烟草中瞬时表达的蛋白作为一个案例研究：复杂系统采用的实验方法设计的表征

以下实验的总体目标是为植物叶片中蛋白质的瞬时表达生成预测模型。这是通过设置实验设计来确定瞬时表达的最重要参数并量化它们对蛋白质积累的影响来实现的。作为第二步，基因被克隆并转移到农业细菌中，然后被注射到叶子中，导致瞬时蛋白质表达。

接下来分析叶子样品以确定蛋白质表达水平。根据实验模型评估的设计，获得的结果显示了不同年龄和不同孵化条件下叶片中瞬时蛋白表达水平的模式。与现有方法（一次一个因素）相比，该技术的主要优点是可以检测和量化不同参数（如叶龄或位置叶）之间的相互作用。

通常用于描述某些因素对实验结果的影响的一次单因子方法是次优的，因为实验期间的单个运行将像串上的珍珠一样对齐，从而实现设计空间的低覆盖率。与 DOE 策略的实验设计相比，一次变化多个因子可以提高覆盖率，从而提高结果模型的精度。此外，偏置设计空间一次覆盖一个因素。

实验也可能无法确定最佳作区域并预测次优解决方案，而 DOE 策略更有可能确定更可取的条件。此流程图说明了规划 A DOE 策略的过程。第一步是确定要包含在设计中的相关因素和响应。

在这个演示中，模型抗 HIV 单克隆抗体两个 G 12 和一个荧光标记物、蛋白 DS red 的表达水平将根据以前的实验进行测量。被认为相关的最小可检测差异为两个 G 12 每毫升 10 微克，DS red 每毫升 20 微克。此外，两种 G 12 和 DS red 的系统估计标准差的近似值分别为 4 μg 和 8 μg/mL。

此处不讨论规划此 DOE 策略的其余步骤，但详细信息可在随附的手稿中找到。两个 G 12 和 DS 红将在烟草植株中瞬时表达。要开始植物培养程序，请准备 10 x 10 x 8 厘米的岩壁块，用去离子水充分闪蒸以去除残留的化学物质。

之后，在每个岩壁块上放置一到两颗烟草种子，然后用肥料短暂冲洗，用新鲜制备的肥料种子烟草植物溶液平衡块。小心避免将种子冲走，发芽并在适当条件下在温室中种植烟草植物 42 天。通过将培养物培养至 OD 600 纳米为 5.0 来制备 AUM FASS。

前用水和两倍浸润介质稀释培养物，以匹配注射所需的 OD 600 纳米。确认 fasion 悬浮液的 atum 的 OD 600 纳米，以准备注射叶子。用移液器吸头轻轻刮擦注射部位的表皮，以促进 AUM Fasion 溶液的流入。

这样做时避免破坏叶片。垂直于叶片握住含有 AUM fasion 悬浮液的注射器，将桶接触待处理的肋间区，轻轻地将出口推到叶子的底部。同时，轻轻按压叶片的顶部，以防止叶片移位或破裂。

轻轻向下推注射器活塞。AUM 时尚解决方案将进入叶片内的细胞间隙，如处理区域看起来更暗、绿色和潮湿所示。确保注射器在注射过程中保持垂直于叶片。

否则，细菌悬浮液可能会在高压下喷出。在几个位置重复此过程，直到整个肋间区被 aum、aum、fass 浸润。然后注射后继续下一个肋间区，孵育期完成后在 DOE 确定的条件下孵育植物。

开始采样。用手持式纸巾稳定叶子，并使用软木借用器在 DOE 指示的位置和时间从处理过的肋间区中取出四到五个叶盘。取样过程中不要从植物中取出整片叶子。

确定每个样品的质量，并将其置于标有样品名称和质量的 1.5 mL 塑料反应管中。在蛋白质定量之前，将样品储存在负 20 摄氏度或负 80 摄氏度。该过程在此阶段可以暂停数月，具体取决于样品稳定性和储存温度，以便从叶盘样品中提取蛋白质。

