞（MSCs）是一类具有自我更新能力并可分化为多种细胞谱系的干细胞。其中，存在于骨髓中的间充质干细胞，称为骨髓间充质干细胞（BMSCs），在成骨作用、造血支持、归巢/迁移以及免疫抑制方面发挥着关键作用。由于其在细胞治疗策略中的潜力，以及易于获取、遗传稳定性高和免疫原性低等特点，BMSCs被广泛应用于细胞生物学和组织工程研究。造血干细胞（HSCs）与BMSCs共存于骨髓中，但来源于不同的前体细胞。在从骨髓提取细胞时，通常会获得多种细胞类型，可能导致细胞群体的异质性，从而引发实验偏差，难以满足高标准的实验要求。因此，建立有效的技术以提高体外培养中BMSCs的纯度和得率至关重要&#160;in vitro。本研究提供了一种从BALB/c小鼠中分离BMSCs的详细方案，包括纯化、扩增及基于流式细胞术的表型鉴定。通过流式细胞术对第3代BMSCs的均一性和干细胞表型进行表征，结果显示其对CD29、CD44和Sca-1呈阳性，对CD45和CD31呈阴性，并证实其具备成骨和成脂分化能力。该方案成本低、操作简便高效，可获得数量充足、均一性高且具有强增殖与多向分化潜能的BMSCs，对于推动小鼠模型研究及广泛的临床前研究具有重要意义。

小鼠来源的骨髓间充质干细胞（BMSCs）被分离并培养约2周，以获得第3代（P3）BMSCs（图3）。如图所示 图3A，从骨髓中 freshly 提取的细胞保持单核状态，并可见脂滴。培养皿中出现纺锤形细胞，在第5天达到60%–80%融合度th 培养天数 (图3B,C）。从P1-P3（图3D-F），BMSCs 呈细长的梭形，以单层方式生长，并形成细胞集落网络。细胞通常保持适当的间距，胞质清晰，无明显凋亡迹象，细胞核未见异常碎片。
流式细胞术分析显示，骨髓间充质干细胞表面标志物 CD29（<stron...

本方案描述了一种经济高效的方法，用于纯化、扩增和表征小鼠来源的高度均一的骨髓间充质干细胞（BMSCs）。该方法有助于获得大量具有高增殖和分化潜能的BMSCs，可支持小鼠模型研究并推动临床前研究的进展。

间充质干细胞（MSCs）是一类具有自我更新能力并可分化为多种细胞谱系的干细胞。其中，存在于……的MSCs

我们的研究提供了一种低成本的方法，用于纯化和扩增均一的小鼠骨髓间充质干细胞。该方法有助于研究人员获得足量的高质量细胞，这些细胞具有较强的增殖和分化能力。骨髓干细胞研究中的一个关键挑战是建立一种简单且高效的骨髓间充质干细胞分离方案。本方法通过避免干扰，使骨髓间充质干细胞实现侧向生长。该方法采用第三代传代，不添加外源性生长因子，并保留造血细胞以支持干细胞的健康与功能。[指导教师] 首先，将已处死的小鼠浸入75%乙醇中5分钟。使用无菌解剖剪，在后肢跟腱附近做一个约1厘米长的切口。然后，在后肢周围做环形切口，暴露远端胫骨。从切口处向上朝髋部方向剥离皮肤，以去除双侧后肢的皮肤。沿髂骨剪开，使股骨头与髋骨分离。使用无菌手术刀，尽可能去除胫骨和腓骨上的肌腱和肌肉，以便后续冲洗操作。将清理干净的骨骼放回含有2%青霉素和链霉素的PBS培养皿中，然后转移至无菌操作台。取一个50毫升注射器，安装随注射器附带的针头。用20毫升α-MEM培养基充满注射器，然后更换为1毫升注射器所配的针头。在无菌操作台内，用剪刀剪去分离后的股骨或胫骨的两端。将针头插入骨的切割端，将骨髓冲洗至含有完全α-MEM培养基的100毫米细胞培养皿中。持续冲洗，直至骨骼明显变苍白，表明骨髓已成功提取。使用1毫升移液器枪头反复吹打40次，以分散任何细胞团块。接着，将细胞悬液通过40微米细胞滤网过滤至50毫升离心管中，以去除碎片、组织残渣及未分散的团块。用完全α-MEM培养基将总体积调至15毫升，并将过滤后的细胞悬液转移至100毫米培养皿中。双手持皿，轻轻以“8”字形摇晃15次，使细胞均匀分布于皿内。最后，将培养皿置于37°C、5%二氧化碳培养箱中，培养5天。该图展示了骨髓基质细胞从初始提取到第三代传代培养过程中的形态学演变。新鲜提取的骨髓细胞主要为单核细胞，视野中可见散在的脂滴。培养至第5天时，开始出现纺锤形细胞，融合度达到约60%至80%，到第7天时细胞密度进一步增加。从第一代到第三代，骨髓基质细胞保持纺锤形或梭形形态，形成清晰的单层结构，集落相互连接，未见细胞质颗粒化或核碎裂等凋亡迹象。流式细胞术证实，CD29、CD44和Sca-1在骨髓基质细胞中高表达，而内皮细胞和造血细胞谱系标志物CD31和CD45的表达可忽略不计。标志物定量分析进一步证实，与CD31和CD45相比，CD29、CD44和Sca-1的表达水平显著升高。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

