Name: 人诱导多能干细胞来源的心脏球体的生成、高通量筛选和生物样本库 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 了解人诱导多能干细胞来源的心肌细胞生成心脏球体的方法，用于高通量筛选和生物样本库建立。该技术支持疾病建模、药物筛选及再生医学研究，为心脏生物学提供三维生理相关模型。

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我们感谢VALA sciences提供Cyteseer软件包以及对自动化3D钙成像分析的优化。感谢PLN基金会（RM）提供的基金支持。P.A.D.和F.S.由CUREPLaN Leducq资助。J.P.G.S.由欧洲研究理事会（ERC）H2020-EVICARE项目（#725229）资助。J.W.B.由乌得勒支大学医学中心临床研究员项目、荷兰心脏研究所研究员项目以及荷兰心脏基金会CVON-Dosis青年人才基金（CVON-Dosis 2014-40）资助。N.C.由引力计划资助。 &#34;材料驱动再生&#34; 由荷兰科学研究组织（RegmedXB #024.003.013）和玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里行动计划（资助协议 RESCUE #801540）资助。V.S.-P. 由乌得勒支大学医学中心、乌得勒支大学和埃因霍温理工大学联合基金（Alliance Fund）支持。A.v.M. 由欧盟资助的 BRAVE 项目（H2020，ID:874827）支持。