每毫克样品质量添加 3 毫升提取缓冲液，并使用电杵在反应管中研磨叶盘，直到没有大碎片残留。为避免样品过热，离心后只要试管感觉温暖，就将试管放在冰上。为了去除分散的固体，将上清液转移到干净的 1.5 mm 反应管中。

依次测量 DS red 荧光两次。在 96 个发挥良好的读数器中，每个样品配备 530 个 25 纳米激发和 590 个 35 纳米发射滤光片。对两个读数和三个技术重复的荧光进行平均，并减去为含有 0 μg/mL DS red 的空白对照记录的值。

此外，从标准稀释液的簧片中减去该值，并将这些空白校正值用于线性回归，从而产生参考曲线。然后使用参考曲线的斜率将样品测得的荧光转换为 DS 红浓度。此处不显示测定两种 G 12 抗体浓度的程序，但在随附的手稿中有详细说明。

Design Expert 软件用于分析节点中的数据分析和评估。选择要分析的响应，然后最初在 transformation （转换） 选项卡中选择 none。继续阅读 拟合汇总 选项卡，该选项卡提供有关对所调查系统很重要的因子的一般信息。

软件将根据 Model （模型） 选项卡中的显著性建议初始模型。根据拟合汇总结果预先选择初始模型。使用自动模式在 Innova 选项卡中编辑此模型。

如有必要，请调查建议的模型和包含的因素。通过切换回模型选项卡，将选择更改为手动并从模型中消除适当的因子，手动删除 P 值高于预定义阈值的任何因子或基于机械考虑不太可能的因子。继续转到 diagnostics 选项卡以确认模型的质量，并检测数据集中对模型有很大影响的潜在异常值。

通过检查诊断工具中的所有选项卡，调整相应选项卡中的转换类型（如果框 Cox 图建议），然后在模型图形选项卡中重新启动分析过程。可视化有限数量的数值因子（如三个）的评估模型。响应面表示法可用于评估最佳特征。

手动响应曲面仅说明两个因素对所调查响应的影响。通过在因子工具窗口中更改响应的值或水平来显示任何其他因子对响应的影响。或者，可以通过在因子工具窗口中右键单击因子并选择所需的自变量轴，将因子分配给绘图轴。

使用因子工具作因子水平并将其分配给图形坐标。使用 file （文件） 选项卡中的 export graph to file （导出图形到文件） 命令导出图形。使用优化 节点中的数值子节点，根据模型因子对所需的响应进行数值优化，然后可以通过 criteria 选项卡应用某些约束。

根据 criteria 选项卡中提供的输入，在 Solutions 选项卡中计算和检查数值解。将这些解导出到其他软件（如电子表格）中，以便进一步分析，揭示与高响应值或低响应值相关的因子设置。如果调查了三个以上的数字因子，这将很有帮助，并且在这项代表性研究中很难进行 3D 表示。

DOE 策略用于检查不同启动子和 5 个引物 RS 对 ds 瞬时表达的影响。此表显示了瞬态表达模型中包含的红色因子和研究的范围。粗体显示的因子是此试验所特有的。

斜体字中的因子用于稍后将介绍的另一个实验。为所有离散的数值因子至少选择了三个水平，以允许计算二次基模型。选择最优选择算法来选择 DOE 运行，以获得回归模型系数的最准确估计值。

设计专家最初建议的设计包括 90 次游程，但 FDS 不足以实现 1% 的标准预测误差。将设计优化增强为总共 210 次运行解决了这个问题，并导致 FDS 为 100%，在平坦曲线所示的设计空间中具有更均匀的预测精度，确定了所有 210 次运行的 DS 红浓度，并对数据进行了对数 10 转换。模型因子是通过从 alpha 水平为 0.100 的三次模型中自动向后选择来选择的。

