Name: 使用靶标富集工作流程从临床样本中生成全细菌基因组 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 了解靶标富集测序技术用于从临床样本中生成细菌全基因组的方法。该技术可克服人源DNA干扰和低细菌载量问题，实现Chlamydia trachomatis等病原体的完整基因组回收，为分子诊断和流行病学监测提供关键信息。

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我们诚挚感谢所有为本项目做出贡献的人员。来自苏黎世大学的Fanny Wegner博士、Srinithi Purushothaman、Frank Imkamp博士、Tim Roloff博士、Dominique Braun博士以及Adrian Egli教授，他们在该技术的开发与优化过程中提供了重要支持。我们特别感谢Daniel Gander、Valéria Pires、Arianita Asani和Stefan Antener在测序工作中提供的出色技术支持。来自布宜诺斯艾利斯大学的Andrea Carolina Entrocassi博士、María Lucía Gallo Vaulet博士、Deysi López Aquino博士、Laura Svidler López博士以及Luciana La Rosa博士也作出了宝贵贡献，谨此致谢。最后，我们感谢来自安捷伦（Agilent）的Ibrahim Kisakesen博士和Andreas Schreiber博士提供的支持。本研究得到了Gottfried und Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung基金会STIDirect项目的资助，以及苏黎世大学科学基金会（Stiftung für wissenschaftliche Forschung an der Universität Zürich）STISeq项目（编号STWF-24-009）的资助。此外，研究还获得了苏黎世大学提供的非限制性资金支持。

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<li>Edmondson, D. G., Norris, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cultivation+of+the+syphilis+spirochete+Treponema+pallidum%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro cultivation of the syphilis spirochete Treponema pallidum.</a> Curr Protoc. 1 (2), e44(2021).</li>
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<li>Büttner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+methods+for+genome+sequencing+of+Chlamydia+trachomatis+and+other+sexually+transmitted+bacteria+directly+from+clinical+swabs%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Genom%22%5BJournal%5D)">Evaluating methods for genome sequencing of Chlamydia trachomatis and other sexually transmitted bacteria directly from clinical swabs.</a> Microb Genom. 11 (2), 001353(2025).</li>
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<li>SureSelect XT HS2 DNA kits: library preparation (+/-MBC) / fast-Hyb target enrichment / post-capture pooling workflow for Illumina platform NGS. , Agilent Technologies. 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G9983-90000.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G9983-90000.pdf</a> (2023).</li>
<li>Büttner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+genomes+from+rectal+samples%3A+description+of+a+new+clade+comprising+ompA-genotype+L4+from+Argentina%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Genom%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis genomes from rectal samples: description of a new clade comprising ompA-genotype L4 from Argentina.</a> Microb Genom. 11 (2), 001350(2025).</li>
