Name: 烟草中瞬时表达的蛋白作为一个案例研究：复杂系统采用的实验方法设计的表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 24 s
Description: 了解烟草叶片中瞬时蛋白表达的实验设计方法，通过农杆菌注射和参数优化建立预测模型。该技术可检测多因素交互作用，提高单克隆抗体和报告蛋白的产量，为植物生物制药提供高效解决方案。

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作者感谢 Thomas Rademacher 博士提供了 pPAM 植物表达载体，以及 Ibrahim Al Amedi 为本研究培育了所用的烟草植株。我们感谢 Richard M. Twyman 博士在稿件编辑方面提供的帮助。本工作部分由欧洲研究理事会高级资助项目“Future-Pharma”（项目编号 269110）和弗劳恩霍夫未来基金会（Fraunhofer&#160;Future Foundation）资助。

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</ol>

出版费用由美国 Statease, Inc. 公司和德国 Statcon 公司部分赞助，这两家公司未参与稿件的撰写，也不对稿件的任何内容负责。

每个实验都需要精心规划，因为资源通常稀缺且昂贵。这一点对于实验设计（DoE）策略尤为如此，因为在规划阶段出现的错误（例如 选择一个未涵盖所有重要因子交互作用的基础模型，会显著降低所得到模型的预测能力，从而降低整个实验的价值。然而，遵循基本的操作流程即可轻松避免此类错误。
实验设计规划期间的注意事项
首先，选择一个适合评估每次实验设计（DoE）运行结果（阳性或阴性）的响应变量至关重要。例如：通过紫外吸收测定的目标蛋白浓度 37 可用于评估特定启动子/5'非翻译区组合的活性。然而，对蛋白质的功能评估（例如。对于DsRed而言，可通过荧光检测；对于2G12，则可通过其与蛋白A的结合能力进行检测，此类方法更优，因其同时反映了蛋白质的质量特性。响应值也可由两个或多个独立参数计算得出，例如功率数 NP 在发酵实验中（根据输入功率、转速和搅拌器直径计算）。响应应产生高精度的数值（即 低标准差）和准确性（即 零或极少干扰参数）以提高模型质...

利用植物生产生物制药蛋白具有优势，因为植物种植成本低廉，该平台只需通过增加种植数量即可实现规模扩大，且人类病原体无法在植物中复制1,2。基于农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）侵染叶片等方法的瞬时表达策略可带来额外益处，因为从DNA递送到获得纯化产物的时间可从数年缩短至不到2个月3。瞬时表达还常用于功能分析，例如检测基因是否能够弥补功能缺失型突变体的表型，或研究蛋白质相互作用4-6。然而，瞬时表达水平的批次间变异通常大于转基因植物中的表达水平7-9。这会降低基于瞬时表达的生物制药生产工艺在现行药品生产质量管理规范（GMP）下获得批准的可能性，因为可重复性是一项关键质量属性，需接受风险评估10。此类变异还可能掩盖研究人员拟研究的任何相互作用。因此，我们着手鉴定影响植物中瞬时表达水平的主要因素，并构建一个高质量的定量预测模型。
一次只改变一个因素（OFAT）的方法常被用于表征影响（效应) 某些参数的因素) 对结果的影响（反应实验的） 11。但这种方法并不理想，因为各个检测（运行) 在调查期间实验将通过所测试因素构成的潜在作用范围，像串珠一样对齐排列（设计空间）。如图所示，实验设计空间的覆盖范围较低，因此从实验中获得的信息量也较少。 图1A 12此外，不同因素之间的相互依赖性（因素相互作用) 可能会隐藏，导致模型效果不佳和/或预测出虚假的最优值，如图所示 图1B 13.
通过采用实验设计（DoE）方法，可以避免上述缺点，该方法使实验运行在设计空间内更均匀地分布，这意味着在两次运行之间可以同时改变多个因素14。针对混合物、因素筛选（因子设计）以及因素对响应影响的定量分析（响应面方法，RSM）已有专门的设计15。此外，RSM 可以通过中心复合设计实现，也可以借助专用软件有效实现，此类软件可根据不同标准选择实验运行点。例如，所谓的 D-最优性标准会选择使最终模型系数误差最小的实验运行，而 IV-最优性标准则选择在整个设计空间内预测方差最低的实验运行15,16。本文所述的 RSM 方法可用于精确量化植物中瞬时蛋白表达，也可轻松推广至任何涉及多个（约 5–8 个）数值型因素（例如 温度、时间、浓度）和少量（约 2–4 个）类别型因素（例如 启动子、颜色）且缺乏机制性描述或机制过于复杂而难以建模的系统。
实验设计（DoE）方法起源于农业科学，但由于其可推广至任何需要减少实验次数以获得可靠数据并为复杂过程建立描述性模型的场景，现已扩展到其他领域。这也促使实验设计（DoE）被纳入由人用药品注册技术要求国际协调会议（ICH）发布的《工业指南 Q8(R2) 药物开发》17。目前，DoE 已在科学研究和工业界得到广泛应用18。然而，在实验的规划与实施过程中必须谨慎，因为为多元线性回归模型（基础模型）选择不合适的多项式阶数可能导致需要额外的实验运行次数，才能正确建模所有因素效应。此外，数据的损坏或缺失会产生错误的模型和有缺陷的预测结果，甚至可能如本方案与讨论部分所述，导致无法进行任何模型构建18。在本方案部分，我们将首先阐述基于响应面法（RSM）实验最重要的规划步骤，然后以 DoE 软件 DesignExpert v8.1 为例说明实验设计的构建过程。但使用其他软件（如 JMP、Modde 和 STATISTICA）也可构建类似的设计。实验步骤之后将提供数据分析与评估的操作说明。
<img alt="主成分分析和响应面图，因素 A、B、C；多变量分析，统计模型" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51216/51216fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51216/51216fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. OFAT 与 DoE 方法的比较。 A. 在实验中依次每次改变一个因素（OFAT）（黑色、红色和蓝色圆圈）对设计空间的覆盖范围较低（阴影区域）。相比之下，采用实验设计（DoE）策略同时改变多个因素（绿色圆圈）可提高覆盖范围，从而提升所得模型的精确性。B. 由于设计空间覆盖存在偏差，OFAT 实验（黑色圆圈）可能无法识别最优操作区域（红色），并预测出次优解（大黑色圆圈）；而 DoE 策略（黑色星号）更有可能识别出更优条件（大黑色星号）。