这导致一个显著的模型，其中不显著的失拟，而多重相关系数的值很高。所有模型因子的 P 值均小于 0.05，因此不需要进一步手动作模型。该模型包含三个因子交互作用，以粗体突出显示，它们不是 FDS 图的初始二次基模型重新计算的一部分。

使用最终预测模型中包含的所有因素表明，预测标准误差的 FDS 并未因包括额外的三个因素交互作用而显着减少。design expert 中的模型质量诊断工具表明，数据转换很有用，并且模型中没有缺失因子，因为残差的正态图显示线性行为，并且在残差与预测图中没有观察到特定模式。在整个实验过程中也没有趋势表明隐藏的时间因变量。

相反，模型预测与观察到的 Diaz 红色荧光非常一致，因为所有点都靠近对角线。因此，假设所选模型可用于预测在持续 8 天的浸润后潜伏期内由不同启动子 5 个引物 UTR 组合衍生的非铅蛋白烟叶中 DS red 的瞬时表达，并且还选择了没有数据转换的人工线性回归模型来说明错误的因子选择和转化的后果。如此处清楚地看到，残差的正态图偏离了预期的线性行为，并且残差与预测图中存在 V 形模式，而不是随机散点。

此外，残差与游程图突出显示了两个极值。虽然偏离对角线的小值和高值的预测都很差，但此处显示了烟草叶中瞬时 DS red 表达的最佳模型响应面。该模型预测叶龄是一个重要因素，在老叶中表达水平较低，例如，与幼叶相比，图 A 和图 B 中的叶 2 与幼叶相比，图 C 和图 D 中的 6 叶

与 CAMV 35 SS 启动子的组合相比，与 NOS 启动子的组合相比，5 种主要 UTR 组合的 DS red 表达更强。尽管 TL 和 CHS 之间的比较表明，五个引物 UTR 对 DS 右表达也有显着影响，但表达强度取决于伴随的启动子。预测模型还表明，某些启动子 5 主要 UTR 组合对，例如 nas CHS 和 CAMV 35 SS CHS，导致所有叶子的平衡表达水平与定义比例相差不到 30%，孵育时间大于两天。

这种平衡的表达对于具有确定化学计量的多聚体蛋白的表达很有用。DOE 方法还用于优化孵化条件和收获方案，以便在烟草中同时生产两种 G 12 和 DS red。本实验中包括的影响瞬时表达的因素是斜体字od 600 纳米和孵育时间。

建立了不同年龄植物中每种蛋白表达的预测模型。幼叶在播种后 40 天收获，老叶在播种后 47 天收获。然后对这四个模型进行评估，并建立了一个共识模型，其中包括在单个模型中发现的显著性每个因素。

随后证实，共识模型仍然很好地代表了所有初始数据集。随后使用共有模型来确定两种蛋白质的最佳孵育温度和细菌 OD 600 纳米，以预测年轻和老年植物所有叶子和叶子位置的蛋白质浓度。然后将浓度曲线与生物量数据整合，得出绝对蛋白质产量。

然后将绝对蛋白质量与相关的下游成本相关联，从而可以对每个植株年龄的每片叶子的加工进行成本效益分析。与老植株相比，在幼苗中发现相同数量的 DS 红和大约 65% 的两个 G 12，尽管平均生物量低约 50%，这反映了幼苗中较高的特异性蛋白表达。这表明年轻植物有利于瞬时表达，因为尽管与老植物相比，总生物量较低，但蛋白质在较短的生长期内达到更高的浓度。

最后，还发现，处理老植物的所有叶子比丢弃一到三叶并增加每批植物的数量更昂贵。因此，基于 DOE 的模型不仅适用于标记实验的最后一步，还适用于与其他数据相结合，以促进过程分析的更复杂方面。观看此视频后，您应该对如何设置、实施和分析 A DOE 以研究植物中的瞬时蛋白表达有很好的了解。