小鼠骨髓间充质干细胞的纯化、扩增和基于流式细胞术的表型

本文介绍了一种通过流式细胞术分析骨髓造血祖细胞分布的方法，以及高效分离高纯度造血干细胞（HSCs）的技术。该分离流程主要基于对c-Kit+细胞的磁珠富集，再通过细胞分选来纯化HSCs，用于细胞和分子水平的研究。...

小鼠造血干细胞及谱系定向祖细胞的表型分析与分离

我们描述了一种通过密度梯度离心法从小鼠骨髓中分离和纯化中性粒细胞，并使用CellTracker染料对中性粒细胞进行标记的实验方案。该方法简单、快速、可重复且经济，适用于获取大量中性粒细胞，以用于后续的功能研究或过继转移与示踪实验。...

小鼠骨髓中性粒细胞的分离、纯化及标记用于功能研究与过继性转移实验

我们概述了一种通过流式细胞术检测原代急性髓系白血病细胞上白血病干细胞标志物共表达的实验方案。我们展示了如何定量分析三种具有不同程度成熟特征的前体细胞群以及一个假定的白血病干细胞（LSC）群体。我们已在相应的患者来源异种移植模型中证实了这些细胞群的存在。...

通过流式细胞术在初诊及随访时评估原发性急性髓系白血病和患者来源异种移植模型中的白血病干细胞

在缺乏形态学标准或细胞遗传学信息不明确的情况下，骨髓增生异常综合征（MDS）的诊断较为困难。多参数流式细胞术（MFC）可能有助于优化MDS的诊断流程。为了在临床实践中具有应用价值，MFC分析必须基于具备足够特异性和敏感性的参数，且不同操作者之间的数据应具有可重复性。...

基于数据库指导的流式细胞术评估骨髓髓系细胞成熟度

我们展示了如何利用磁珠分选与荧光激活细胞分选技术（MACS 和 FACS）相结合的方法，从小鼠骨髓中鉴定并分离出 6 个髓系祖细胞亚群。该方案可用于 体外 培养实验（甲基纤维素培养或液体培养） 体内...

从小鼠骨髓中鉴定与分离寡能性及谱系定向的髓系祖细胞

异源物质外排泵在造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中具有高度活性，会导致线粒体膜电位荧光染料TMRM被排出。本文介绍了一种在维拉帕米（一种外排泵抑制剂）存在的情况下，使用TMRM准确测定HSPCs中线粒体膜电位的实验方案。...

通过抑制外排泵提高流式细胞术检测造血干细胞和祖细胞线粒体膜电位的准确性

本方法描述了通过流式细胞术从小鼠股骨、胫骨和骨盆骨中纯化巨核细胞-红细胞祖细胞（MEP）和巨核细胞祖细胞（MKp）。...

小鼠巨核细胞祖细胞的分离

本文介绍了一种简单的小鼠骨髓细胞分离与染色方案，用于表征造血干细胞和祖细胞，以及支持性微环境中的内皮细胞和间充质干细胞。方案中还包括一种富集位于骨内膜区和骨髓中央区域细胞的方法。...

小鼠骨髓造血干细胞与祖细胞及基质微环境细胞的流式细胞术分析

本方案描述了采用单细胞分选方法对人源间充质干细胞进行荧光激活细胞分选的应用。具体而言，当单细胞分选与基于多参数流式细胞术的方法相结合时，可从异质性细胞群体中获得纯度达99%的免疫表型细胞。...

从人脱落乳牙中分选免疫表型鉴定的间充质干细胞的单细胞分离技术

本文提供了一种详细的实验方案，用于从小鼠模型中分离和表征骨髓增生异常综合征及急性髓系白血病的骨髓微环境细胞群体。该技术可识别疾病进展过程中非造血性骨髓微环境（包括内皮细胞和间充质基质细胞）的变化。...

识别骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病中的骨髓微环境细胞群

学习小鼠骨髓间充质干细胞的纯化、扩增与流式细胞术表型分析方法。该低成本方案可获得高纯度、具有强增殖与分化能力的BMSCs，为再生医学与临床前研究提供可靠细胞来源。

小鼠骨髓间充质干细胞的分离、扩增及基于流式细胞术的表型分析

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