<li>Brown, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+whole-genome+sequencing+by+SureSelect+target+enrichment%3A+a+robust+and+sensitive+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Norovirus whole-genome sequencing by SureSelect target enrichment: a robust and sensitive method.</a> J Clin Microbiol. 54 (10), 2530-2537 (2016).</li>
<li>Dao, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+SureSelect+target+enrichment+system+for+next-generation+sequencing+to+obtain+the+complete+genome+sequence+of+bovine+leukemia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Application of the SureSelect target enrichment system for next-generation sequencing to obtain the complete genome sequence of bovine leukemia virus.</a> Arch Virol. 163 (11), 3155-3159 (2018).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SureSelect+targeted+enrichment%2C+a+new+cost+effective+method+for+the+whole+genome+sequencing+of+Candidatus+Liberibacterasiaticus%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">SureSelect targeted enrichment, a new cost effective method for the whole genome sequencing of Candidatus Liberibacterasiaticus.</a> Sci Rep. 9 (1), 1-8 (2019).</li>
<li>Büttner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ompA+sequencing+and+multilocus+sequence+typing+of+lymphogranuloma+venereum+cases+in+Buenos+Aires+reveal+new+Chlamydia+trachomatis+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">ompA sequencing and multilocus sequence typing of lymphogranuloma venereum cases in Buenos Aires reveal new Chlamydia trachomatis genotypes.</a> Microorganisms. 12 (3), 587(2024).</li>
<li>La Rosa, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+anorectal+infections+by+LGV+%28L1%2C+L2+and+L2b%29+and+non-LGV+serotypes+in+symptomatic+patients+in+Buenos+Aires+Argentina%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+STD+AIDS%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis anorectal infections by LGV (L1, L2 and L2b) and non-LGV serotypes in symptomatic patients in Buenos Aires Argentina.</a> Int J STD AIDS. 32 (14), 1270-1278 (2021).</li>
<li>Rodríguez Fermepin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+L2b+in+rectal+lymphogranuloma+venereum%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Microbe%22%5BJournal%5D)">More than L2b in rectal lymphogranuloma venereum.</a> Lancet Microbe. 2 (2), e55(2021).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

从临床样本中获取完整的细菌基因组数据具有较大挑战性。然而，我们需要这些数据来了解流行克隆株并研究抗菌药物耐药性特征，尤其是在难以培养的苛养菌中。使用牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technologies）进行深度测序或自适应测序等替代方法，均无法获得用于全基因组序列分析的足够数据。对于性传播感染（STI）样本等情况，靶向富集是获取完整基因组的最佳技术，且该方法可应用于一系列细菌性STI病原体。尽管该方法成本较高，但其所能提供的结果是其他任何方法都无法实现的10。
应仔细选择合适的样本，最好能够回答诊断和研究中的相关且重要的问题。收集样本所用的保存液并非起决定性作用，使用2-SP和NAAT保存液均能成功获得测序结果。样本储存至关重要，目的是保持DNA的完整性。其中最重要的因素是诊断载量，理想情况下Ct值应低于Ct30。对于Ct值超过30的样本，全基因组测序成功的可能性较低，但在某些情况下，仍可能获得具有参考价值的部分序列数据。
