Name: 通过低相干全息学对肠道类器官进行无标记、高分辨率 3D 成像和机器学习分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-12T13:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 了解低相干全息成像技术如何实现肠道类器官的无标记、高分辨率三维成像。该方法结合机器学习分析，支持实时监测类器官结构动态和药物反应，为疾病建模和精准医学研究提供非侵入性生物物理检测手段。

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本工作由韩国国家研究基金会资助，该基金会由韩国政府（MSIT）提供资金支持（RS-2024-00442348、RS-2024-00440577、2022M3H4A1A02074314），以及韩国先进技术研究院（KIAT）通过国际协作研发项目&amp;#38;D 计划（P0028463）以及由韩国政府（科学技术信息通信部和保健福祉部）资助的韩国再生医学基金（KFRM）项目 &amp;#38; 福利）（21A0101L1-12）。数据采集由 M.J.L. 和 J.H.L. 完成，其中 J.H.L. 负责数据处理，J.M.C. 负责数据分析。所有作者均对论文撰写作出了贡献。我们感谢 ChulMin Oh 和 Chungha Lee 在技术讨论及图表准备方面提供的宝贵帮助。

注意：本方案中使用的所有材料、仪器和软件的相关详细信息均在材料表中提供。不同制造商的等效产品可作为替代品使用。整个方案的示意图见图1。
1. 样品制备
<ol>
	<li>制备 sIO 培养基
	<ol>
		<li>根据生产商说明书配制市售培养基。使用 0.22 µm 滤器对培养基进行过滤除菌。 
		注意：如果培养基在细胞培养操作台内无菌条件下配制，且所有组分均已预先灭菌（例如以无菌瓶或小瓶提供），则可能无需通过 0.22 µm 滤器进行过滤。</li>
		<li>将 15 mL 配制好的培养基分装至无菌储存管中。在类器官培养使用前，将分装的培养基恢复至室温（15 - 25 °C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解冻 sIO 储存液
	<ol>
		<li>将冷冻保存的类器官在 37 °C 水浴中快速解冻（2 分钟内完成）。将解冻后的类器官悬液转移至微量离心管中，在 150 × g 条件下离心 3 分钟，使类器官沉淀。</li>
		<li>小心吸除上清液，以去除 DMSO，尽量减少潜在的细胞毒性作用。</li>
		<li>按 1:4 比例加入培养基和新鲜细胞外基质（ECM），轻柔吹打，确保沉淀均匀重悬。每孔在 48 孔板中接种 15 µL 形成液滴。将 ECM 置于冰上，防止提前聚合。</li>
		<li>将培养板倒置放入 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 1 小时，使 ECM 完成聚合。聚合完成后，向每孔小心加入 200 µL 新鲜培养基。 
		注意：本方案适用于多种市售成像培养皿和孔板。请根据孔板类型调整培养基体积，确保 ECM 液滴完全浸没。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>sIO 的传代培养 
	注意：类器官容易黏附于移液枪头。为减少黏附，建议使用培养基预先润湿移液枪头。
	<ol>
		<li>吸除废弃培养基。向每孔加入 200 µL 细胞回收溶液，在 4 °C 孵育 30 分钟，以促进 ECM 降解并回收类器官。</li>
		<li>通过轻柔吹打收集类器官悬液，并转移至微量离心管中。在 150 × g 条件下离心 3 分钟，随后小心吸除上清液。</li>
		<li>（可选）如需以单细胞形式传代，请选择以下任一解离方法：
		<ol>
			<li>酶解法：向沉淀中加入 100 µL 单细胞解离溶液，在 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 1–2 分钟。加入 150 µL 培养基以中和反应。进行吹打或轻弹管壁。在 150 × g 条件下离心 3 分钟，吸除上清液，仅保留沉淀。 
			注意：避免过度孵育，长时间暴露可能对细胞造成严重损伤。</li>
			<li>机械解离法：将沉淀重悬于 200 µL 培养基中。使用 P200 移液器上下吹打 20–30 次，将类器官机械解离为较小片段或单细胞。在 150 × g 条件下离心 3 分钟，吸除上清液，保留沉淀。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>按 1:4 比例加入培养基和新鲜 ECM，轻柔吹打，确保沉淀均匀重悬。每孔在 48 孔板中接种 15 µL 形成液滴。</li>
		<li>将培养板倒置放入 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 1 小时，使 ECM 聚合。</li>