<table><tbody><tr><td>Design-Expert(R) 8</td><td>Stat-Ease, Inc.</td><td>n.a.</td><td>实验设计软件</td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>8952.2</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>2363.2</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P029.2</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>K029.2</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>5210.2</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>&lt;i&gt;Escherichia coli&lt;/i&gt; K12 DH5a</td><td>Life Technologies</td><td>18263-012</td><td>微生物</td></tr><tr><td>pPAM</td><td>GenBank</td><td>AY027531</td><td>克隆/表达载体；&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NucleoSpin Plasmid&amp;nbsp;</td><td>MACHEREY-NAGEL GmbH</td><td>740588.250</td><td>质粒DNA提取试剂盒</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td><td>MACHEREY-NAGEL GmbH</td><td>740609.250</td><td>质粒DNA纯化试剂盒</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>n.a.</td><td>分光光度计</td></tr><tr><td>NcoI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R3193L</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R3101L</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>AscI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0558L</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>NEB 4</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>B7004S</td><td>限制性内切酶缓冲液</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4855.3</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>四硼酸钠</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4403.3</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>8040.2</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6352.4</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>A512.1</td><td>显色指示剂</td></tr><tr><td>二甲苯青</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>A513.1</td><td>显色指示剂</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>7530.2</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT Cell</td><td>BioRad</td><td>170-4406</td><td>凝胶电泳槽</td></tr><tr><td>&lt;i&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/i&gt; 菌株 GV3101:pMP90RK</td><td>DSMZ</td><td>12365</td><td>微生物</td></tr><tr><td>Electroporator 2510</td><td>Eppendorf</td><td>4307000.658</td><td>电穿孔仪</td></tr><tr><td>牛肉提取物</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>X975.2</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>2365.2</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4621.2</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>0261.3</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>羧苄青霉素</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6344.2</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>T832.3</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>利福平</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4163.2</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>FWD 引物</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td>n.a.</td><td>CCT CAG GAA GAG CAA TAC</td></tr><tr><td>REV 引物</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td>n.a.</td><td>CCA AAG CGA GTA CAC AAC</td></tr><tr><td>2720 热循环仪</td><td>Applied Biosystems</td><td>4359659</td><td>PCR仪</td></tr><tr><td>RNAfold 网络服务器</td><td>维也纳大学</td><td>n.a.</td><td>软件</td></tr><tr><td>Ferty 2 Mega</td><td>Kammlott</td><td>5.220072</td><td>肥料</td></tr><tr><td>Grodan 岩棉块 10×10 cm</td><td>Grodan</td><td>n.a.</td><td>岩棉块</td></tr><tr><td>温室</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td>用于植物培养</td></tr><tr><td>植物生长室</td><td>Ilka Zell</td><td>n.a.</td><td>用于植物培养</td></tr><tr><td>Omnifix-F Solo</td><td>B. Braun</td><td>6064204</td><td>注射器</td></tr><tr><td>Murashige 和 Skoog 盐</td><td>Duchefa</td><td>M 0222.0010</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6780.2</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>乙酰丁香酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406-5G</td><td>植物激素类似物</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;BioPhotometer plus</td><td>Eppendorf</td><td>6132 000.008</td><td>光度计</td></tr><tr><td>Osram 冷白光 36 W</td><td>Osram</td><td>4930440</td><td>光源</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4984.3</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>Centrifuge 5415D</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td>离心机</td></tr><tr><td>Forma -86°C 超低温冰箱</td><td>ThermoFisher</td><td>88400</td><td>冰箱</td></tr><tr><td>Synergy HT</td><td>BioTek</td><td>SIAFRT</td><td>荧光酶标仪</td></tr><tr><td>Biacore T200</td><td>GE Healthcare</td><td>n.a.</td><td>表面等离子共振仪</td></tr><tr><td>蛋白A</td><td>Life Technologies</td><td>10-1006</td><td>抗体结合蛋白</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9105.3</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9127.3</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>2G12 抗体</td><td>Polymun</td><td>AB002</td><td>参考抗体</td></tr></tbody></table>