该流程并非易事，涉及多个步骤，包括PCR循环、杂交以及多次磁珠洗涤。为获得最佳结果，必须严格遵循操作规程。本方案的关键步骤——DNA片段化、与捕获探针的杂交，以及基于磁珠的捕获与洗涤——需要谨慎操作并妥善处理。研究人员和技术人员经过数次尝试后即可掌握该方案。在初期学习阶段，耗时3天的方案具有一定优势；而对于经验更丰富的操作者，可采用2天方案以加快实验进程。由于试剂成本较高，建议在不使用昂贵组分（例如探针）的情况下先进行一次测试运行，以节约成本。&#160;对于不同的捕获探针组合，可调整杂交温度，以提高富集的灵敏度或特异性。若产生的数据量充足且观察到较高比例的PCR重复序列，则也可调整捕获前和捕获后的PCR循环次数。
这些实验获得的数据可用于分型，从中可提取MLST及其他相关靶标。还可在全球或局部范围内进行流行病学分析，与相关基因组进行比较，以获得当前的深入认识。全基因组的重组和移动元件分析还能推断随时间推移及在选择压力下的变化，以及可能的共感染情况。在具备充足数据及相关元数据的情况下，可进行时间推算，推断特定特征和谱系的祖先，以及可能的传播途径和机制。这些对重要病原菌类群认知的进展，可为公共卫生策略提供依据。我们的实验方案及代表性结果展示了综合征检测面板靶向探针组的应用，该方法在细菌性性传播感染样本中有效，且可扩展至其他类型的样本。

新一代测序（NGS）技术的出现促进了细菌全基因组测序（WGS）的发展，使得多种人类细菌病原体的临床分离株得以进行测序。该技术通过以前所未有的规模生成完整的基因组，推动了大量比较研究的开展。这对临床和公共卫生微生物学产生了重大影响，因为通过WGS从临床样本中获取基因组数据，能够实现菌株分型以及抗菌药物耐药基因的检测。此外，宏基因组学方法可直接从临床样本中检测与疾病相关的病原体。此类信息为患者个体化治疗策略的制定创造了新的机遇。同时，WGS也是一种强大的工具，可揭示特定病原体流行菌株的进化过程及其传播模式，从而帮助公共卫生机构更深入地理解并更有效地应对病原体暴发事件1,2,3。
为了获得全基因组测序（WGS）所需的足够测序质量，通常需要通过培养进行细菌分离，以获取足够的微生物DNA量4,5,6。这对于难以培养的微生物、因诊断样本处理导致失活而无法培养的微生物，或在患者治疗过程中暴露于抗生素的微生物而言，构成了一个限制因素。此类难以培养的微生物包括性传播细菌病原体，例如 Chlamydia trachomatis、Neisseria gonorrhoeae、Treponema pallidum 和 Mycoplasma genitalium7,8,9。这些物种由于多种因素而难以培养，包括其胞内寄生特性、脆弱性、苛刻的生长需求以及缓慢的复制速率。因此，开发并实施能够在DNA含量较低（如临床样本中常见情况）条件下仍可进行WGS的技术，对于在临床环境中开展基因组分析至关重要。
当微生物DNA含量稀少时，靶向富集是基因组测序最具前景的方法10。例如，在引起性传播感染（STIs）的病原体中，患者样本中仅有极小部分DNA来源于病原体。以沙眼衣原体（C. trachomatis）感染为例，病原体DNA最多仅占总DNA的0.6%，而通常情况下的比例更低11。靶向富集方法的核心是在进行高通量测序（NGS）之前，选择性地捕获目标微生物DNA。该过程通过使用特异性设计的、带有生物素标记的RNA探针实现，这些探针与目标微生物DNA序列互补。在杂交前，首先进行接头连接以构建基因组文库，随后这些探针与互补的微生物DNA结合。接着，利用链霉亲和素包被的磁珠捕获带有生物素标记的核酸复合物，利用的是生物素与链霉亲和素之间的强相互作用。最后，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增所选中的DNA片段。上述关键步骤是理解靶向富集策略的基础。然而，完整实验流程还包括洗涤和质量控制等其他操作步骤10,12。
在启动测序流程之前，评估输入DNA的量并确保整个操作流程中维持其完整性至关重要。根据制造商的建议，标准方案要求在7 µL体积中含有10–200 ng的DNA，对应的浓度范围约为1.4至28.6 ng/µL。当DNA浓度较低时，建议采用使用17 µL体积的改良方案，可在保持所需输入量的前提下，适应0.6至11.8 ng/µL的浓度范围12。鉴于临床样本中常获得较低的DNA浓度，我们常规采用17 µL的方案变体。杂交与测序表现与DNA质量相关，因此强调了适当的样本储存和运输条件对维持核酸完整性的关键作用。因此，采用稳定化采样介质、快速处理、维持冷链条件以及尽量减少冻融循环等规范操作，是优化DNA质量的重要措施。除了所需的DNA浓度外，DNA片段长度也是完整性的重要指标。我们建议在样本处理和储存过程中尽量减少DNA降解，以获得更长的片段，从而优化测序结果。这一点在临床环境中尤为重要，因为采样方法、介质和处理方式的差异较为常见。我们已成功将该方案应用于从2-SP培养基和NAAT运输介质中提取的DNA，代表性结果中显示平均片段长度可低至1 kb。最后，成功的测序定义为基因组覆盖度超过95%，且平均测序深度超过10x10。
迄今为止，多种研究团队已成功将靶向富集技术应用于多种微生物和病毒，包括引起性传播感染（STIs）的病原体、诺如病毒、家畜病毒以及植物病原体10,13,14,15,16。然而，迄今为止，探针设计通常局限于单一病原体，而非针对多种临床综合征相关病原体的完整基因组组合。理想的靶标是基因组较小且保守的生物体，这确实包括 C. trachomatis、T. pallidum 和 M. genitalium。尽管 N. gonorrhoeae 的基因组多样性更高且泛基因组更大，但在包含上述三种细菌的设计中，仍可合理地纳入覆盖该菌的探针。这些细菌之间以及可能与之临床相关的其他病原体在 %G+C 含量上存在一定差异，这意味着实验条件可能需要优化。
本实验方案的目的是直接从临床样本中获取完整的基因组，以进行系统发育和流行病学分析。我们展示了一种新颖且有效的策略，采用针对目标病原体定制的探针 panel 沙眼衣原体，淋病奈瑟菌，梅毒螺旋体， 和 M. genitalium 利用从泌尿生殖道和肛门直肠拭子等临床样本中提取的DNA来回收完整基因组。该方法已被证明是成功的，并已应用于布宜诺斯艾利斯淋巴肉芽肿（LGV）暴发疫情的特征分析，从而实现对一种新型谱系的描述 C. trachomatis LGV10,13.