注意：本研究中使用的hiPSC-CMs是根据先前描述的hiPSC培养和心肌细胞分化方案生成的26,27。可选地，在开始收缩力测定（CS）方案（第4节）之前，可按照近期发表的方法对hiPSC-CMs进行扩增并冷冻保存10。
1. 细胞培养基、溶液和分装液的制备
<ol>
	<li>准备基础培养基
	<ol>
		<li>将青霉素-链霉素和培养基（RPMI 1640）平衡至室温（RT），并确保完全解冻。混合500 mL培养基和5 mL青霉素-链霉素。4 °C保存，最长8周；使用前平衡至37 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备RPMI + B27培养基
	<ol>
		<li>将B27添加剂和基础培养基平衡至室温，确保添加剂完全解冻。混合490 mL基础培养基和10 mL 50倍浓缩的B27添加剂。4 °C保存，最长2周；使用前平衡至37 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备hiPSC-CM重铺培养基
	<ol>
		<li>向RPMI + B27培养基中添加Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）抑制剂（终浓度2 µM）和10%敲除血清替代物（KSR）。根据需要直接将ROCK抑制剂加入RM培养基中。补充后请勿储存培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备心肌细胞解冻培养基
	<ol>
		<li>向RPMI + B27培养基中添加1:100浓度的细胞存活添加剂（例如Revitacell）和20% KSR，使用前平衡至37 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备成熟化添加剂
	<ol>
		<li>先前描述的成熟化培养基配方28包含：3 mM葡萄糖、10 mM L-乳酸、5 mg/mL维生素B12、0.82 mM生物素、5 mM肌酸一水合物、2 mM牛磺酸、2 mM L-肉碱、0.5 mM抗坏血酸、1倍非必需氨基酸（NEAA）、0.5%（w/v）albumax、1倍B27和1% KOSR。为配制一瓶完整（500 mL）成熟化添加剂，从一瓶无葡萄糖DMEM中移除65 mL，并加入2.7 g葡萄糖、5.6 g L-乳酸、0.025 mg维生素B12、1 mg生物素、3.73 g肌酸一水合物、1.25 g牛磺酸、1.975 g L-肉碱、0.7125 g抗坏血酸、50 mL NEAA、12.5 g albumax和5 mL青霉素-链霉素。</li>
		<li>使用带有0.22 µm孔径聚醚砜（PES）膜的无菌一次性滤器过滤。</li>
		<li>分装为45 mL（用于配制500 mL成熟化培养基）或4.5 mL（用于配制50 mL成熟化培养基）。-20 °C保存，最长6个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备成熟化培养基
	<ol>
		<li>将B27添加剂、敲除SR、青霉素-链霉素、成熟化添加剂28以及无葡萄糖DMEM培养基平衡至室温，确保添加剂完全解冻。混合435 mL无葡萄糖DMEM培养基、10 mL 50倍浓缩B27添加剂、5 mL青霉素-链霉素、5 mL敲除SR和45 mL成熟化添加剂。4 °C保存，最长2周；使用前在37 °C平衡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备荧光亮培养基
	<ol>
		<li>将青霉素-链霉素和DMEM荧光亮培养基平衡至室温，确保添加剂完全解冻。混合500 mL DMEM荧光亮培养基和5 mL青霉素-链霉素。4 °C保存，最长1个月；使用前平衡至37 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备非离子型去垢剂溶液
	<ol>
		<li>将20% w/v非离子型去垢剂粉末（例如F-127）与PBS混合。使用0.22 µm滤器过滤，4 °C保存，最长6个月；使用前平衡至室温。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备钙离子染料培养基
	<ol>
		<li>在荧光亮培养基中加入非离子型去垢剂溶液（终浓度0.04% v/v）和0.1倍钙离子染料（例如Cal520 AM）。在50 mL锥形管中加入10 µL Cal520和20 µL非离子型去垢剂溶液，混合至完全溶解。加入细胞前需避光保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 缓冲液的制备
<ol>
	<li>配制透化和封闭缓冲液：该缓冲液包含 10 mL PBS、5%（w/v）BSA 和 0.3%（v/v）Triton-X-100。</li>
	<li>配制流式细胞术缓冲液：该缓冲液包含 50 mL PBS、1%（w/v）BSA 和 0.3%（v/v）Triton-X-100。</li>
	<li>流式细胞术洗涤缓冲液：该缓冲液包含 50 mL PBS 和 1%（w/v）BSA。</li>
	<li>类球体洗涤缓冲液（SWB）：该缓冲液包含 1 mL Triton-X-100、2 mL 10%（w/v，溶于 DPBS）SDS 和 2 g BSA，溶于 1 L PBS 中。 
	注意：SWB 可在 4 °C 保存最多 2 周。</li>
	<li>配制包埋溶液（ES）：配制 100 mL 包埋溶液，需将 50 mL 甘油与 9.09 mL dH2O、1 mL Tris 缓冲液（1 M，pH 8.0）和 200 µL EDTA（0.5 M）混合。加入 22.7 g 果糖，在室温避光条件下搅拌至完全溶解；溶液澄清后，再加入 22.2 g 果糖，继续搅拌至溶解；随后加入 15 g 尿素，搅拌至完全溶解（避光，4 °C 保存）。</li>
	<li>配制 PBT（含 Tween-20 的 PBS）缓冲液：该缓冲液含 PBS/Tween-20（0.1% v/v）。每 1 L PBS 中加入 1 mL Tween-20。</li>
</ol>
小分子的制备
<ol>
	<li>将噻唑维林（ROCK抑制剂）粉末用DMSO溶解，配制成每份50 µL、浓度为10 mM的溶液，分装后于-20 °C保存，可保存长达6个月。避光保存。</li>
	<li>将Cal-520 AM用DMSO溶解，配制成每份10 µL、浓度为2.5 mM的溶液，分装后于-20 °C保存，可保存长达6个月。避光保存。</li>
</ol>
4. 心脏类球体的生成
注意：对于较大量的心球（CSs），可在6孔超低吸附培养板中加入2 mL hiPSC-CM重铺培养基，接种多达100万个CMs。本研究在96孔板的每孔中使用了最少2,500个（2.5k CS）至最多20,000个（20k CS）hiPSC-CMs。
<ol>
	<li>对于一个 96 孔板，准备含有至少 2 × 106 个人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）10 的细胞培养物。</li>
	<li>当培养的 hiPSC-CMs 达到汇合状态时，向每孔中加入 0.1 mL/cm2 的无菌心脏细胞解离溶液（例如 tryple）。将培养板在 37 °C 下孵育 15 分钟。</li>
	<li>使用 5 mL 移液管，用 2 mL 温热的基础培养基冲洗细胞，通过机械方式解离细胞，制成单细胞悬液。在明场显微镜下（4 倍放大）确认解离效果；细胞呈白色且呈圆形。</li>
	<li>将细胞悬液转移至 15 mL 圆锥形离心管中，在 300 × g 条件下离心 3 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，并将细胞重悬于 1 mL hiPSC-CM 重铺培养基中。</li>
	<li>使用 1,000 µL 移液枪头机械解离细胞沉淀。经过三到四次混匀后，溶液应呈现均一状态。计数细胞，并将适量细胞转移至含 100 µL 重铺培养基的超低吸附圆底 96 孔板各孔中。</li>
	<li>将心脏球体（CSs）培养板置于培养箱内的轨道摇床上，以 70 rpm 振荡培养 24 小时。设置培养箱条件为 37 °C、5% CO2、21% O2 和 90% 湿度。</li>
	<li>从每孔中吸除 50 µL 培养基，并向每孔添加 100 µL RPMI + B27 培养基，持续前 48 小时。 
	注意：始终保留 96 孔板中每孔 50 µL 培养基，以避免意外吸除和类球体破裂。</li>
	<li>从每孔中吸除 100 µL 培养基，并向每孔添加 100 µL 成熟培养基。将细胞维持在成熟培养基中，并每 2–3 天更换一次培养基。</li>
</ol>
5. CSs 的冷冻保存
注意：类器官可进行冷冻保存以实现长期储存。自类器官生成后的第3天起即可进行冷冻保存。类器官可直接在96孔板的孔中进行冷冻保存，也可作为类器官悬液在冻存管中保存。
<ol>
	<li>将培养板置于冰上预冷10分钟。</li>
	<li>以70 × g 离心培养板3分钟。</li>
	<li>吸除上清液，每孔保留50 µL，然后每孔加入200 µL预冷的hiPSC冻存液。 
	注意：整个操作过程中，细胞球悬液均需保持在冰上。若使用6孔板培养细胞球，可将一孔细胞悬液转移至500 µL冻存管中进行冷冻。</li>
	<li>用封板膜密封培养板。 
	注意：96孔板需置于聚苯乙烯盒中保存；若无聚苯乙烯盒，可按步骤5.5.1所述方法制备硅胶模具替代。</li>
	<li>为确保培养板与冷冻设备之间均匀的热交换，请小心将培养板放入聚苯乙烯盒或硅胶模具中。
	<ol>
		<li>制备硅胶模具的方法：按10:1的比例充分混合硅胶弹性体试剂盒中的两种组分，使用真空泵脱气15–20分钟；随后将混合液倒入培养板底部，再次使用真空泵脱气10分钟；将模具放入烘箱中，在60 °C下固化8小时，得到半柔性弹性体，之后从培养板上剥离即可。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将培养板置于聚苯乙烯盒或已制备的硅胶模具中，在-80 °C条件下冷冻至少4小时。</li>
	<li>将培养板转移至液氮罐或-150 °C超低温冰箱中进行长期保存。</li>
</ol>
6. 心脏类器官的解冻
注意：为确保快速解冻，每次解冻的培养板不得超过一块。
<ol>
	<li>在50 mL锥形管中准备20 mL预热至37 °C的基础培养基。</li>
	<li>从液氮中取出含有CSs的细胞板，放入培养箱中孵育15分钟。设置培养箱条件为37 °C、5% CO2、21% O2和90%湿度。</li>
	<li>去除上清液，保留细胞沉淀，并用预热的基础培养基重悬每个孔中的细胞。每孔使用200 µL培养基。</li>
	<li>在70 × g 条件下离心3分钟。</li>
	<li>重复步骤6.3和6.4。</li>
	<li>吸除上清液，保留细胞沉淀，每孔加入200 µL CM解冻培养基。</li>
	<li>将含有CSs的细胞板置于摇床培养箱中，以70 rpm振荡培养24小时。设置培养箱条件为37 °C、5% CO2、21% O2和90%湿度。</li>
	<li>在最初48小时内，从每个孔中吸出50 µL培养基，并向每孔加入100 µL RPMI + B27培养基。</li>
	<li>此后，从每个孔中吸出100 µL培养基，并向每孔加入100 µL成熟培养基。将细胞维持在成熟培养基中，并每2–3天更换一次培养基。</li>
</ol>
7. 细胞内 Ca2+ 瞬变的评估
注意：CS 细胞总共培养 3 周；冻存前培养 2 周，复苏后培养 1 周。‘新鲜’对照组为年龄匹配的样本。
<ol>
	<li>培养 1 周后，解冻的 CSs 最适合进行钙处理的光学成像。使用钙染料（例如 Cal520AM）评估细胞内 Ca2+ 的摄取与释放。</li>
	<li>每孔加入 100 µL 钙染料培养基，在培养箱中孵育 60 分钟。设置培养箱条件为 37 °C、5% CO2、21% O2 和 90% 湿度。 
	注意：Cal520AM 对光敏感。所有染料加载步骤和实验均需在避光条件下进行。</li>
	<li>准备钙信号采集与分析系统。
	<ol>
		<li>开启显微镜电源，确保环境控制功能已启用。</li>
		<li>调整相机和视场光阑尺寸，以最小化背景区域。 
		注意：此处使用的是 Leica Thunder DMi8 显微镜；其他显微镜系统也可适用，只要其采样率高于 30 帧/秒（fps）即可。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>录制一段视频，要求在 10 秒内持续记录 2−10 个钙峰信号，并以锯齿形方式扫描整个 96 孔板——先向左移动，再向下移动，依次覆盖全部孔位。使用 488 nm 激光检测钙信号；在钙释放期间，将对比度设置为黑色背景配明亮的绿色信号。</li>
	<li>获取 Ca2+ 瞬变信号后，根据制造商说明书，使用荧光轨迹分析软件（例如 CyteSeer、Vala Sciences）对数据进行分析。</li>
</ol>
8. 解离心脏类球体的流式细胞术分析
注意：本研究中，采用流式细胞术检测冻存前和解冻后 CSs 的活力。
<ol>
	<li>使用5 mL移液管将CSs收集至15 mL锥形管中，以避免类球体损伤，然后在70 ×g条件下离心3分钟。吸除上清液，并加入1 mL PBS。</li>
	<li>在200 × g条件下离心3分钟。吸除上清液，通过加入1 mL心肌细胞解离溶液（例如TrypLE）解离CSs。将试管在37 °C孵育15分钟。</li>
	<li>使用5 mL移液管，用2 mL基础培养基反复吹打，机械解离细胞，直至在显微镜下观察到单细胞状态。</li>
	<li>在200 × g条件下离心3分钟。</li>
	<li>吸除上清液，并用200 µL含4%多聚甲醛（PFA）的1×PBS溶液固定CMs。室温孵育10分钟。</li>
	<li>在200 × g条件下离心3分钟。吸除上清液，并加入1 mL PBS。 
	注意：可暂停步骤：固定后的hiPSC-CMs可在4 °C保存长达4周。</li>
	<li>将细胞悬液转移至FACS管中，在200 × g条件下离心3分钟。吸除上清液后，将1 × 105个细胞重悬于50 µL透化缓冲液中。</li>
	<li>在4 °C孵育30分钟。</li>
	<li>进行免疫荧光流式细胞术分析时，请执行步骤8.9.1–8.9.4。
	<ol>
		<li>将细胞重悬于含α-肌动蛋白素抗体（稀释比例1:300）的流式细胞术缓冲液（50 µL）中。在另一FACS管中，将1 × 105个细胞重悬于含相应同型对照抗体（例如FITC标记的小鼠IgM，κ同型，稀释比例1:200）的流式细胞术缓冲液（50 µL）中。同样，将1 × 105个细胞重悬于50 µL流式细胞术缓冲液中作为空白对照。</li>
		<li>在4 °C孵育30分钟。</li>
		<li>加入2.5 mL流式细胞术缓冲液，在4 °C、200 ×g条件下离心3分钟；弃去上清液，重复洗涤两次。</li>
		<li>将细胞重悬于含二抗山羊抗小鼠抗体（稀释比例1:300）的50 µL流式细胞术缓冲液中。 
		注意：将试管置于避光环境中，因二抗溶液对光敏感。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用碘化丙啶（PI）进行细胞活力检测时，每份样品加入150 µL PI（1:1,000），孵育15分钟。 
	注意：将试管置于避光环境中，因PI溶液对光敏感。</li>
	<li>根据补充图1所示的标准设门策略调整设门参数，并使用流式细胞仪分析细胞。</li>
</ol>
9. 三维球状体整体免疫荧光染色
注意：本实验方案基于先前发表的免疫荧光标记后全类器官高分辨率三维成像方案29，并针对心源性球体进行了调整。在操作过程中，所有移液枪头和锥形管均可用1% wt/v BSA-PBS进行包被，以防止球体粘附于塑料器皿表面。包被时，将器皿浸入1% BSA-PBS溶液中即可。使用5 mL移液管时需小心，避免对球体造成机械损伤或破坏。
<ol>
	<li>使用5 mL移液管将类球体收集至15 mL包被离心管中。类球体肉眼可见。每种抗体组合收集约20–50个类球体。以70 × g离心3分钟，吸除上清液。</li>
	<li>使用包被的1 mL吸头，将类球体轻柔重悬于1 mL冰浴的4%多聚甲醛（PFA）溶液（溶于1× PBS）中。</li>
	<li>在4 °C固定45分钟。20分钟后，使用包被的1 mL吸头轻轻重悬类球体，以确保所有类球体固定均匀。</li>
	<li>向管中加入10 mL冰浴的PBS，通过反复倒置混匀。在4 °C孵育10分钟，然后以70 × g离心3分钟。 
	注意：从本步骤开始，由于类球体在固定后不再粘附吸头，因此通常无需再对吸头和离心管进行包被处理。</li>
	<li>通过将沉淀重悬于冰浴的SWB中（每孔200 µL SWB）进行封闭，并将类球体转移至24孔悬浮培养板中。 
	注意：一个大沉淀中的类球体可分装至多个孔中，以进行不同染色。每种抗体组合使用约20–50个类球体。</li>
	<li>在4 °C孵育至少15分钟。</li>
	<li>在空白孔中加入200 µL SWB，作为参照孔。 
	注意：为减少抗体用量，免疫荧光染色也可使用48孔或96孔板。但由于每孔体积较小，染色和洗涤效果可能降低。</li>
	<li>将培养板倾斜45°角静置5分钟，使类球体沉降至孔底。</li>
	<li>吸除SWB，保留200 µL SWB于孔中（可使用参照孔估计最小保留体积为200 µL）。</li>
	<li>加入含2倍浓缩的一抗的SWB 200 µL（例如ɑ-肌动蛋白[1:200]和肌钙蛋白T[1:200]），在4 °C避光孵育过夜，同时轻轻振荡（水平摇床，40 rpm）。</li>
	<li>次日，向每孔加入1 mL SWB。</li>
	<li>将培养板倾斜45°角静置5分钟，使类球体沉降至孔底。</li>
	<li>吸除SWB，每孔保留200 µL，再加入1 mL SWB，缓慢振荡洗涤2小时。</li>
	<li>重复步骤9.12和9.13两次。</li>
	<li>将培养板倾斜45°角静置5分钟，使类球体沉降至孔底。吸除SWB，每孔保留200 µL。</li>
	<li>加入含2倍浓缩的二抗、偶联抗体和染料的SWB 200 µL（例如DAPI[1 µg/mL]、小鼠-AF488[1:500]、兔-AF568[1:500]），在4 °C避光孵育过夜，同时缓慢振荡。</li>
	<li>次日，重复步骤9.12和9.13两次。</li>
	<li>小心将类球体转移至1.5 mL离心管中，以70 × g离心3分钟。</li>
	<li>用移液器尽可能吸除SWB，避免破坏类球体。</li>
	<li>使用剪去尖端的200 µL吸头加入包埋液（ES；至少50 µL，室温），轻柔重悬以防止气泡产生，并在室温孵育20分钟。</li>
	<li>同时，在载玻片上用指甲油或硅胶密封剂制作一个方形容器。</li>
	<li>剪去200 µL吸头的尖端，将含类球体的ES转移至方形容器中央。</li>
	<li>盖上方形盖玻片。为减少气泡，先将盖玻片一侧接触液面，然后缓慢从一侧向另一侧放下，直至盖玻片下方无空气残留，再完全释放盖玻片。</li>
	<li>轻压盖玻片所有边缘，使其与指甲油或硅胶密封剂密封。</li>
	<li>将载玻片在室温放置过夜。次日即可进行成像。 
	注意：包埋液（ES）的光学透明化可能导致轻微组织收缩，但不会影响类球体的整体形态。可通过将载玻片在4 °C（至少1周）或-20 °C（至少6个月）保存，暂停染色流程。</li>
</ol>

