使用共聚焦显微镜测定活细胞中的线粒体形态

我们的研究重点是基础神经药理学。具体来说，我们研究药物分子的工作原理。我们旨在了解帕金森病中潜在药物化合物与线粒体功能之间的关系。

先前的研究回顾了长期存在的实验室细胞分析挑战，即使有制造商指南也是如此。为了解决这个问题，我们概述了评估实验室细胞中线粒体形态的详细分步方案。我们的协议使用简单的线粒体染色、荧光成像和开源软件。

这降低了成本，增加了可访问性，并且比电子显微镜等复杂的替代方案更易于使用。首先，获得在含有DMEM / F12的烧瓶中生长的SH-SY5Y细胞培养物，并补充有10%FBS。使用0.05%胰蛋白酶溶液分离细胞一分钟。

然后在传代前将细胞以100G离心三分钟。接下来，将SH-SY5Y细胞悬浮在补充有1%FBS的DMEM / F12培养基中。然后将细胞接种到带有玻璃底的共聚焦培养皿上并保持过夜。

对于MPP +刺激，用含有或不含1-甲基-4-苯基吡啶的新鲜培养基替换培养基24小时。对于 MitoTracker 染色，用预热的 DMEM/F12 培养基稀释 MitoTracker 储备溶液，以获得 50 纳摩尔工作浓度。在整个过程中保持染色液避光。

从共聚焦培养皿中取出培养基。用新鲜的DMEM / F12洗涤细胞两次。然后将一毫升 MitoTracker 工作溶液移液到培养皿中。

在黑暗中以 37 摄氏度孵育 15 分钟。现在取出 MitoTracker 工作溶液并用 DMEM/F12 洗碗两次。最后一次洗涤后，在每个培养皿中加入一毫升 DMEM/F12。

成像前在细胞培养箱中孵育。为了预平衡共聚焦显微镜进行成像，在采集面板下，通过设置激发和发射波长来调整光路参数。将针孔尺寸设置为 1.2 通风单位，像素扫描尺寸设置为 1024 x 1024，像素停留时间设置为 2.4 微秒，平均为 2。

现在，使用数值孔径为1.4的平面复消色差60X物镜使用卤素灯聚焦在细胞上，从而最大限度地减少光毒性。调整激光功率和高压略低于饱和水平。然后将缩放系数设置为三并捕获图像。

移动感兴趣区域以聚焦显微镜下的其他细胞。然后在不更改任何设置的情况下捕获图像。要在二进制转换和骨架化之前提高图像质量，请先打开图像。

使用 ROI 工具选择单个单元格的区域。现在，依次单击处理、滤镜、锐化蒙版功能以增强清晰度。然后使用过程并增强对比度以减少噪声放大。

单击进程、过滤器和中值选项以消除盐和胡椒噪音。要将图像转换为二进制，请单击“进程”，然后单击“二进制”，然后选择“制作二进制”选项。通过单击处理、二进制和镂空来对二进制图像进行骨架化。

然后通过选择分析对所有骨架像素进行分组，然后选择骨架和分析骨架 2D 3D 功能。通过使用 MiNA 工具计算骨架化图像中的九个描述性参数来简化分析。线粒体染色的荧光强度随着MitoTracker红色CMXRos浓度从25纳摩尔逐渐增加到200纳摩尔。

但在 200 纳摩尔处，观察到大量的细胞质背景染色。与PBS相比，在染色后一小时，DMEM/F12培养基中的线粒体形态保存得更好，尽管DMEM/F12也显示出更高的背景荧光。与单扫描模式相比，双帧平均显着提高了线粒体成像的信噪比。

将像素停留时间从 2.4 微秒增加到 10.8 微秒会导致图像更亮，但会导致光漂白。高压的增加会增强背景噪声，而激光功率的增加会导致光漂白。MiNA工具为暗淡和明亮的图像产生了一致的骨架化输出，表明在不同的荧光强度下具有稳健的分割能力，明亮的图像的强度是暗淡图像的5.5倍。

与未处理的对照相比，500微摩尔的MPP+处理破坏了SH-SY5Y细胞中的线粒体形态，导致线粒体足迹显着减少。