将介绍靶向富集流程，包括使用市售的DNA捕获方法，并结合捕获后混合策略用于下一代测序（NGS），以直接从临床样本中获得C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum和/或M. genitalium感染患者的完整基因组。为确保最佳效果，建议选择Ct值低于30的样本，因为较高的Ct值反映病原体载量较低，难以获得完整的基因组。该方法所需的DNA提取物可来源于多种样本类型和采样介质的临床样本。DNA提取过程可通过手工或自动化系统完成，使用专为从人源拭子样本中分离病原体或病毒DNA而设计的试剂盒（参见材料表）。
目标富集步骤中使用的探针组（参见 材料清单旨在特异性捕获基因组多样性 沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、梅毒螺旋体 和 M. genitalium. 针对每种物种的多个完整基因组设计了定制探针，以优化对其已知泛基因组的覆盖10设计标准包括与参考序列的最小序列同源性为90%，以及1x-2x的平铺频率，以提高靶标捕获效率。为优化成本效益，探针设计所用算法在保持基因组覆盖全面性的同时，尽量减少了探针数量。最终探针组包含242,000个探针，用于靶向多重设计 沙眼衣原体，淋病奈瑟菌，生殖支原体，以及 T. pallidum整个靶向富集实验流程可在2至3天内完成。针对两天和三天的工作流程，均提供了明确的暂停点指示。
伦理声明 
本研究基于先前已发表的方案提出方法学改进10,13。所述操作仅涉及去标识化的样本，不包含患者数据；因此，方法学部分无需特定的伦理审批。代表性结果来自两组先前研究过的样本：在批准方案“感染性直肠炎患者中C. trachomatis的检测：流行率与分型”（布宜诺斯艾利斯市政府，批准号 201723）下收集的阿根廷样本，所有参与者均签署了书面知情同意书；以及匿名的芬兰样本，该样本无需特定伦理审批。在将任何测序数据提交至数据库之前，需去除人类序列读段。

<table><tbody><tr><td>8通道移液器 0.5-10 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3125000010</td><td>Eppendorf Research&amp;nbsp;plus，8通道，0.5-10 &amp;micro;L，中灰色，可调体积。</td></tr><tr><td>8通道移液器 10-100 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3125000036</td><td>Eppendorf Research&amp;nbsp;plus，8通道，10-100 &amp;micro;L，黄色，可调体积。</td></tr><tr><td>MBC标记文库用接头寡核苷酸混合物</td><td>Agilent Technologies</td><td>5500-0147</td><td>SureSelect XT HS2文库制备试剂盒（用于Illumina平台，PCR前）的组成部分。</td></tr><tr><td>使用病毒/病原体DNA提取试剂盒的自动化核酸提取系统</td><td>Qiagen</td><td>937036 (试剂盒) / 9001297 (仪器)</td><td>QIAsymphony SP/AS仪器配合QIAamp DSP Virus/Pathogen试剂盒用于自动化DNA提取。</td></tr><tr><td>结合缓冲液</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-9687</td><td>SureSelect靶向富集试剂盒Illumina杂交模块Box 1（PCR后）的组成部分。</td></tr><tr><td>DNA提取试剂盒及自动化仪器</td><td>Zymo Research Corporation</td><td>D3024/D3025</td><td>Quick-DNA Miniprep试剂盒，用于从临床样本中提取总DNA。支持手动或自动化操作流程。</td></tr><tr><td>末端修复-A尾化酶混合物</td><td>Agilent Technologies</td><td>5500-0147</td><td>SureSelect XT HS2文库制备试剂盒（用于Illumina平台，PCR前）的组成部分。</td></tr><tr><td>末端修复尾化缓冲液</td><td>Agilent Technologies</td><td>5500-0147</td><td>SureSelect XT HS2文库制备试剂盒（用于Illumina平台，PCR前）的组成部分。</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>VWR Chemicals BDH</td><td>20816.298</td><td>无水乙醇 &amp;ge;99.5%，符合欧洲药典和美国药典标准</td></tr><tr><td>配备高灵敏度dsDNA检测试剂的荧光计 / 基于荧光法的DNA定量方法</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>Q33238, Q33231</td><td>Qubit 4荧光计配合1X dsDNA高灵敏度（HS）检测试剂盒。</td></tr><tr><td>片段化缓冲液</td><td>Agilent Technologies</td><td>5191-4080</td><td>SureSelect酶法片段化试剂盒的组成部分，名称为“5X片段化缓冲液”。</td></tr><tr><td>片段化酶</td><td>Agilent Technologies</td><td>5191-4080</td><td>SureSelect酶法片段化试剂盒的组成部分。</td></tr><tr><td>高保真DNA聚合酶缓冲液</td><td>Agilent Technologies</td><td>5500-0147</td><td>SureSelect XT HS2文库制备试剂盒（用于Illumina平台，PCR前）的组成部分，名称为“Herculase II缓冲液”。