<ol><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+and+small+molecule-based+generation+of+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined and small molecule-based generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+optimization+of+activin%2Fnodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 1848-1857 (2012).</li>
<li>Paige, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+is+required+for+cardiac+differentiation+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Endogenous Wnt/beta-catenin signaling is required for cardiac differentiation in human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 5 (6), 11134(2010).</li>
<li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+preclinical+cancer+drug+cardiotoxicity+testing%3A+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).</li>
<li>Ahmed, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 19 (8), 178(2020).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+3D+human+cardiac+constructs+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Generating 3D human cardiac constructs from pluripotent stem cells.</a> EBioMedicine. 76, 103813(2022).</li>
<li>Musunuru, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+for+cardiovascular+disease+modeling+and+precision+medicine%3A+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Genomic+and+Precision+Medicine%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells for cardiovascular disease modeling and precision medicine: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation: Genomic and Precision Medicine. 11 (1), 000043(2018).</li>
<li>Buikema, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+activation+and+reduced+cell-cell+contact+synergistically+induce+massive+expansion+of+functional+human+iPSC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).</li>
<li>Maas, R. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+expansion+and+cryopreservation+of+functional+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Massive expansion and cryopreservation of functional human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell STAR Protocols. 2 (1), 100334(2021).</li>
<li>Tremblay, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+construction+technique+for+tissue-engineered+heart+valves+using+the+self-assembly+method%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">A new construction technique for tissue-engineered heart valves using the self-assembly method.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (11), 905-915 (2014).</li>
<li>Lewis-Israeli, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+human+heart+organoids+for+the+modeling+of+cardiac+development+and+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease.</a> Nature Communications. 12 (1), 5142(2021).</li>
<li>Goldfracht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+heart+tissue+models+from+hiPSC-derived+cardiomyocytes+and+cardiac+ECM+for+disease+modeling+and+drug+testing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Engineered heart tissue models from hiPSC-derived cardiomyocytes and cardiac ECM for disease modeling and drug testing applications.</a> Acta Biomaterialia. 1 (92), 145-159 (2019).</li>
<li>Fleischer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+human+stem+cell+differentiation+in+a+2D+and+3D+mode+to+cardiomyocytes+for+long-term+cultivation+and+multiparametric+monitoring+on+a+multimodal+microelectrode+array+setup%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Comprehensive human stem cell differentiation in a 2D and 3D mode to cardiomyocytes for long-term cultivation and multiparametric monitoring on a multimodal microelectrode array setup.</a> Biosensors and Bioelectronics. 126, 624-631 (2019).</li>
<li>Branco, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+of+3D+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+reveals+faster+cardiomyocyte+maturation+compared+to+2D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis of 3D cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells reveals faster cardiomyocyte maturation compared to 2D culture.</a> Science Reports. 9 (1), 9229(2019).</li>
<li>Ergir, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+maturation+of+human+iPSC-derived+cardiac+organoids+in+long+term+culture%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Generation and maturation of human iPSC-derived cardiac organoids in long term culture.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Lemoine, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+cultured+in+3D+engineered+heart+tissue+show+physiological+upstroke+velocity+and+sodium+current+density%5BTitle%5D)+AND+%22Scienctific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density.</a> Scienctific Reports. 7 (1), 5464(2017).</li>
<li>Kofron, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+predictive+in+vitro+risk+assessment+platform+for+pro-arrhythmic+toxicity+using+human+3D+cardiac+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">A predictive in vitro risk assessment platform for pro-arrhythmic toxicity using human 3D cardiac microtissues.</a> Science Reports. 11 (1), 10228(2021).</li>
<li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-iPSC-derived+cardiac+stromal+cells+enhance+maturation+in+3D+cardiac+microtissues+and+reveal+non-cardiomyocyte+contributions+to+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3D cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease.</a> Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).</li>
<li>Richards, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cardiac+organoids+for+the+modelling+of+myocardial+infarction+and+drug+cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).</li>
<li>Tenreiro, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+of+heart+regenerative+therapies%3A+progress+and+promise+of+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22npj+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Next generation of heart regenerative therapies: progress and promise of cardiac tissue engineering.</a> npj Regenerative Medicine. 6 (1), 30(2021).</li>
<li>Hansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+drug+screening+platform+based+on+engineered+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue.</a> Circulation Research. 107 (1), 35-44 (2010).</li>
<li>McDermott-Roe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+a+dilated+cardiomyopathy-associated+variant+in+BAG3+using+genome-edited+iPSC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Investigation of a dilated cardiomyopathy-associated variant in BAG3 using genome-edited iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), 128799(2019).</li>
<li>National Library of Medicine (U.S.). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+engineered+human+myocardium+as+biological+ventricular+assist+tissue+in+terminal+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22National+Library+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of induced pluripotent stem cell-derived engineered human myocardium as biological ventricular assist tissue in terminal heart failure.</a> National Library of Medicine. , Identifier NCT04396899 (2020).</li>
<li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li>
<li>Oh, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+ventricular-like+HiPSC-derived+cardiomyocytes+and+high-quality+cell+preparations+for+calcium+handling+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Generation of ventricular-like HiPSC-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization.</a> Journal of Visualized Experiments. 155, 60135(2020).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li>
<li>Feyen, D. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+maturation+media+improve+physiological+function+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (3), 107925(2020).</li>
<li>van Ineveld, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+resolution+three-dimensional+imaging+of+intact+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60709(2020).</li>
<li>Guo, Y., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+maturation%3A+New+phase+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte maturation: New phase in development.</a> Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).</li>
<li>Ding, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+renal+organoids+from+whole+kidney+cells%3A+Generation%2C+optimization%2C+and+potential+application+in+nephrotoxicology+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional renal organoids from whole kidney cells: Generation, optimization, and potential application in nephrotoxicology in vitro.</a> Cell Transplantation. 29, 963689719897066(2020).</li>
<li>Denning, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocytes+from+human+pluripotent+stem+cells%3A+From+laboratory+curiosity+to+industrial+biomedical+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocytes from human pluripotent stem cells: From laboratory curiosity to industrial biomedical platform.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1863, 1728-1748 (2016).</li>
<li>Amaral, R. L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+3D+bladder+tumor+spheroids+obtained+by+forced+floating+and+hanging+drop+methods+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening.</a> Frontiers in Physiology. 8, 605(2017).</li>
<li>Daily, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+cardiac+action+potential+measurements%3A+2D+and+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioengineering+and+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Improving cardiac action potential measurements: 2D and 3D cell culture.</a> Journal of Bioengineering and Biomedical Science. 5 (3), 168(2015).</li>
<li>Preininger, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%3A+Strategies%2C+challenges%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Strategies, challenges, and future directions.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 951, 123-135 (2016).</li>
<li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+human+embryonic+stem+cells+derived-cardiomyocytes+induced+by+BMP2+in+serum-free+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Science%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of human embryonic stem cells derived-cardiomyocytes induced by BMP2 in serum-free condition.</a> Reproductive Science. 18 (3), 252-360 (2011).</li>
<li>Daily, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+primary+cultures+of+mammalian+somatic+cells+in+96-well+plates+benefits+from+control+of+ice+nucleation%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of primary cultures of mammalian somatic cells in 96-well plates benefits from control of ice nucleation.</a> Cryobiology. 93, 62-69 (2020).</li>
<li>Zhang, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+on+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+assessing+drug+safety+response+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles.</a> Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).</li>
<li>Yeh, H. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calcium-dependent+regulation+of+spheroid+formation+and+cardiomyogenic+differentiation+for+MSCs+on+chitosan+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes.</a> Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).</li>
<li>Scalise, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+spheroids+to+organoids%3A+The+next+generation+of+model+systems+of+human+cardiac+regeneration+in+a+dish%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">From spheroids to organoids: The next generation of model systems of human cardiac regeneration in a dish.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13180(2021).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

