人诱导多能干细胞来源的心脏球体的生成、高通量筛选和生物样本库

该协议描述了心脏微球生成，维护和光学分析的工作流程。这些心脏球体对于填补当前体外疾病模型的空白至关重要。该技术使研究人员能够创建下一代高通量筛选和心脏球状体的功能存储。

首先向含有汇合的人诱导多能干细胞来源心肌细胞的培养板的每个孔中加入每平方厘米一毫升的无菌心脏脱离溶液。将板在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。通过在明场显微镜的4倍放大镜下观察白色和圆形细胞来确认细胞的分离。

使用五毫升移液器，用两毫升温热的基础培养基冲洗细胞以机械方式解离细胞以制备单细胞悬液。将细胞悬液转移到15毫升锥形管中，并以300g离心三分钟。然后吸出上清液，并将细胞重悬于一毫升hiPSC-CM重镀培养基中。

使用1， 000微升移液器吸头解离细胞沉淀。混合三或四次后，当溶液看起来均匀时，将其装入盒中以计数细胞，并将100微升重镀培养基中的适量的细胞转移到超低附着，圆底，96孔板的每个孔中。将心脏球状体板放在培养箱中的轨道振荡器上，转速为70 rpm，温度为37摄氏度，5%二氧化碳，21%氧气和90%湿度，持续24小时。

为避免球体破裂，仅从每个孔中吸出 50 微升培养基，并在前 48 小时内每孔添加 100 微升 RPMI 加 B27 培养基。接下来，从每个孔中吸出100微升培养基，每孔加入100微升成熟培养基。将细胞保持在成熟培养基中，每两到三天更新一次培养基。

将球体板放在冰上10分钟进行预冷，然后在70g下离心板3分钟。取出培养基，直到孔中残留 50 微升。然后每孔加入200微升冰冷的hiPSC冷冻培养基。

用板密封膜密封板。要制备硅模具，请将硅弹性体套件的组分以10:1的比例混合，并将溶液添加到孔板的底部。使用真空泵将溶液除泡 15 到 20 分钟。

将模具放入烤箱中，在60摄氏度下固化8小时，得到从板上剥离的半柔性弹性体。将密封板小心地放入硅胶模具中，确保孔板和冷冻机之间的热交换均匀。将板在80摄氏度下在准备好的硅胶模具中冷冻至少四个小时，然后将板转移到液氮罐或150摄氏度的冰箱中长期储存。

为确保心球快速解冻，一次从液氮中收集一个带有心微球的细胞板，并将其置于培养箱中，在37摄氏度下，具有5%二氧化碳，21%氧气和90%湿度。从板上取下密封膜，并在向每个孔中加入200微升温基础培养基之前吸出每个孔150微升。将板以70g离心三分钟，然后重复温热的基础培养基洗涤。

完成后，取出150微升培养基，并在每个孔中加入200微升心肌细胞解冻培养基。然后重复在心脏球状体生成过程中提到的RPMI洗涤，然后将细胞保持在成熟培养基中。培养一周后，解冻的心脏球体最适合钙处理光学成像。

每孔吸出150微升。在黑暗条件下每孔用100微升Cal-520 AM钙染料培养基处理解冻的心脏球体，并将板孵育60分钟。通过为显微镜供电并确保环境控制选项打开来准备钙采集和分析系统。

调整相机和取景光圈尺寸以最小化背景区域。为了测量钙信号，使用488纳米激光，在钙释放期间将对比度设置为黑色背景和亮绿色信号。在 10 秒内录制具有 2 到 10 个峰值的一致流的视频。

录制一个10秒的视频，并扫描96孔板，最初向左移动，然后以锯齿形向下以覆盖整个板。获取钙瞬变后，使用荧光痕量分析软件分析数据。心球在播种后的第一天获得3D结构，可以培养长达六周。

大多数三周龄的心脏球体与α肌动蛋白和肌钙蛋白T表达规则的肌节组织.在零天和三周大的心脏球体中高水平的α肌动蛋白表明培养过程中具有恒定且高度纯的细胞组成。在球状体中观察到心脏基因、桥粒和线粒体的表达增加，而不是在 2D 中培养 90 天的 hiPSC-CM。心脏球体的跳动百分比在生成后的前三周相似，并且在第六周由于心脏球体恶化而显着下降。

与恶化相比，第三周的跳动率显着降低，并在第六周由于恶化而下降。钙瞬态参数表明第2周的峰值较高，而衰变90%时的上升时间、衰变时间和钙瞬态持续时间在第3周显著增加，表明hiPSC-CM衍生的球体在生成后第2周和第3周功能最佳。球体尺寸随着用于接种的细胞数量而增加。

在较大尺寸的旧球体中，跳动明显更高。与2.5k球体相比，5k、10k和20k球体显示出相似且显着更高的跳动率。冷冻保存不影响心球内的细胞活力。

在解冻和新鲜年龄匹配的球体中，肌瘤蛋白的相似表达表明冷冻保存效率。解冻或新鲜心球的跳动率没有显着变化。解冻或新鲜CS的上升时间、腐烂时间和CTD90均未观察到显著变化。除了疾病建模和高通量药物筛选外，这些球体还可用于细胞外囊泡产生的生物反应器和细胞外囊泡相关疗法。

此外，这些球状体的生物样本库可用作再生策略的新型心肌细胞供应。越来越多的证据表明，囊性纤维化、癌症和心球的患者来源干细胞模型的生物库在揭示药物筛选和个性化医疗的分子机制方面具有巨大潜力。