</td></tr><tr><td>含dNTPs的高保真DNA聚合酶缓冲液（5X）</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-9687</td><td>SureSelect靶向富集试剂盒Illumina杂交模块Box 1（PCR后）的组成部分，名称为“Herculase II缓冲液”。</td></tr><tr><td>用于PCR扩增的高保真融合酶</td><td>Agilent Technologies</td><td>5191-5688</td><td>SureSelect靶向富集试剂盒Illumina杂交模块Box 1（PCR后）的组成部分，名称为“Herculase II”。</td></tr><tr><td>高温洗涤缓冲液</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-9687</td><td>SureSelect靶向富集试剂盒Illumina杂交模块Box 1（PCR后）的组成部分，名称为“洗涤缓冲液2”。</td></tr><tr><td>杂交缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>5500-0147</td><td>SureSelect XT HS2文库制备试剂盒（用于Illumina平台，PCR前）的组成部分。</td></tr><tr><td>带索引的测序引物</td><td>Agilent Technologies</td><td>5500-0147</td><td>SureSelect XT HS2索引引物对1-96（用于Illumina平台，PCR前）的组成部分。</td></tr><tr><td>实验室自建多重实时荧光定量PCR检测方法</td><td>Tib Molbiol</td><td>N/A</td><td>基于Lightmix性传播感染检测试剂盒开发并经认证的实验室自建检测方法</td></tr><tr><td>连接缓冲液</td><td>Agilent Technologies</td><td>5500-0147</td><td>SureSelect XT HS2文库制备试剂盒（用于Illumina平台，PCR前）的组成部分。</td></tr><tr><td>用于纯化的磁珠</td><td>Agilent Technologies</td><td>5191-5740</td><td>SureSelect DNA AMPure XP磁珠。</td></tr><tr><td>磁力架</td><td>Permagen Labware</td><td>MSRLV08</td><td>0.2 mL PCR 8联管磁力分离器，适用体积5 &amp;micro;L ~0.2 mL。</td></tr><tr><td>新一代测序（NGS）：高通量短读长测序系统&amp;nbsp;</td><td>Illumina, Inc.</td><td>N/A</td><td>在Illumina NextSeq1000和MiSeq平台上进行的双端150 bp测序（PE150）。</td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>BioConcept</td><td>3-07F04-H</td><td>分子生物学用水，无DNA、DNA酶、RNA酶，无菌，无PCR抑制剂。</td></tr><tr><td>寡核苷酸阻断剂混合物&amp;nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>5500-0147</td><td>SureSelect XT HS2文库制备试剂盒（用于Illumina平台，PCR前）的组成部分。</td></tr><tr><td>PCR管条</td><td>avantor，由VWR提供&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>732-3608</td><td>带平盖的PCR管条。</td></tr><tr><td>捕获后引物混合物</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-9687</td><td>SureSelect靶向富集试剂盒Illumina杂交模块Box 1（PCR后）的组成部分。</td></tr><tr><td>RNA探针</td><td>Agilent Technologies</td><td>5191-6916&amp;nbsp;</td><td>SureSelect定制Tier4 6Mb-11.9Mb探针，例如设计编号S3465164。</td></tr><tr><td>RNase阻断剂</td><td>Agilent Technologies</td><td>5500-0147</td><td>SureSelect XT HS2文库制备试剂盒（用于Illumina平台，PCR前）的组成部分。</td></tr><tr><td>室温洗涤缓冲液</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-9687</td><td>SureSelect靶向富集试剂盒Illumina杂交模块Box 1（PCR后）的组成部分，名称为“洗涤缓冲液1”。</td></tr><tr><td>链霉亲和素磁珠</td><td>Agilent Technologies</td><td>5191-5742</td><td>SureSelect链霉亲和素磁珠。</td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>Agilent Technologies</td><td>5500-0147</td><td>SureSelect XT HS2文库制备试剂盒（用于Illumina平台，PCR前）的组成部分。</td></tr><tr><td>靶向富集方法 / DNA捕获方法</td><td>Agilent Technologies</td><td>G9983-90000</td><td>SureSelect XT HS2 DNA试剂盒，包含文库制备、快速杂交靶向富集和捕获后合并工作流程。版本F0，2023年5月。