心脏药物研发受到依赖非人类动物和细胞模型的限制，这些模型通量不足且生理保真度较低，难以准确进行功能检测。将hiPSC-CM生物学与高通量（HT）仪器及生理探针相结合，有望将人类模型重新引入心脏疾病建模和药物发现的早期阶段。我们开发了一种3D心脏组织生成方法，可制备高质量且功能性的心球（CSs），为优化的心脏疾病建模和药物筛选平台提供支持。此外，将类球体技术与3D生物反应器系统结合用于工业规模的细胞外囊泡（EV）生产，是推动基于EV治疗向临床转化的关键一步。本文所述方法依赖于多个关键因素，是对现有方案9,10,28,29的改进变体，包括：1）3D组织结构的构建；2）筛选前最佳的细胞数量与时间控制；3）提升仪器的灵敏度和高通量能力；4）能够在功能分析前冷冻保存类球体。与以往报道的方案不同，本方案可实现每天最多生成1,500个类球体，并适用于高通量筛选（HTS）。使用现有的96孔钙成像系统或24孔多重工程化心肌组织系统，对一百种化合物在6 × 0.5 log剂量下进行10次重复的传统分析，大约需要5亿至30亿个hiPSC-CMs31,32。由于本方案在96孔板中所需的接种密度仅为已有方法的10%，因此相较于传统系统，心脏筛选的成本更低且更节省时间。此外，与以往如悬滴法等方案相比，通过超低吸附板中细胞自聚集生成类球体的方法，能够实现对单个微组织的高质量自动化成像33。
这个小型三维模型模拟了生物体的生物学和生理学表型 体内 心血管环境。如先前研究所证实，与二维单层细胞培养相比，三维心脏组织构建物中的钙瞬变显著增加34.
接下来，我们发现接种密度和适当的培养时间也是成功进行CS筛选的关键因素。每个类球体接种10K-20K个hiPSC-CMs，并在生成后的第2至第3周之间进行筛选为最佳条件；而过小或过老的类球体则表现出钙处理功能紊乱（图2 和 图3）。因此，保持尽可能一致的接种密度非常重要，因为类球体大小会影响其功能参数。此外，尽管该光学方法对整体活体3D培养组织能提供良好的结果，但在不依赖耗时的组织学方法的情况下，获取较大类球体内部在（亚）细胞水平上的数据仍具有挑战性。近期已有若干研究报道了采用&#34;光学透明化&#34;技术，可实现整个3D类球体的成像，并有机会对标志物进行单细胞定量分析。本文中，我们采用了一项从CS收获到图像分析共需3天的方案，该方案已针对共聚焦显微镜的3D成像进行了优化29（图1C 和 图4D）。
最后，随着三维心脏组织应用及商业化应用的增加，来自不同供体的长期储存和患者特异性生物样本库的需求日益上升。冷冻保存是一种有效的策略，可随时间推移从多个批次制备高通量筛选板。人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）的冻存此前已有描述，其操作与其他培养细胞类型并无差异。10,35,36最近，已有针对2D细胞培养板的冷冻保存方法的描述37在此，我们发现相比于其他三种条件（数据未显示），PSC 冻存试剂盒是最优条件，并采用该培养基对类球体进行高效冻存。冻存后，细胞活力仍保持较高水平（图4B,C，但CSs的电生理特性会受到影响，解冻后需要一段孵育期。事实上，解冻1周后，CSs表现出自发性搏动活性和钙处理能力。然而，已有研究指出，新鲜的与复苏后的hiPSC-CMs并不总是表现出相同的分子和生理特性38这一局限性在使用冻存的hiPSC-CMs评估药物诱导的心脏反应时需予以考虑。此外，尽管我们已有效调控了每个类球体中的细胞数量以及钙瞬变成像的最佳时间点，但仍可通过将hiPSC来源的心肌细胞与内皮细胞、成纤维细胞、细胞间连接结构以及细胞外基质（如壳聚糖、IV型胶原、纤连蛋白、Matrigel或层粘连蛋白）共混合，以模拟天然心肌组织的微环境，从而进一步优化心脏类球体模型。 体内 心脏微环境39,40总体而言，我们提出了一种逐步操作方案，可高效生成适用于疾病建模和高通量药物筛选等下游应用的CSs。