		<li>聚合完成后，向每孔加入 200 µL 新鲜完全培养基，并向外围空孔加入 PBS 以防止蒸发。每 2–3 天更换一次培养基，每周传代一次类器官。根据所需类器官大小调整传代间隔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>药物处理
	<ol>
		<li>通过将 3.00 mg 顺铂粉末（分子量 ≈ 300.05 g/mol）溶解于 1 mL DMSO 中，配制 10 mM 的顺铂储备液。短暂涡旋混匀，并使用棕色管或铝箔包裹避光保存。</li>
		<li>配制处理用培养基时，将 10 mM 顺铂储备液按 1:1,000 比例稀释于完全 sIO 培养基中，得到终浓度为 10 µM 顺铂和 0.1% DMSO 的处理培养基。</li>
		<li>对于溶剂对照组，配制含 0.1% DMSO 的培养基，使其 DMSO 终浓度与处理组一致但不含顺铂。</li>
		<li>从 sIO 培养物中移除废弃培养基，轻柔更换为含 10 µM 顺铂的培养基或仅含 DMSO 的对照培养基。</li>
		<li>处理后，将样品转移至成像系统培养箱中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用操作软件进行低相干全息层析成像
<ol>
	<li>成像样品制备
	<ol>
		<li>按照步骤 1.3.1–1.3.4 中所述方法，将 15 µL 器官oid-ECM 凝胶滴加至 #1.5 盖玻片底成像培养皿中。每个凝胶滴应尽可能放置在培养皿中心，以获得最佳成像效果。</li>
		<li>在聚合前，于室温下孵育 1 分钟，使器官oid 沉降至底部。</li>
		<li>将培养板倒置于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 1 小时，使 ECM 聚合。随后，轻柔加入足够的培养基，完全浸没器官oid。 
		注意：根据盖玻片底成像培养皿的尺寸调整培养基体积，确保器官oid 完全浸没。</li>
		<li>传代后第 5 天，在成像前立即用 PBS 洗涤样品 2–3 次，以去除碎片并减少光学伪影。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像设置
	<ol>
		<li>开启环境控制器，以维持样品活性。腔室控制单元将自动调节温度至 37 °C，CO2 浓度至 5%。</li>
		<li>按下仪器正面的 Door&#160;按钮以打开门。向腔室井内加入水，形成一层薄水膜，防止培养基干燥。</li>
		<li>将成像培养皿放入合适的容器支架中，插入成像腔室，并用固定销固定，防止移动。确保培养皿牢固安装在支架上，无倾斜。</li>
		<li>使用 Door 按钮关闭仪器门，以屏蔽外部光线干扰。</li>
		<li>启动 TomoStudio X 软件并登录。点击 Start 打开主窗口。</li>
		<li>点击左上角的 Add Project，并设置实验参数（例如项目名称、培养基类型、样品类型等）。系统将自动生成样品面板。请确保选择正确的培养基类型，以便实验中使用相应的折射率（RI）。</li>
		<li>在面板中点击 Desired well，然后点击顶部的 Create ，将各孔注册为样品。</li>
		<li>点击右上角的 ROI Setup ，以定义培养皿中的感兴趣区域（ROI）。所有参数设置完成后，点击右下角的 Run Experiment，打开图像采集窗口。</li>
		<li>点击右上角的 Load Vessel ，将出现明场图像。使用 +Z 和 -Z 按钮调节 Z 轴位置以实现聚焦。</li>
		<li>在单次成像选项卡中，调整 ROI 大小。在 160 µm × 160 µm 的视野范围内捕获器官oid，并采集深度达 140 µm 的轴向图像堆栈。对于较大的器官oid，选择底部的 Tile Imaging 复选框，采集多个折射率（RI）断层图像并进行图像拼接。</li>
		<li>切换至延时成像选项卡，配置长期成像参数。根据需要设置持续时间和时间间隔。本实验中，延时成像以 10 分钟为间隔，持续 24 小时，并在相同时间段内以每 2 小时为间隔进行分析。</li>
		<li>点击 Scan 图标，捕获当前 ROI 位置。通过明场成像手动将 ECM 凝胶居中。点击 BF 按钮，调节明场成像的强度和曝光值。</li>
		<li>在预览面板中移动出现的 ROI 框，选择 ROI 。找到目标 ROI 后，点击底部的 Add Point，成像点列表将显示出来。</li>
		<li>点击 Acquire 开始成像，系统将采集原始图像数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像采集 
	注意：该过程将从原始图像数据生成 Tomocube 通用文件（TCF）。原始图像数据必须处理为 TCF 文件，该文件包含多种图像类型，如折射率（RI）断层图和最大强度投影图。RI 断层图表示样品的三维折射率分布，最大强度投影图则显示 XY 平面中每个横向位置的最高 RI 值。