适用于Illumina平台NGS。</td></tr><tr><td>针对 &lt;em&gt;C. trachomatis&lt;/em&gt;、&lt;em&gt;N. gonorrhoeae&lt;/em&gt;、&lt;em&gt;T. pallidum&lt;/em&gt; 和 &lt;em&gt;M. genitalium&lt;/em&gt; 的靶向富集探针组</td><td>Agilent Technologies / 微生物学富集实验室（IMM, UZH）</td><td>设计编号 S3465164</td><td>专为四种性传播感染病原体多重捕获设计的定制探针组（约242,000条探针），基于多个参考基因组设计。</td></tr><tr><td>热循环仪</td><td>Thermofischer</td><td>4375305</td><td>Veriti 96孔热循环仪。</td></tr></tbody></table>

利用靶向富集工作流程从临床样本生成完整的细菌基因组

Generating Whole Bacterial Genomes from Clinical Samples using a Target Enrichment Workflow

直接从临床样本中获取细菌性性传播感染（STI）的完整基因组具有挑战性，原因在于样本中存在人类DNA、微生物群以及极低的细菌病原体载量。培养通常不可行，因为这些细菌种类营养要求苛刻，且大多数样本采集于可裂解微生物的运输培养基中，导致其无法用于培养。为解决这些问题，我们设计了一套涵盖四种物种的探针面板，用于生成细菌性STI的全基因组序列，并在基因组测序前实施靶向富集——一种耗时两至三天的杂交流程。初步结果显示，对于直接测序未能成功的样本，该方法仍可获得高质量的基因组数据。靶向富集在测序细菌性STI基因组方面表现出高度有效性，尤其在病原体载量较高时（Ct &#60; 30）。含有Mycoplasma genitalium的测试样本常具有高于30的Ct值，导致基因组回收成功率较低；将杂交温度从65 °C优化至62.5 °C后，已观察到性能提升。除了支持基因组监测外，获得完整基因组还可提供有关抗菌药物耐药性的宝贵信息，例如识别与Neisseria gonorrhoeae相关的获得性耐药决定因子。该方法已成功鉴定出布宜诺斯艾利斯地区一种新型Chlamydia trachomatis淋巴肉芽肿静脉炎（LGV）谱系，即ompA-基因型L4，凸显了该方法在揭示新基因组多样性及提升STI监测能力方面的潜力。

一项关于阿根廷布宜诺斯艾利斯C. trachomatis LGV暴发的研究显示，这些样本具有一些新特征，即在ompA基因中存在10个核苷酸替换，与ompA-基因型L1相比不同，以及一种不常见的多位点序列分型（MLST）序列型217,18,19。我们的目标是分析这些临床样本的基因组，并将其置于全球数据背景下进行研究。为实现这一目标，我们比较了靶向富集方法与直接宏基因组测序在临床样本中进行细菌性性传播感染（STI）全基因组测序（WGS）的性能，以期克服因细菌载量低以及存在大量人类和微生物DNA所带来的挑战。
DNA 来源于2017年至2023年在阿根廷布宜诺斯艾利斯采集的直肠拭子样本，这些样本置于添加了2%胎牛血清（FCS）及抗生素（庆大霉素25 µg/mL、万古霉素0.5 mg/mL和两性霉素B 2.5 µg/mL）的2-SP培养基（蔗糖-磷酸盐培养基）中，并于−80 °C保存；或来源于苏黎世大学医院（USZ）采集的尿道、肛肠和咽部拭子混合样本，保存于核酸扩增检测（NAATs）缓冲液中。布宜诺斯艾利斯样本的DNA采用基于硅胶的手工提取试剂盒提取，而USZ样本的DNA则采用基于自动化磁珠的系统提取。
本研究中包含的所有临床样本均通过实验室自建的多重实时荧光定量PCR检测方法（见材料表）确认为阳性，qPCR循环阈值（Ct值）范围如下：C. trachomatis：17–34，N. gonorrhoeae： 24–31，T. pallidum：27–36，以及M. genitalium： 30–37。在测序前，使用高灵敏度荧光定量法对DNA浓度进行测定，以表征临床样本的起始材料（见材料表）。
为了比较直接宏基因组测序与靶向富集的效果，我们使用了32个样本，其中29个样本为沙眼衣原体（C. trachomatis）阳性，9个为淋病奈瑟菌（N. gonorrhoeae）阳性，5个为梅毒螺旋体（T. pallidum）阳性，3个为生殖支原体（M. genitalium）阳性。直接宏基因组测序未能获得任何完整的基因组，实际上其靶标数据几乎未超过阴性样本中的基线水平。而采用65 °C杂交进行靶向富集后，每种病原体的结果均显著改善，通过该方法在多数情况下成功获得了完整的基因组(图1)。
为评估靶向富集的最佳样本选择，我们分析了诊断性qPCR的Ct值与基因组回收效率之间的关系，后者以靶向序列读长占比（%OTR）来衡量。该指标反映了比对到目标生物基因组的测序读长比例，常用于评估富集效果。C. trachomatis的病原体载量与测序成功率之间存在显著相关性，成功测序的Ct值阈值约为Ct30。尽管其他靶向病原体的数据有限，但仍观察到类似趋势，即基因组测序成功主要出现在病原体载量低于Ct30的样本中(图2)。
在65 °C杂交温度下进行的本实验，针对Ct值低于30的样本，对C. trachomatis、N. gonorrhoeae和T. pallidum的基因组测序成功率实现了75%–80%的目标富集率。三个M. genitalium阳性样本的Ct值为30–37，其基因组覆盖度和平均测序深度较低。为改善这些结果，我们尝试降低杂交温度，这有助于提高杂交效率，因为M. genitalium基因组的G+C含量较低。通过使用较低的杂交温度，例如目前推荐的62.5 °C，我们能够在不损害其他病原体基因组回收效果的前提下，提高M. genitalium基因组的回收率(图3)。这些结果表明，靶向富集是一种从临床样本中获取有价值基因组信息的有效方法，并可适用于多种基因组，包括基于面板设计的广泛应用。
对成功富集的 C. trachomatis 基因组进行系统发育分析表明，布宜诺斯艾利斯的大多数样本聚集在 ompA-基因型 L2b 支系内，提示该谱系具有全球传播能力且传播成功。分析还揭示了在阿根廷存在一个引起淋巴肉芽肿（LGV）的新型独立谱系。该支系的样本与其他 LGV 谱系之间大约存在 600 个 SNP 的差异，因此提议将其命名为 ompA-基因型 L4 (图 4)。用于 图 1、图 2 和 图 4 的样本详细信息见补充表 1。