人类诱导性多能干细胞（hiPSCs）的发现为在细胞水平上研究人类发育和疾病提供了前所未有的机遇。在过去十年中，基于发育生物学的原理，已建立多种实验方案，以实现hiPSCs向心肌细胞（CMs）的高效分化1,2,3,4。由hiPSCs分化而来的心肌细胞（hiPSC-CMs）可作为研究遗传性心血管疾病（CVDs）、评估新药心脏安全性以及探索心脏再生策略的重要资源5,6,7,8。尽管已能定向诱导hiPSCs分化为心肌细胞，但在心脏研究领域，心肌细胞数量的无限扩增仍是一大挑战，因为成熟的hiPSC-CMs通常不具备增殖能力，且原代人类心肌细胞难以大量获取。
最近，我们描述了在低细胞密度培养条件下同时激活Wnt信号通路可导致hiPSC-CMs发生显著的增殖反应（高达250倍）9,10一种经济高效的hiPSC-CMs大规模扩增策略 通过 以培养瓶形式进行连续传代有助于大量功能性hiPSC-CMs的标准化和质量控制。此外，为满足来自不同供体的大批量hiPSC-CMs需求，已有研究报道了hiPSC-CMs的生物样本库建立。10然而，在这些标准培养皿中接种的心肌细胞单层无法真实反映心脏中复杂的三维结构。此外，hiPSC-CMs 的不成熟性一直是一个障碍，因而难以模拟心肌细胞的生物学和生理学表型 体内 心血管环境
已开发出新型的三维体外（in vitro）模型，其中人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）表现出更接近生理状态的行为，例如自我组织11,12、细胞外基质（ECM）重塑13、增强的成熟度14,15,16以及同步收缩17,18,19。三维模型已被应用于药物发现、药物心脏毒性检测、疾病建模、再生治疗，甚至已进入首次临床试验阶段20,21,22,23,24。其中应用最广泛的模型之一是基于纤维蛋白的工程化心肌组织（EHT），其具有类似组织的结构和心脏收缩功能13,17,25。此前，我们已证明由扩增后的hiPSC-CMs生成的EHT与未扩增细胞来源的EHT具有相当的收缩力，表明细胞功能在扩增后未受影响9。然而，尽管由hiPSC-CMs生成EHT的技术已较为成熟，但在建立高通量评估平台方面仍需进一步发展。本文所述方法通过在96孔板中快速生成大量可自我聚集的心脏类球体（CSs），从而优化了适用于高通量筛选（HTS）的三维培养条件。
总体而言，细胞球（CSs）作为三维细胞培养体系的主要优势在于其高度的可重复性和可扩展性。特别是，将细胞球与机器人样品处理系统相结合，可实现细胞球培养、药物处理及高内涵分析的标准化和自动化20。本文中，我们描述了优化的实验方案，用于生成高纯度、高质量的细胞球，这些细胞球可高效冷冻保存，并通过光学钙成像与分析系统进行钙离子（Ca2+）瞬变检测，以评估其心脏功能。该模型为开展针对数百至数千个球状体的高通量筛选提供了一种简便而强大的工具17,18。

<table><tbody><tr><td>24孔悬浮培养板&amp;nbsp;</td><td>康宁&amp;nbsp;</td><td>3738</td><td></td></tr><tr><td>96孔超低吸附多孔板</td><td>康宁</td><td>CLS3474-24EA</td><td></td></tr><tr><td>Albumax</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11020021</td><td></td></tr><tr><td>抗-&amp;alpha;α-肌动蛋白（肌节型）抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7811</td><td>稀释比例：1:200</td></tr><tr><td>抗心肌肌钙蛋白T抗体（ab45932）</td><td>Abcam</td><td>ab45932</td><td>稀释比例：1:200</td></tr><tr><td>抗坏血酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>B-27 添加剂&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>生物素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白第五组分（BSA）</td><td>罗氏</td><td>10735086001</td><td></td></tr><tr><td>Cal-520, AM&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab171868</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>DMi8&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜软件&amp;nbsp;</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>Las X</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 锥形管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>5618-8271</td><td></td></tr><tr><td>肌酸一水合物&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3630</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>D3571</td><td>浓度：1 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>DMEM 无葡萄糖&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11966025</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>果糖&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76050771.05</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>轰鸣</td><td>76050771.05</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>稀释比例：1:500</td></tr><tr><td>山羊抗兔 Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11011</td><td>稀释比例：1:500</td></tr><tr><td>水平摇床</td><td>IKA</td><td>4003000</td><td></td></tr><tr><td>人类诱导多能干细胞系</td><td>（斯坦福心血管研究所（S-CVI）生物样本库）</td><td>CVI-273（对照1）</td><td></td></tr><tr><td>人类诱导多能干细胞系</td><td>德国&amp;nbsp;</td><td>141（对照组2）144（对照组3）</td><td></td></tr><tr><td>盐酸（HCl）&amp;nbsp;</td><td>Ajax Firechem</td><td>265.2.5L-PL</td><td>10 M 储备液，具有腐蚀性</td></tr><tr><td>同型对照，FITC 标记的小鼠 IgM &amp;kappa; 同型型</td><td>BD</td><td>556652</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut血清替代物&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10828</td><td>避光</td></tr><tr><td>L-肉碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0283</td><td></td></tr><tr><td>心肌细胞钙离子与收缩性系统</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>Thunder，DMi8</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸（NEAA）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>4%多聚甲醛溶液（溶于1×PBS，pH 7.0）&amp;ndash;7.6</td><td>圣克鲁斯</td><td>SC281692</td><td>危险的</td></tr><tr><td>PBS，pH 7.4</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>PES 膜真空过滤系统</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>431097</td><td></td></tr><tr><td>PI/RNase 染色液</td><td>Invitrogen</td><td>F10797</td><td>稀释比例：1:1000</td></tr><tr><td>泊洛沙姆&amp;nbsp;F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>PSC 冷冻保存试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A2644601</td><td></td></tr><tr><td>RevitaCell</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A2644501</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>硅胶弹性体试剂盒</td><td>SYLGARD</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠溶液（10%）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td></td></tr><tr><td>L-乳酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71718</td><td></td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Tris Fisher&amp;nbsp;</td><td>科学&amp;nbsp;</td><td>11486631</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>默克</td><td>X100-1L</td><td>危险的</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select 酶（10 倍浓缩液）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A1217701</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>尿素&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>维生素B12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V6629</td><td></td></tr><tr><td>盐酸Y-27632（Rho激酶抑制剂）</td><td>Tocris&amp;nbsp;</td><td>1254</td><td>避光保存</td></tr></tbody></table>

