使用靶标富集工作流程从临床样本中生成全细菌基因组

基因组可以提供有关病原体的血统、传播和能力的信息。对于不可培养的细菌，只能通过靶标富集来获得这些信息。由于人类 DNA 数量众多、微生物群多样化且细菌载量极低，因此直接从临床样本中对细菌病原体进行测序具有挑战性。

在许多情况下，由于采样方法和挑剔的细菌，培养不是一种选择。在将这项技术应用于性传播细菌的同时，我们发现了一种名为 ompA 基因型 L4 的新型沙眼衣原体 LGV 谱系，并证实了优势 LGV 谱系的全球扩张，为分子诊断和流行病学监测提供了关键见解。该进展富集方案能够从阳性诊断的性传播感染临床样本中完全恢复基因组。

我们发现该技术优于宏基因组深度测序、宿主 DNA 耗竭和纳米孔自适应测序。我们正在调查这些病原体在欧洲和阿根廷的流行菌株。这有可能为传播和抗菌药物管理提供信息。

首先，使用灵敏且准确的基于荧光的方法测量临床样本中 DNA 提取物的 DNA 浓度。使用无核酸酶水将每个 DNA 样品稀释至 10 至 200 纳克，每个 PCR 管条中的最终体积为 17 微升。向每个含有 17 微升稀释 DNA 的孔中加入 3 微升片段化预混液。

上下移液 20 次以充分混合。然后，密封 PCR 管条。高速涡旋条带 10 秒钟，然后短暂旋转以收集内容物。

然后，将 PCR 管条放入热循环仪中，并启动用于片段化和孵育的预编程方案。接下来，如表所示制备末端修复和 dA 尾部预混液。如前所示涡旋并旋转管子并将其放在冰上。

然后，将 20 微升末端修复和 dA 拖尾预混液移液到每个含有 50 微升 DNA 片段的孔中。密封条带并高速涡流八秒钟。短暂旋转条带后，将其放回热循环仪中。

热循环仪程序完成后，将 PCR 管条放在冰上。接下来，将提前 30 至 45 分钟制备的 25 微升室温连接预混液添加到每个含有 DNA 片段的孔中。向每个孔中加入 5 微升用于 NBC 标记文库的接头寡核苷酸混合物。

立即将 PCR 管条放回热循环仪中并继续程序。要开始 DNA 纯化，请从 4 摄氏度中取出磁珠，并在使用前让它们达到室温。然后，向每个样品孔中加入 80 微升。

将PCR管条放在磁性支架上，并用200微升70%乙醇洗涤每个孔两次。每次洗涤时等待一分钟，小心地去除乙醇，不要干扰磁珠。将珠子与 35 微升无核酸酶水混合并孵育 5 分钟后，小心地从每个孔中吸出清除的上清液，并将其转移到新 PCR 管条中的相应孔中。

将新的PCR管条放在冰上并丢弃磁珠。取制备的预重捕获PCR反应混合物，并将其11微升加入每个含有纯化DNA文库的样品孔中。向每个反应中加入 5 微升选定的指数初免修复，并密封 PCR 管条。

按照表中的规定启动用于PCR扩增的热循环仪程序，以执行预捕获PCR。仅在热循环仪达到 98 摄氏度后才添加 PCR 管条。完成捕获前 PCR 后，执行另一次基于磁珠的纯化以纯化文库。

将 PCR 产物与磁珠一起孵育。然后，将 PCR 条管放在磁分离装置上并等待 5 至 10 分钟，直到溶液变清。当试纸留在磁性支架上时，小心地从每个孔中取出并丢弃透明上清液。

然后，在15微升无核酸酶水中洗脱DNA，并测量纯化DNA文库的DNA浓度。对于样品杂交，请根据此处指定的协议对热循环仪进行编程。启动程序并立即暂停运行。

使用无核酸酶水将 500 至 1， 000 纳克制备的 DNA 文库稀释至最终体积为 12 微升。涡旋并旋转寡核苷酸阻滞剂混合物后，向每个样品管中加入 5 微升。密封 PCR 管条并将其放入热循环仪中。

当热循环仪到达协议的第三步时，暂停热循环仪。向每个样品中加入 13 微升制备的室温探针杂交混合物，同时将条带保持在热循环仪内。缓慢上下移液 8 至 10 次以混合。

确保不存在气泡，然后将条带放回热循环仪中。然后，确认所有管子都密封严密。要捕获杂交文库，请将整个体积从每个试管转移到含有 200 微升预洗链霉亲和素珠的相应试管中。

收集链霉亲和素珠，然后用室温洗涤缓冲液洗涤它们。从磁选机中取出 PCR 管条后，加入 200 微升预热至 70 摄氏度的高温洗涤缓冲液，并通过上下移液重新悬浮珠子。如前所述，密封管条，高速涡流并快速旋转。

将密封的管条放入70摄氏度的热循环仪块中，孵育5分钟。在室温下将PCR管条从热循环仪转移回磁选机。等待一分钟，直到溶液变得清晰。

然后，小心地取出并丢弃上清液。然后，向每个含有珠子的试管中加入 25 微升无核酸酶水。按照此处所示的表中的指定对热循环仪进行编程。

向每个样品管中加入 25 微升制备的捕获后 PCR 反应混合物。混合反应直至悬浮液均匀，并牢固地密封PCR管条，不要将其旋转。将密封的 PCR 管条放入热循环仪中。

将 PCR 产物转移到新鲜试管中后，向每个样品管中加入 50 微升珠子悬浮液，并如前所示进行 DNA 纯化。使用基于荧光的定量方法测量最终纯化文库 DNA 的 DNA 浓度。与直接测序相比，靶标富集导致目标读取的百分比显着更高，因此基因组完整，包括沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、梅毒螺旋体和生殖支原体。

基因组测序成功主要在所有四种病原体的qPCR循环阈值低于30的样本中观察到。CT 值与沙眼衣原体的目标读数百分比之间存在明显的负相关关系。与之前的 65 摄氏度相比，使用杂交温度为 62.5 摄氏度，提高了生殖支原体的基因组覆盖率，而不会降低其他目标病原体的性能。

对来自阿根廷的沙眼衣原体基因组进行系统发育分析显示，许多样本聚集在 L2b 进化枝内，并揭示了一个新的谱系，即 ompA 基因型 L4，与所有先前的 LGV 基因组通过大约 600 个单核苷酸多态性分开。