这些发现强调了靶向富集在研究病原体多样性中的价值，并展示了从临床样本中实现高程度基因组测序成功的潜力。
<img alt="基因组测序结果图表，显示通过直接测序与SureSelect方法获得的%OTR。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig1.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="图1"> 
图1：使用靶向富集与直接宏基因组测序相比的基因组富集效果。 目标序列读段占比（%OTR），定义为比对至目标生物基因组的测序读段所占百分比，用于反映靶向富集所达到的富集程度。图中直线表示所有数据点的中位数，方框表示50%四分位距（IQR）。数据点颜色对应样本来源：浅蓝色代表阿根廷，红色代表瑞士。基因组测序成功（定义为覆盖度 &gt;95% 且平均读深 &gt;10）以较大的点表示，失败则以较小的点表示。请注意y轴的不同尺度。缩写：CT = C. trachomatis，NG = N. gonorrhoeae，TP = T. pallidum，MG = M. genitalium。本图经修改自10。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="基因组测序散点图；%OTR 与 Ct 的关系；成功/失败分析；数据可视化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig2.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="图 2"> 
图 2：目标富集获得的 %OTR 与诊断性 qPCR Ct 值的相关性。 数据点颜色表示样本来源：浅蓝色代表阿根廷，红色代表瑞士。基因组测序成功（定义为覆盖度 &gt;95% 且平均测序深度 &gt;10）以较大的点表示，失败则以较小的点表示。请注意 y 轴的不同刻度。缩写：CT = C. trachomatis，NG = N. gonorrhoeae，TP = T. pallidum，MG = M. genitalium。本图经修改自10。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="杂交温度与覆盖度关系图；微生物区分；分析的数据点。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig3.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="图 3"> 
图 3：杂交温度对十个样本中所有性传播感染细菌病原体完整基因组回收率的影响。在人类DNA中添加已知浓度的目标细菌DNA，分别单独添加（单重）以及混合添加（多重），以模拟单一致病菌或多种病原菌共感染的样本。共进行了两组实验，每组包含五种病原体/组合，添加比例分别为0.01%和0.03%，以近似代表每种微生物DNA在总DNA中所占的百分比（其余DNA为人类DNA）。在较低温度下，M. genitalium的回收率有所提高。C. trachomatis的DNA添加浓度较低；进一步实验表明，温度变化对C. trachomatis基因组的回收无显著影响（数据未显示）。缩写：CT = C. trachomatis，MG = M. genitalium，NG = N. gonorrhoeae，TP = T. pallidum。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基于SNP数据的细菌基因型系统发育分析图，展示各国间的多样性。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig4.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="图 4"> 
图 4：阿根廷LGV菌株经重组校正后的系统发育树。 本分析纳入了所有已发表数据的可用LGV基因组。系统发育树右侧显示的元数据包括重复的患者样本、群体结构贝叶斯分析（BAPS；聚类=分支，其中多系群的BAPS聚类6代表群体的遗传多样性）、基因组测序方法（本研究数据）、ompA 基因型、国家和年份，具体说明见左上角图例。缺失数据以白色表示。本研究中的基因组名称以浅蓝色标出（阿根廷）和深蓝色标出（芬兰）（非靶向富集获得）。这些颜色仅用于区分本研究中生成的基因组。1000次超快速Bootstrap分析的Bootstrap值以百分比形式标注在主要分支上。本图改编自13。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充表 1：本研究中使用材料、试剂、仪器和设备的说明。 该表格列出了用于DNA提取、文库构建、靶向富集和测序的组分的详细信息，包括商品名称、生产厂家和目录编号。此外，还包含用于实验室内部qPCR检测和常规分子生物学实验的相关物品。标有星号（*）的项目可使用等效替代品。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/Supplementary_Table_1_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

本文介绍一种利用靶向富集技术对临床样本中细菌性性传播感染病原体进行全基因组测序的实验方案。这种基于综合征检测面板的创新方法克服了样本中人类DNA含量高而细菌载量低的技术难题，有助于对沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）、淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）、梅毒螺旋体（Treponema pallidum）和生殖支原体（Mycoplasma genitalium）开展基因组监测。

直接从临床样本中获取细菌性性传播感染（STIs）的完整基因组具有挑战性，原因是样本中存在人类...