人诱导多能干细胞来源心脏类球体的生成、高通量筛选与生物样本库保存

Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）在人类心脏疾病建模与治疗研究中具有极其重要的意义。我们近期发表了一种在二维（2D）条件下大规模扩增hiPSC-CMs的低成本策略。然而，该方法存在两个主要局限性：细胞成熟度不足，以及缺乏三维（3D）结构和在高通量筛选（HTS）平台中的可扩展性。为克服这些局限性，扩增后的心肌细胞可作为理想的细胞来源，用于构建3D心脏细胞培养体系及组织工程技术。后者在心血管研究领域具有广阔前景，可提供更为先进且生理相关性更高的高通量筛选平台。本文介绍了一种兼容高通量筛选、易于扩增的实验流程，可用于在96孔板体系中生成、维持并进行心脏类球体（CSs）的光学分析。这些小型心脏类球体对于弥补当前研究中的空白至关重要 体外 用于三维组织工程平台的疾病模型构建与生成。心形球体（CSs）具有高度有序的形态结构、尺寸和细胞组成。此外，以心形球体形式培养的人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）表现出更高的成熟度以及多种人类心脏的功能特征，例如自发性钙处理和收缩活性。通过从心形球体生成到功能分析的全流程自动化，我们提高了批次内和批次间的可重复性，高通量（HT）成像和钙处理分析结果已对此加以验证。本方案所述的实验流程可在完全自动化的高通量筛选（HTS）工作流程中，于复杂的三维细胞环境中实现心脏疾病的建模以及药物/治疗效应在单细胞水平上的评估。此外，本研究还描述了一种简便的全球状体长期保存与生物样本库建立方法，使研究人员能够构建下一代功能性组织储存体系。高通量筛选与长期保存相结合，将在药物发现与测试、再生医学以及个体化治疗开发等多个领域显著推动转化医学研究。