	<ol>
		<li>将原始图像文件拖放至 HTX 处理服务器。点击 Process ，从原始图像文件生成 TCF 文件。</li>
		<li>要查看 TCF 文件中生成的 RI 断层图，可使用 TomoAnalysis Viewer、MATLAB 或&#160;Python。在 MATLAB 中查看 TCF 文件时，可使用 h5info 和 h5read 等函数；在 Python 中，可使用 h5py 包读取 H5 文件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 图像分析
<ol>
	<li>基于机器学习的图像分割
	<ol>
		<li>将TCF图像文件导出为HDF5格式（补充代码文件1），以确保数据为与ilastik兼容的多维格式。</li>
		<li>打开ilastik，导航至 文件 &#62; 新建项目。在“分割工作流”部分选择 像素分类，并将项目文件保存至指定目录。</li>
		<li>进入“1. 输入数据”选项卡，点击 添加新文件，加载HDF5文件，选择适当的H5数据集，并确保正确分配图像通道。</li>
		<li>进入“2. 特征选择”选项卡，选择相关特征（颜色/强度、边缘、纹理）以优化分割效果。 
		注：特征选择可能因数据集和图像特性而异。在当前分析中，所选特征包括：颜色/强度（σ = 1.60）、边缘（σ = 3.50）和纹理（σ = 1.60）。根据图像复杂性，可能需要基于启发式方法进行优化。或者，可使用ilastik中的 建议特征 &#62; 运行特征选择 功能来确定最优参数集。</li>
		<li>在“3. 训练”选项卡中，使用不同颜色的画笔标注类器官区域和非类器官区域。为提高分割准确性，需仔细标注边界周围的区域。</li>
		<li>点击 实时更新 预览分割结果，并根据需要进行调整。</li>
		<li>进入“4. 预测导出”选项卡，在“源选择”中选择 简单分割 以导出标记的预测结果。点击 导出全部，并根据下游分析需求将输出格式设置为.h5或.tiff。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定量特征分析 
	注：本步骤在MATLAB中执行，各操作详见 补充代码文件2。
	<ol>
		<li>将折射率（RI）断层图像与掩膜图像结合，生成仅包含类器官区域的掩膜RI图像。</li>
		<li>基于掩膜RI图像，计算类器官体积、蛋白质密度和蛋白质含量等定量参数。
		<ol>
			<li>体积：通过将分割掩膜中的像素数量乘以X、Y和Z方向的像素分辨率，计算类器官的总体积。使用MATLAB内置函数Sum，对类器官标记掩膜数组中的所有体素值进行计数，以确定像素数量。 
			注：像素分辨率由成像系统决定，可在HDF5结构中的 数据 &#62; 3D属性 组下找到。</li>
			<li>蛋白质密度：通过从类器官平均RI值中减去培养基RI值，再除以蛋白质折射率增量，计算蛋白质密度&#160;。
			<ol>
				<li>培养基RI：在分析前使用折射仪测量周围培养基的RI值。</li>
				<li>平均RI值：通过对类器官掩膜内体素的RI值取平均，确定类器官的平均RI。</li>
				<li>蛋白质折射率增量（α）：采用先前报道的、由折射率增量研究得出的经验常数。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>蛋白质含量：将步骤3.2.2.1中确定的体积与步骤3.2.2.2中获得的蛋白质密度相乘，计算总蛋白质含量。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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M.J.L.、J.H.L.、S.M.L. 和 Y.K.P. 在 Tomocube 公司拥有财务利益，该公司致力于全息层析成像和定量相位成像仪器的商业化。

全息层析成像为类器官的无标记、高分辨率活体成像提供了一种强大的方法，克服了传统成像技术相关的诸多挑战。在本方案中，我们描述了一种将低相干全息层析成像（HT）应用于小肠类器官（sIO）研究的综合方法，可实现对类器官形态、生长动态以及药物处理响应的实时、定量可视化。结合基于机器学习的分割与定量分析，进一步增强了该成像方法的分析能力，为类器官行为提供了无偏倚、可重复的评估手段。
全息层析成像（HT）的一个主要优势在于能够以无标记的方式对处于天然状态的类器官进行活体成像。传统的基于荧光的成像方法（如共聚焦显微镜和光片显微镜）需要染色或基因标记，这可能引入光毒性，影响类器官的生理状态，并限制活体成像的持续时间。此外，基于抗体的标记在致密的类器官结构内部会受到扩散障碍的影响，因而需要较长的孵育时间6,7。HT 利用折射率（RI）作为内在的对比机制，克服了这些挑战，从而实现了对类器官生长与分化过程的无创、长期监测，并达到亚细胞分辨率。
<p class="jove_con...