利用实验设计方法表征复杂系统：以烟草中瞬时蛋白表达为例

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

植物在生物制药生产方面具有多种优势，包括成本低、可扩展性强以及安全性高。瞬时表达还具有研发和生产周期短的额外优点，但不同批次间的表达水平可能存在显著差异，从而在良好生产规范（GMP）背景下引发监管方面的关注。我们采用实验设计（DoE）方法，评估了表达载体中的调控元件、植物生长与发育参数以及表达期间的孵育条件等主要因素对批次间表达变异性的影响。我们测试了表达一种模型抗HIV单克隆抗体（2G12）和一种荧光标记蛋白（DsRed）的植物。我们讨论了选择该模型特定特性的依据，并指出了其潜在局限性。该通用方法可轻松推广至其他问题，因为该模型的原则具有广泛适用性：基于知识的参数选择、通过将初始问题分解为较小模块以降低复杂性、由软件指导设置最优实验组合以及逐步优化实验设计。因此，该方法不仅适用于植物中蛋白表达的表征，也适用于缺乏机制性描述的其他复杂系统的研究。所建立的描述参数间相互关联性的预测方程可用于构建其他复杂系统的机制模型。

利用不同启动子和5'非翻译区进行瞬时表达过程中DsRed积累的描述性模型
采用叶片提取物中的DsRed荧光来指示重组蛋白的表达水平，因此在实验设计（DoE）策略中将其作为响应值。我们认为具有实际意义的最小可检测差异为20 μg/ml，系统估计的标准差根据初步实验结果为8 μg/ml。瞬时表达模型中所包含的因素是基于文献数据7,8以及我们先前的研究结果9选定的，所考察的因素范围也依据这些数据确定（表1）。对于所有离散的数值型因素，均至少选择三个水平，以便建立二次基础模型。在选择DoE实验运行方案时，采用D-最优选择算法，以获得回归模型系数的最精确估计。DesignExpert软件最初建议的设计包含90次运行，但其FDS不足以实现1%的预测标准误差（图3A）。通过D-最优增补设计，将总运行次数增加至210次，解决了这一问题，使FDS达到100%，且在整个设计空间内预测准确性的分布更加均匀，表现为曲线平坦（图3B</strong...