所示方案 图1A 描述了从先前扩增的人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）生成心肌球（CSs）的过程。将细胞接种于超低吸附圆底培养板后，心肌球在第1天即形成三维结构，并可培养长达6周。图1B）。通过免疫荧光染色评估，3周龄的CS细胞中大多数表达肌节蛋白（如α-肌动蛋白和肌钙蛋白T），并呈现出规则的肌节结构。图1C）。为了定量分析α-肌动蛋白in阳性细胞，进行了流式细胞术分析。与免疫荧光结果一致，流式细胞术数据显示，第0天（76.9% ± 16.6%）和培养3周的CSs（71.1% ± 22.7%）中α-肌动蛋白in的水平均维持在较高且相当的水平（图1D)，表明在培养过程中细胞组成稳定且高度纯净。与在二维培养条件下培养90天的hiPSC-CMs相比，由hiPSC-CMs衍生的球状体（第42天）中编码连接结构（GJA1、JPH2和PKP2）、桥粒（DES）以及线粒体（ATP5A）的心脏基因表达水平显著上调。图1E这些基因的表达是细胞间相互作用和成熟过程的标志性特征。30.
随后，在不同时间点评估了CSs的功能特性，即搏动频率和Ca2+处理能力（图2）。钙瞬变参数，如上升时间、达峰时间、衰减时间和钙瞬变持续时间（CTD90），如图2A、B所示进行评估。生成后前3周内搏动型CSs的比例相似，但在第6周（Wk6）显著下降（图2C）。与Wk1相比，Wk3时的搏动频率显著降低，并且与搏动型CSs的比例相似，在Wk6时急剧下降（图2D）。在Wk6时观察到CSs功能退化，这可以解释搏动频率以及搏动型CSs数量的下降。钙瞬变参数的测量结果显示，Wk2时的峰值显著升高（图2E），而与Wk1相比，Wk3时的上升时间、衰减时间和CTD90均显著延长（图2F-H）。综上所述，这些结果表明，由hiPSC-CM衍生的球状体在生成后约第2至第3周功能状态最佳。
图3展示了类球体大小对搏动频率和钙处理能力的影响。通过在96孔板的每个孔中接种2.5 × 104、5 × 104、10 × 104和20 × 104个hiPSC-CMs，生成了CSs，每种条件下共制备24个CSs/孔（图3A）。如预期所示，随着接种细胞数量的增加，类球体的尺寸也随之增大，范围从178 ± 36 µm到351 ± 65 µm（图3A，右图）。在培养3周后的CSs中，检测了四种不同接种密度下的Ca2+瞬变（图3B）。对搏动CSs的测量结果显示，较小尺寸的CSs（2.5K和5K-CSs）中仅有约50%具有搏动能力，而较大尺寸的搏动CSs（10K和20K-CSs）中具有搏动能力的比例显著更高（约85%）（图3C）。5K、10K和20K-CSs表现出相似的搏动频率（约28 bpm），显著高于2.5K-CSs（图3D）。在所有测试条件下，钙成像的峰值水平相似（图3E），但上升时间（图3F）、衰减时间（图3G）和CTD90（图3H）在较大尺寸的CSs（10K和20K-CSs）中显著长于较小尺寸的CSs（2.5K和5K-CSs）。综上所述，这些结果表明，当接种密度为每孔10K至20K个hiPSC-CMs时，由hiPSC-CMs衍生的类球体最适合用于钙处理能力的筛选。
接下来，我们评估了冷冻保存对心肌细胞球（CS）活力和功能的影响。在分析之前，将解冻后的CS在体外培养1周（图4A）。流式细胞术（图4B）和Calcein-AM染色（图4C）的细胞活力检测结果均显示，冷冻保存对CS内细胞的活力无显著影响。此外，与新鲜的同龄CS相比，解冻后的CS在肌节蛋白的表达水平上也相似（图4D）。这些结果表明，CS可被高效地冷冻保存，适用于后续的心脏功能分析和高通量筛选。
最后，在新鲜和冻存的CSs中分别检测了搏动活性和Ca2+处理能力（图5）。在解冻后的不同时间点（分别为2、5和7天）测量了搏动CSs的百分比。尽管大多数新鲜CSs在培养过程中持续表现出搏动活性，但明显可见冻存CSs需要在培养中恢复约1周时间才能恢复其搏动活性（图5B）。解冻后CSs的搏动频率与新鲜CSs相比无显著差异；然而，部分冻存CSs未观察到自发性搏动活性（图5C）。尽管与新鲜CSs相比，冻存-解冻CSs的峰值显著降低（图5D），但在上升时间、下降时间以及冻存-解冻CSs的CTD90方面，与新鲜CSs相比均无显著变化（图5E-G）。这些数据表明，在解冻后，应将CSs在培养箱中至少恢复1周，再进行搏动活性和Ca2+瞬变的测量。
综上所述，这些结果表明，人诱导多能干细胞来源的心肌细胞球体在冻存后仍能保持心肌细胞的活力、肌节结构以及其功能特性，如自发性搏动和钙处理能力。因此，人诱导多能干细胞来源的心肌细胞球体是准确模拟心脏电生理学的合适模型。 体外.
<img alt="hiPSC 分化为心肌细胞；时间线、类球体图像、免疫荧光；心脏标志物数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：心脏类球体的生成。（A）基于 Wnt 信号通路的定向心脏分化、hiPSC-CMs 的后续扩增以及 CSs 的生成示意图。由 biorender.com 制作。（B）CS 培养过程中不同时间点的明场图像。比例尺，200 µm。Wk 表示周。（C）3 周龄 CSs 中心肌肌节蛋白 α-肌动蛋白和肌钙蛋白 T 的代表性免疫荧光图像。免疫荧光染色：Hoechst（蓝色）、α-肌动蛋白（绿色）和肌钙蛋白 T（红色）。比例尺，200 µm。右侧放大后的合并图像显示肌节结构。比例尺，50 µm。（D）CS 形成前（第 0 天）及形成后 3 周时 α-肌动蛋白阳性细胞的流式细胞术定量分析。（每组 n = 14–23）。（E）对培养 90 天的 hiPSC-CMs（二维培养）和培养 42 天的类球体样本进行 RT-qPCR 检测，以确定与细胞连接、中间丝和线粒体相关的不同心脏基因的表达水平。（n = 1–3 批次）。数据以均值 ± 标准差表示。经非配对 t 检验计算，NS 表示无显著性差异。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="分析细胞搏动动态的荧光衰减图、显微镜图像和统计图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：生成后不同周数的心脏类球体（CSs）的搏动频率和钙处理情况。 （A）由Cyteseer软件中的Vala Sciences分析算法计算出的钙瞬变参数示例。（B）生成后不同时间点（周）心脏类球体（CSs）的代表性钙瞬变轨迹及延时图像。比例尺，200 µm。（C）自发性搏动活性的时间过程量化结果，以搏动的心脏类球体（CSs）百分比表示。（D）培养期间心脏类球体（CSs）的搏动频率。（E–H）钙瞬变参数的量化结果，显示峰值、上升时间、衰减时间和CTD90。数据表示为均值 ± 标准差（SD）。生物学重复次数 = 3次，技术重复次数分别为38、50、66和7。*p &lt; 0.05，****p &lt; 0.001；采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行Tukey事后多重比较检验。缩写：CTD = 钙瞬变持续时间，Wk = 周，CSs = 人类心脏类球体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞球体生长和荧光分析；包括大小比较、荧光显微镜观察和搏动频率数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：使用不同细胞接种密度生成的心脏球体（CSs）中的搏动频率和钙处理特性。 （A）使用不同数量的hiPSC-CMs生成的CSs的明场成像（左）和尺寸测量（右）。比例尺，200 µm。 （B）2.5K-20K-CSs的代表性钙瞬变曲线及时间推移图像。 （C,D）2.5K-20K-CSs的搏动百分比和搏动频率。 （E-H）2.5K-20K-CSs中的峰值、上升时间、衰减时间和CTD90。数据以均值±标准差表示。生物学重复次数 = 3，技术重复次数 = 28–39。*p &lt; 0.05，****p &lt; 0.001；采用单因素方差分析，随后进行Tukey事后多重比较检验。缩写：CTD = 钙瞬变持续时间，Wk = 周，k = ×1,000 个细胞，CSs = 心脏球体。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="人iPSC-CMs的冷冻保存研究；活/死细胞检测；FACS结果；活力分析；显微镜观察。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4．冷冻保存对心肌球体活力与结构的影响。（A）心肌球体（CS）的生成、后续生物样本库保存及解冻过程的示意图。（B）新鲜与冷冻保存后CS的流式细胞术细胞活力检测。以10% Triton-X溶液处理5分钟作为阳性对照。（每组n = 4）。数据表示为均值±标准差。****p &lt; 0.001；采用单因素方差分析，随后进行Tukey多重比较检验。（C）培养7天后新鲜与解冻CS的Calcein-AM细胞活力检测（每组n = 15–17，****p &lt; 0.001，配对t检验；比例尺，200 µm）。（D）新鲜与解冻CS的代表性明场图像（左）及α-肌动蛋白和肌钙蛋白T表达的免疫荧光染色。免疫荧光染色：Hoechst（蓝色）、α-肌动蛋白（绿色）和肌钙蛋白T（红色）。右侧合并图像显示CS中的肌节条纹结构。比例尺，50 µm。缩写：X = 选定的解冻日，PI = 碘化丙啶，Cal-AM = Calcein-AM，EthD-I = Ethidium Homodimer I。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="心脏类球体分析；荧光成像，搏动频率、活力的柱状图，新鲜样本与冻存样本对比" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5新鲜与冻融后心肌细胞中钙瞬变的比较 (A代表性钙瞬变轨迹及冷冻保存前和解冻后1周的心球（CSs）延时图像。B新鲜和冻融心肌球体的搏动百分比。柱状图代表单次实验结果。C新鲜与冻融心肌类球体的搏动频率。D-G钙瞬变参数的定量分析：峰值、上升时间、衰减时间及 CTD90。数据以均值 ± 标准差表示。 *p &lt; 0.05, ****p &lt; 0.001；采用单因素方差分析，随后进行Tukey事后多重比较检验。缩写：CTD = 钙瞬变持续时间，CSs = 心脏类球体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
补充图1：流式细胞术分析的代表性设门策略。 （A）在纯细胞群中，α-肌动蛋白in阳性hiPSC-CMs相对于阴性对照和同型对照的代表性设门策略。分析的α-肌动蛋白in阳性细胞数量为25 × 105。缩写：SSC = 侧向散射，PI+ = 碘化丙啶阳性。（B）新鲜样本、解冻样本、阳性对照（Triton-X）和阴性对照（未染色）的活力分析代表性设门策略。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/figures%20version%202_6-end.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍了一组从人诱导性多能干细胞衍生的心肌细胞在高通量、多维度培养条件下生成心脏类球体（CSs）并进行冷冻保存的实验方案。该三维模型可作为疾病建模和高通量筛选的可靠平台，并在冷冻保存后仍能维持其功能特性。

人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）在人类心脏疾病建模与治疗研究中具有至关重要的意义。我们……