类器官是由干细胞培养而成的三维（3D）微型器官，能够重现真实器官的关键结构和功能特征 体外1研究人员已为多种组织开发了类器官系统——包括肠道、脑、肺、肝和肾——每种系统均展现出类似其来源组织的自我组织结构和细胞类型多样性 体内 对应物。通过模拟天然器官的结构和多细胞复杂性，类器官成为研究人类发育、组织再生和疾病机制的强大模型系统1它们已成为疾病建模和药物发现的关键工具，使研究人员能够在实验室中利用患者特异性的三维组织探索疾病通路并测试新的治疗方法。2值得注意的是，类器官在再生医学中也具有广阔的应用前景3：类器官来源的组织可被移植 体内 修复损伤，这一点已在肠道和肝脏类器官中得到证实，凸显了它们在恢复器官功能方面的潜力4这种多功能性使类器官在现代生物医学研究和个性化医疗中不可或缺。
由于类器官具有多细胞组成和三维结构复杂性，捕获并分析其动态变化至关重要。然而，传统成像技术在解析类器官结构和动态过程方面存在显著局限性，通常只能提供二维图像，无法充分反映其完整的生理状态5。
明场显微镜是一种广泛使用的、非侵入性的类器官成像方法。它能够方便地监测类器官的生长状态和形态，但在未染色的三维样本中提供的对比度有限。此外，该方法缺乏光学切片能力，导致内部结构的分辨率较差。类器官通常呈现为近乎透明的状态，从而阻碍了表面以下细微特征的识别6。相位对比显微镜通过将相位变化转化为强度差异，提高了可见性，可在无需染色的情况下揭示整体结构特征（例如中央腔）。尽管该技术适用于实时观察，但存在晕轮伪影、分辨率较低以及穿透深度有限等问题，因此在较厚的类器官成像中效果不佳7。
连续切片后进行苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色以及基于抗体的免疫染色，被广泛用于分析类器官的显微结构和细胞组成8。改进的组织处理技术，如福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）和冷冻切片，可增强形态结构的保存效果，其中FFPE具有更优的结果9。将类器官包埋在琼脂糖等水凝胶中，并通过离心使多个样本在单一切片中排列整齐，可提高分析效率。患者来源的肿瘤类器官经H&amp;#38;E染色后的切片可反映原始肿瘤的组织学特征，而免疫荧光染色则可突出显示CK8等标志物以用于细胞鉴定10。然而，这些技术无法对活体类器官进行实时监测，并且在切片过程中可能引入组织皱缩或变形等假象。
共聚焦荧光显微镜广泛用于类器官成像，可获得高分辨率（亚微米级）的光学切片，从而详细可视化类器官的结构和细胞组成11,12。然而，由于采用点扫描激光照明，3D类器官的共聚焦成像通常仅限于表层组织（深度最多约100 µm），且成像过程耗时较长并可能引起光毒性13。光片荧光显微镜（LSFM）通过仅对成像平面进行照明，克服了部分上述局限，能够在光漂白和光毒性最小的情况下实现整个类器官的快速三维成像14,15；但该技术通常需要组织透明化处理以优化厚样本的成像效果。此外，光散射和折射率（RI）不匹配会限制LSFM的成像深度，这一问题可通过自适应光学、多视角成像和优化激发波长加以缓解16。样本安装过程也可能引入结构形变，而大规模的3D数据集则在存储和分析方面带来计算挑战。近年来的技术进展，包括改进的遗传标记技术、新型透明化试剂、自适应光学以及人工智能驱动的图像分析，正在逐步解决这些限制，使LSFM在类器官研究中的应用日益可行7。
尽管取得了这些进展，三维荧光成像技术在类器官长期活体监测方面仍面临多项挑战。首先，荧光标记的使用会引发光毒性效应并干扰生物学过程，从而为长期活体成像研究带来困难17。其次，基于抗体的标记方法由于在致密的类器官结构中存在扩散屏障，导致标记物渗透受限，因此需要采用先进的通透化和组织透明化方法，而一抗和二抗的孵育时间通常超过10天18。第三，类器官中的转染及稳定表达荧光蛋白的效率仍然较低，因为传统的基因递送方法在三维环境中效果不佳19。第四，实现深层成像所必需的光学透明化技术往往会导致荧光信号丢失和组织形变，因此需要优化透明化方案，以在组织透明度与荧光信号保存之间取得平衡20。
为克服这些局限性，全息断层扫描技术（HT）被提出用于对未标记的活体类器官进行长时间高分辨率成像。HT又称三维定量相位成像，是一种无标记、高分辨率的成像方式，能够在保持类器官天然生理状态的同时，实现对其结构的实时、定量可视化观察。HT的成像原理类似于X射线计算机断层扫描；通过在不同照明条件下采集多个二维光场图像，利用逆波方程求解重建出未标记样本的三维折射率（RI）分布21,22,23。HT已广泛应用于多个生物学领域，包括血液学24,25、细胞生物学中的相分离现象26、微生物学27以及组织病理学28。近年来，HT凭借其高分辨率、无标记的三维成像能力，在类器官研究中得到越来越多的应用21,22,23,29，为研究类器官的结构与功能动态提供了非侵入性的新途径。