我们介绍一种实验设计方法，可用于确定并建模转基因调控元件、植物生长与发育参数以及培养条件对植物中单克隆抗体和报告蛋白瞬时表达的影响。

植物为生物制药的生产提供了多种优势，包括成本低、可扩展性强和安全性高。瞬时表达技术提供了……

以下实验的总体目标是建立植物叶片中蛋白质瞬时表达的预测模型。通过设计实验，确定影响瞬时表达的最关键参数，并量化其对蛋白质积累的影响。第二步是将基因克隆并转入农杆菌中，随后将农杆菌注入叶片，从而实现蛋白质的瞬时表达。接下来分析叶片样品，以确定蛋白质表达水平。通过实验设计模型评估，获得不同叶龄叶片在不同孵育条件下瞬时蛋白质表达水平的变化模式。与传统的单因素试验等现有方法相比，该技术的主要优势在于能够检测并量化不同参数（如叶片年龄或着生位置）之间的相互作用。通常用于表征某些因素对实验结果影响的“一次只改变一个因素”方法并不理想，因为实验过程中的各个运行如同串在一条线上的珍珠，导致实验设计空间的覆盖范围较低。相比之下，实验设计（DOE）策略中同时改变多个因素，能够增强对设计空间的覆盖，从而提高所建立模型的精确性。此外，“一次只改变一个因素”的方法会导致设计空间覆盖存在偏差。实验可能无法识别出最佳操作区域并预测出次优解，而实验设计（DOE）策略则更有可能确定出更优的条件。此流程图说明了规划 DOE 策略的过程。第一步是确定设计中需包含的相关因素和响应指标。在此演示中，将基于先前的实验测定一种模型抗 HIV 单克隆抗体 two G 12 和一种荧光标记蛋白 DS red 的表达水平。被视为具有显著意义的最小可检测差异，two G 12 为 10 微克/毫升，DS red 为 20 微克/毫升。此外，two G 12 和 DS red 系统估计标准差的近似值分别为 4 微克/毫升和 8 微克/毫升。本实验设计（DOE）策略的其余规划步骤此处不再讨论，详细信息可参见随附的手稿。两种G 12和DS红色蛋白将在烟草植物中进行瞬时表达。开始植物培养实验前，准备10厘米×10厘米×8厘米的岩棉块，并用去离子水充分冲洗，以去除残留化学物质。随后，将新配制的肥料溶液加入各岩棉块中进行平衡处理，在每块岩棉上放置一至两粒烟草种子，再用肥料溶液短暂冲洗。注意避免将种子冲走，在温室中适宜条件下培养烟草植株，使其萌发并生长42天。通过将培养物生长至600纳米处的OD值为5.0来制备AUM FASS。用清水和两倍的侵染培养基稀释菌液，使其在注射前达到所需注射浓度的OD 600纳米值。注射前确认Atum Fasion悬浮液的OD 600纳米值，以准备进行叶片注射。用移液器吸头轻轻刮擦注射位点的表皮，以促进AUM Fasion溶液的渗入。操作时避免刺破叶片。将装有AUM悬浮液的注射器垂直于叶片，筒身轻触待处理的叶脉间区域，轻轻将出口端推至叶片底面。同时，轻压叶片上表面，防止叶片移位或破裂。轻轻下压注射器活塞，AUM 配方溶液将进入叶片的细胞间隙，处理区域会呈现较深的绿色并显得湿润。注射过程中应确保注射器始终保持与叶片垂直。否则，细菌悬液可能在高压下喷出。在多个位置重复此操作，直至整个叶间区域均被aum

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

烟草中瞬时表达的蛋白作为一个案例研究：复杂系统采用的实验方法设计的表征

来源：Rufián, J. S., 等．植物组织内丁香假单胞菌基因表达的单细胞分析．J. Vis. Exp.

从植物中提取的病原体的单细胞基因表达分析

植物提供了一种新颖的系统，可用于大规模商业化生产药用蛋白，相较于现有的表达模式，该系统更具可扩展性、成本效益更高且更安全。在本研究中，我们报道了一种简单便捷且可扩展的方法，将含有目的基因的根癌农杆菌（Agrobacterium...

高效农杆菌浸润法实现植物中重组蛋白的高水平瞬时表达

本研究介绍了一种利用BioRad基因枪检测的植物亚细胞器选择性靶向新方法。...

利用Gibson组装和基因枪在烟草中进行瞬时基因表达

关键词：瞬时表达，烟草，Gibson组装，基因枪，植物转化，分子克隆，重组DNA技术

利用双分子荧光互补技术在烟草原生质体和叶片中可视化蛋白质-蛋白质相互作用

利用瞬时表达系统，以烟草植物生产了一种真菌纤维素酶...

在烟草植物中表达来自Trichoderma reesei的重组纤维素酶Cel5A

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不同生物反应器中重组蛋白表达的比较分析：细菌、昆虫细胞与植物系统

在亚细胞水平上，信号事件受到发育和环境线索的动态调控。本文介绍了一种利用烟草瞬时表达系统监测蛋白质-蛋白质动态相互作用，并揭示植物细胞中信号转导空间组织的实验方案。...

利用烟草瞬时表达系统成像MAPK信号通路的空间重排

本文描述了一种高通量、自动化的烟草原生质体生产和转化方法。该机器人系统能够在模式BY-2体系中实现大规模平行的基因表达与功能研究，且该技术有望拓展应用于非模式作物。...

一种用于高通量原生质体分离与转化的机器人平台

通过异源表达系统研究离子通道已成为生物医学研究中的一项核心技术。在本论文中，我们介绍一种高效的时间控制方法，通过在可诱导启动子调控下进行瞬时转染，实现对离子通道表达的精确调控。...

通过可诱导瞬时转染实现离子通道表达的可控调控

本文描述了一种基于荧光素酶活性测定的、用于确定蛋白质-蛋白质相互作用的简便快速实验方法。...

Nicotiana benthamiana 叶片中用于瞬时测定蛋白质-蛋白质相互作用动态的荧光素酶互补成像分析

在Nicotiana benthamiana叶片中进行三萜类化合物制备规模的瞬时表达

了解烟草叶片中瞬时蛋白表达的实验设计方法，通过农杆菌注射和参数优化建立预测模型。该技术可检测多因素交互作用，提高单克隆抗体和报告蛋白的产量，为植物生物制药提供高效解决方案。

利用实验设计方法表征复杂系统：以烟草中瞬时蛋白表达为例

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