基因组可提供有关病原体的祖先、传播及功能的信息。对于不可培养的细菌，这些信息只能通过靶向富集获得。由于人类DNA含量极高、微生物群落复杂以及细菌载量极低，直接从临床样本中测序细菌病原体具有挑战性。在许多情况下，由于采样方法和苛养细菌的限制，培养并非可行选择。在将该技术应用于性传播细菌时，我们发现了一种新型的沙眼衣原体LGV谱系，命名为ompA基因型L4，并证实了优势LGV谱系的全球扩散，为分子诊断和流行病学监测提供了关键见解。该富集流程可从确诊阳性的性传播感染临床样本中实现完整基因组的回收。我们发现，该技术在性能上优于宏基因组深度测序、宿主DNA耗竭以及纳米孔自适应测序。我们正在调查这些病原体在欧洲及阿根廷的流行毒株。该研究有望为传播机制和抗菌药物管理提供重要信息。首先，使用一种灵敏且准确的基于荧光的方法测定临床样本DNA提取物的DNA浓度。用无核酸酶水将每个DNA样本稀释，使最终体积为17微升的PCR管条中含10至200纳克DNA。向每孔中加入17微升稀释DNA后，再向各孔加入3微升片段化预混液。上下吹打20次以充分混匀。然后密封PCR管条，高速涡旋振荡10秒，并短暂离心以收集管壁液体。然后，将 PCR 管条放入热循环仪中，并启动预先设定的片段化与孵育程序。接着，按照表格所示配制末端修复与 dA 加尾主混合液。涡旋振荡并离心管子（操作方式同前），然后置于冰上保存。然后，将20微升末端修复和dA加尾主混合液加入每个含有50微升DNA片段的孔中。密封条板后，高速涡旋振荡8秒。短暂离心条板后，将其放回热循环仪中。当热循环程序结束后，将PCR管条置于冰上。接着，向每孔含有DNA片段的反应孔中加入25 µL室温连接主混合液（该混合液需提前30至45分钟配制）。对于带有NBC标签的文库，向每孔加入5 µL接头寡核苷酸混合液。立即将PCR管条放回热循环仪中，并继续运行程序。开始DNA纯化前，从4摄氏度取出磁珠，使其恢复至室温后再使用。然后，向每个样本孔中加入80 µL。将PCR管条置于磁力架上，每孔用200微升70%乙醇洗涤两次。每次洗涤时静置一分钟，并小心移除乙醇，避免扰动磁珠。加入35微升无核酸酶水与磁珠混匀后孵育5分钟，随后小心吸取各孔上清液，转移至新的PCR管条中对应的孔内。将新的PCR管条置于冰上，并弃去磁珠。取准备好的预捕获PCR反应混合液，向每孔含有纯化DNA文库的样本中加入11微升。向每个反应中加入5微升选定的index引物修复液，并密封PCR管条。按照表格中指定的程序启动热循环仪以进行捕获前PCR扩增。只有当热循环仪温度达到98摄氏度时，才加入PCR管条。完成捕获前PCR后，进行另一次基于磁珠的纯化步骤，以纯化文库。将PCR产物与磁珠孵育。然后，将PCR条状管置于磁力分离装置上，静置5至10分钟，直至溶液变澄清。在条状管仍置于磁力架上的同时，小心移除并弃去每个孔中的澄清上清液。然后，用 15 微升无核酸酶的水洗脱 DNA，并测定纯化后 DNA 文库的浓度。进行样品杂交时，根据此处指定的方案设置热循环仪程序。启动程序后立即暂停运行。使用无核酸酶水将制备好的DNA文库稀释至终体积为12微升，DNA用量为500至1,000纳克。将寡核苷酸阻断剂混合物涡旋振荡并离心后，向每个样本管中加入5微升。密封PCR管条，置于热循环仪中。当热循环仪运行至程序第三步时暂停。将13微升已准备好的室温探针杂交混合液加入每个样本中，同时保持八联管仍在热循环仪内。缓慢吹打8到10次以充分混匀。确保无气泡存在，将条带放回热循环仪中。然后确认所有管盖均已紧密密封。为捕获杂交文库，将每管中的全部液体转移至相应含有200 µL预洗的链霉亲和素磁珠的管中。在用室温洗涤缓冲液洗涤前，先收集链霉亲和素磁珠。将PCR条状管从磁力架上取下后，加入200 µL预热至70 °C的高温洗涤缓冲液，通过上下吹打重悬磁珠。密封管条，高速涡旋振荡，并像之前所示那样快速离心。将密封的试管条置于70摄氏度的PCR仪金属块中，孵育5分钟。将PCR试管条从PCR仪转移回室温下的磁力架。静置1分钟，直至溶液变澄清。然后，小心移除并弃去上清液。接着，向每根含有磁珠的试管中加入 25 µL 无核酸酶水。按照此处所示表格中的要求设置热循环仪程序。向每个样品管中加入25 µL制备好的捕获后PCR反应混合液。轻轻混匀反应液，直至悬浮液均匀，然后牢固密封PCR管条，无需离心。将密封好的PCR管条放入热循环仪中。将PCR产物转移至新离心管后，向每个样本管中加入50微升磁珠悬浮液，并按照之前所示方法进行DNA纯化。使用基于荧光的定量方法测定最终纯化文库DNA的浓度。靶向富集导致所有检测病原体（包括沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、梅毒螺旋体和生殖支原体）的靶上读段比例显著升高，因而相较于直接测序可获得更完整的基因组。基因组测序的成功主要出现在针对全部四种病原体的qPCR循环阈值（CT值）低于30的样本中。沙眼衣原体的CT值与靶向读段百分比之间呈现出明显的负相关关系。相较于先前使用的65摄氏度，采用62.5摄氏度的杂交温度可提高生殖支原体的基因组覆盖度，同时不影响其他目标病原体的检测性能。对来自阿根廷的沙眼衣原体基因组进行系统发育分析，结果显示许多样本聚集在L2b分支内，并发现了一个新的谱系，该谱系被提议为ompA基因型L4，与此前所有LGV基因组相差约600个单核苷酸多态性位点。

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