小鼠骨髓间充质干细胞的纯化、扩增和基于流式细胞术的表型

我们的研究提供了一种低成本的方法来纯化和扩增均质小鼠骨髓间充质干细胞。这有助于研究人员获得足够的具有强大生长和分化能力的优质细胞。骨髓干细胞研究的一个关键挑战是开发一种简单有效的方案来分离骨髓间充质干细胞。这种方法通过避免干扰让骨髓间充质干细胞横向生长。它使用第三次传代，避免额外的生长效应，并保留造血细胞以支持干细胞的健康和功能。

[导师]首先，将安乐死的小鼠浸泡在75%乙醇中五分钟。使用无菌解剖剪刀，在跟腱附近的后肢切开大约一厘米的切口。然后，在后肢周围做一个圆形切口，露出胫骨远端。将切口部位的皮肤向上向臀部剥离，以去除双后肢的皮肤。沿髂骨切开，将股骨头与髋骨分离。使用无菌手术刀，从胫骨和腓骨上去除尽可能多的肌腱和肌肉，以缓解以后的冲洗。将清洁后的骨头放回含有含有 PBS 和 2% 青霉素和链霉素的培养皿中，然后将它们移入无菌罩中。拿一个 50 毫升的注射器，连接注射器随附的针头。用 20 毫升 α MEM 培养基填充注射器，并用一毫升注射器随附的针头更换针头。在无菌罩中，用剪刀剪掉分离的股骨或胫骨的两端。现在，将针头插入切割边缘的骨头中，并将骨髓冲洗到含有完整 α MEM 培养基的 100 毫米细胞培养皿中。继续冲洗，直到骨头明显变白，表明骨髓提取成功。使用一毫升移液器吸头上下移液 40 次，以分散任何细胞聚集体。现在，通过 40 微米细胞过滤器将细胞悬液过滤到 50 毫升离心管中，以去除碎片、组织碎片和未分散的团块。用完整的α MEM培养基将总体积调整为15毫升，并将过滤后的细胞悬液转移到100毫米培养皿中。用双手握住盘子，以八字形动作轻轻旋转 15 次，使细胞均匀分布在盘子上。最后，将培养皿放入37摄氏度，5%二氧化碳的培养箱中培养五天。该图说明了骨髓基质细胞从初始提取到培养第三代的形态学进展。新鲜提取的骨髓细胞主要是单核细胞，整个区域都可以看到散落的脂肪滴。到培养的第五天，纺锤形细胞开始出现并达到约 60% 至 80% 的汇合度，到第七天密度继续增加。从传代一代到传代三代，骨髓基质细胞保持纺锤形或梭形形态，形成具有相互连接的集落的透明单层，并且没有表现出细胞质颗粒或核碎裂等细胞灭亡迹象。流式细胞术证实CD29、CD44和Sca-1在骨髓基质细胞中高表达。内皮和造血谱系的CD31和CD45标志物表达可以忽略不计。与CD31和CD45相比，标记物定量进一步证实了CD29、CD44和Sca-1的高表达水平。