本方案描述了心肌类球体的生成、维持及光学分析的工作流程。这些心肌类球体对于弥补现有体外疾病模型的不足至关重要。该技术可使研究人员实现下一代高通量筛选及心肌类球体的功能性保存。首先，向含有融合生长的人诱导多能干细胞来源心肌细胞的培养板的每个孔中加入每平方厘米1毫升的无菌心肌细胞分离液。在37摄氏度下孵育15分钟。在明场显微镜4倍放大下观察呈白色且呈圆形的细胞，以确认细胞已脱离。使用5毫升移液管，用2毫升预热的基础培养基反复吹打细胞，进行机械解离，以制备单细胞悬液。将细胞悬液转移至15毫升锥形管中，在300×g条件下离心3分钟。然后吸除上清液，将细胞重悬于1毫升hiPSC-CM重铺培养基中。使用1,000微升移液枪头重悬细胞沉淀。反复吹打三到四次，直至溶液呈均匀状态，然后将细胞悬液转移至计数板中进行细胞计数，并将适量细胞加入100微升传代培养基中，分别接种至超低吸附、圆底的96孔板的各个孔内。将含有心肌球体的培养板置于培养箱中的轨道摇床上，于37摄氏度、5%二氧化碳、21%氧气和90%湿度条件下，以70 rpm振荡培养24小时。为避免类球体破裂，每次仅从每个孔中吸出50微升培养基，并在最初48小时内每孔加入100微升RPMI加B27培养基。随后，从每个孔中吸出100微升培养基，并每孔加入100微升成熟培养基。将细胞维持在成熟培养基中，并每两到三天更换一次培养基。将球状体培养板置于冰上预冷10分钟，然后以70g离心3分钟。吸除培养基，每孔保留50微升。随后每孔加入200微升冰上预冷的hiPSC冻存液。使用封板膜将板密封。制备硅胶模具时，按10:1的比例混合硅胶弹性体试剂盒的组分，并将混合液加入到孔板的底部。使用真空泵脱气15至20分钟。将模具放入烘箱中，在 60 摄氏度下固化 8 小时，得到半柔性弹性体，并从平板上剥离。小心地将密封的平板放入硅胶模具中，确保孔板与冷冻设备之间有均匀的热交换。在制备好的硅胶模具中，于 -80 摄氏度下冷冻平板至少 4 小时，然后将平板转移至液氮罐或 -150 摄氏度的超低温冰箱中进行长期保存。为确保心肌类球体快速解冻，每次从液氮中取出一块含有心肌类球体的细胞板，放入37摄氏度、含5%二氧化碳、21%氧气和90%湿度的培养箱中孵育15分钟。移除板上的密封膜，每孔吸除150微升液体，然后向每孔加入200微升预热的基础培养基。以70×g离心3分钟，并重复一次预热基础培养基洗涤步骤。操作完成后，吸除每孔中的 150 微升培养基，并向每孔中加入 200 微升心肌细胞解冻培养基。随后重复心肌球体生成过程中所述的 RPMI 洗涤步骤，接着将细胞维持在成熟培养基中。培养一周后，解冻的心肌球体即可用于钙处理的光学成像。吸出每孔150微升培养基。在避光条件下，每孔加入100微升Cal-520 AM钙染料培养基处理解冻的心脏类球体，并将培养板孵育60分钟。启动显微镜并确保环境控制功能已开启，以准备钙信号采集与分析系统。调整相机和框架光圈尺寸，以尽量减少背景区域。为测量钙信号，使用488纳米激光，将对比度设置为黑色背景，钙释放时呈现明亮的绿色信号。录制一段视频，要求在10秒内持续记录2到10个峰。录制一段10秒的视频，以锯齿状方式扫描整个96孔板，初始向左移动，然后向下移动，以覆盖整块孔板。采集钙瞬变信号后，使用荧光轨迹分析软件分析数据。心肌类球体在接种后第一天即形成三维结构，可培养长达六周。大多数三周大的心肌类球体表现出规则的肌节结构，α-辅肌动蛋白和肌钙蛋白T表达明显。在培养过程中，第0天和三周大的心肌类球体中均检测到高水平的α-辅肌动蛋白，表明细胞组成稳定且纯度高。与在二维条件下培养90天的人诱导多能干细胞来源心肌细胞（hiPSC-CMs）相比，类球体中心脏基因、桥粒蛋白和线粒体的表达水平更高。心肌类球体在生成后的前三周搏动比例相似，但在第六周显著下降，这是由于心肌类球体发生退化所致。与对照组相比，搏动频率在第3周显著降低，并在第6周因功能退化而进一步下降。钙瞬变参数显示，第2周的峰值更高，而第3周的上升时间、衰减时间以及90%衰减时的钙瞬变持续时间均显著延长，表明由hiPSC-CM衍生的球状体在生成后第2周和第3周功能状态最佳。球状体的尺寸随接种细胞数量的增加而增大。在体积更大、更成熟的类球体中，搏动频率显著更高。与2.5k类球体相比，5k、10k和20k类球体均表现出相似且显著更高的搏动率。冷冻保存对心肌类球体内的细胞活力无影响。解冻后的心肌类球体与新鲜的同龄类球体在肌节蛋白表达上相似，表明冷冻保存效果良好。解冻后与新鲜的心脏类球体在搏动频率上无显著差异。在上升时间、下降时间以及解冻后或新鲜CS的CTD90方面均未观察到显著变化。除了可用于疾病建模和高通量药物筛选外，这些类球体还可用于作为细胞外囊泡生产的生物反应器以及细胞外囊泡相关疗法。此外，这些球状体的生物样本库可作为再生策略中心肌细胞供应的新途径。越来越多的证据表明，来源于患者的囊性纤维化、癌症和心脏球状体干细胞模型的生物样本库，在揭示药物筛选的分子机制以及实现个体化医疗方面具有巨大潜力。

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生物工程

人诱导多能干细胞来源的心脏球体的生成、高通量筛选和生物样本库

多能干细胞，包括胚胎干细胞或诱导性多能干细胞（iPS细胞），是获取人类分化细胞（包括心肌细胞）的重要来源。本文将重点介绍iPS细胞向心脏细胞的诱导分化，展示如何通过基于拟胚体的方案获得功能性人类心肌细胞。...

人类心肌细胞的生成：从无饲养层人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞制备方案

本文详细描述了通过选择性调控Wnt信号通路，将人多能干细胞高效分化为心肌细胞的方法，并随后通过流式细胞术分析参考标志物，以评估细胞群体的均一性和身份特征。...

高效率诱导人多能干细胞分化为心肌细胞及通过流式细胞术进行表征

本文介绍一种针对人多能干细胞（hPSCs）的稳定、快速且可扩展的心肌细胞分化方案。利用该大规模方法获得的心肌细胞可提供足够数量的细胞，有效用于人类心血管疾病建模、高通量药物筛选，以及潜在的临床应用。...

利用高可重复性小分子诱导分化方案实现人多能干细胞向心肌细胞的大规模生产

本文描述并验证了一种稳定生成强健的人诱导性多能干细胞来源心肌细胞的方法，并对其功能进行了表征。这些技术可能有助于深入理解信号通路的机制，为大规模药物筛选提供平台，并可靠地模拟心脏疾病。...

生成心室样人诱导多能干细胞来源心肌细胞及用于钙处理特性表征的高质量细胞制备

本文介绍一种易于使用的3D自组装心脏微组织阵列制备方法，该阵列由预先分化的人诱导多能干细胞来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞组成。这种操作简便且所需细胞量少的心脏微组织制备技术，可用于疾病建模及药物研发的早期阶段。...

利用人iPSC来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞构建三维心脏微组织阵列

本方案旨在通过悬滴共培养细胞来制备三维心脏球状体（CSs）。 将胶原蛋白包埋的CSs用生理浓度的阿霉素（DOX，一种心脏毒性试剂）处理，以建立心力衰竭模型。利用DOX处理的CSs进行体外测试，可用于发现针对心力衰竭患者的新疗法。...

用于研究人类心脏病理生理学的体外生物工程心脏组织——心肌球体

本文介绍了一种从患者外周血单个核细胞稳健地生成并扩增人心肌细胞的实验方案。...

从患者外周血单个核细胞生成与扩增人心肌细胞

人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）为临床前心脏毒性筛选提供了一种替代动物实验的方案。hiPSC-CMs在临床前毒性筛选中广泛应用的一个局限性在于其未成熟、类似胎儿表型的特性。本文介绍了一套高效且快速促进hiPSC-CMs成熟的实验方案。...

高通量心脏毒性筛选：利用成熟的人诱导多能干细胞来源心肌细胞单层

利用光来控制心肌细胞和组织可实现非接触式刺激，从而保持细胞的自然状态和功能，这一方法在基础研究和治疗应用中均具有重要价值。...

一种用于通过非遗传性光学刺激研究钙离子（Ca2+）传导的心脏微生理系统

我们开发了一种高密度微阵列平台，该平台由名为CaBChip的白色念珠菌（C.

Candida albicans 生物膜芯片（CaBChip）用于高通量抗真菌药物筛选

了解人诱导多能干细胞来源的心肌细胞生成心脏球体的方法，用于高通量筛选和生物样本库建立。该技术支持疾病建模、药物筛选及再生医学研究，为心脏生物学提供三维生理相关模型。

人诱导多能干细胞来源心脏类球体的生成、高通量筛选与生物样本库保存

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