本研究中，我们介绍了一种利用低相干层析成像技术（HT）对小鼠小肠类器官（sIOs）进行长期、无标记监测的详细实验方案。该方法能够在24小时内实时观察类器官的生长过程及药物反应，同时提供类器官体积、蛋白质密度和蛋白质含量的定量测量，从而实现对类器官行为的严谨、数据驱动分析。为研究类器官的形态学变化，我们使用顺铂处理样本，这是一种基于铂的化疗药物，可通过形成DNA交联并抑制细胞复制来诱导细胞凋亡30。虽然三维折射率（RI）成像能够捕捉结构细节，但系统性分析对于量化类器官动态至关重要。为此，我们整合了ilastik——一种基于机器学习的图像分割工具包31，用于区分类器官区域与背景。本方案详细描述了完整的操作流程，包括类器官培养准备、三维HT数据采集、基于机器学习的图像分割以及从RI断层图像中进行定量分析。该方法提供了一个可扩展、可重复且非侵入性的成像框架，为类器官研究建立了新标准，在疾病建模、再生医学和药物筛选等领域具有广泛的应用前景。

<table><tbody><tr><td>48孔板&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>培养皿</td></tr><tr><td>细胞回收溶液&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>Matrigel降解&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>顺铂</td><td>supelco</td><td>PHR1624</td><td>N/A</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>Eppendorf管</td><td>Corning</td><td>MCT-175-C-S</td><td>N/A</td></tr><tr><td>HTX处理服务器</td><td>Tomocube Inc., Korea</td><td>N/A</td><td>数据处理服务器</td></tr><tr><td>HT-X1</td><td>Tomocube Inc., Korea</td><td>N/A</td><td>操作软件</td></tr><tr><td>Ilastik</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>基于机器学习的图像分割工具包</td></tr><tr><td>成像培养皿支架&amp;nbsp;</td><td>Tomocube Inc., Korea</td><td>N/A</td><td>成像培养皿固定装置</td></tr><tr><td>IntestiCult类器官生长培养基（小鼠）</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>#06005</td><td>商业化预制培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td>Matlab 2024a</td><td>图像处理软件</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>用于三维类器官的细胞外基质（ECM）</td></tr><tr><td>Millipore&amp;nbsp;Steritop&amp;nbsp;真空瓶顶过滤器</td><td>Merck</td><td>S2GPT05RE</td><td>用于培养基灭菌的0.22 &amp;mu;m滤器单元</td></tr><tr><td>小鼠肠道类器官</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>#70931</td><td>N/A</td></tr><tr><td>折射仪</td><td>ATAGO</td><td>R-5000</td><td>折射率计算器</td></tr><tr><td>TomoDish</td><td>Tomocube Inc., Korea</td><td>901002-02</td><td>#1.5盖玻片底成像培养皿</td></tr><tr><td>TomoStudio X</td><td>Tomocube Inc., Korea</td><td>N/A</td><td>成像软件</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12604</td><td>单细胞解离</td></tr></tbody></table>

无标记、高分辨率三维成像结合低相干全息层析与机器学习分析肠道类器官

Label-free, High-Resolution 3D Imaging and Machine Learning Analysis of Intestinal Organoids via Low-Coherence Holotomography

对肠道类器官进行准确、无标记成像，对于研究其形态、生长动态以及对环境刺激的响应至关重要。全息层析成像技术（HT）能够在无需荧光标记的情况下，对活体类器官实现高分辨率的三维（3D）可视化，从而最大限度地减少光毒性并保持样本完整性。基于相位的实时成像可实现对结构和功能变化的连续、无标记追踪。该方法利用折射率作为内在成像对比机制，可量化体积、蛋白质密度和蛋白质含量等生物物理特性。&#160;成像数据进一步通过机器学习驱动的分割和特征提取进行处理，以支持一致且高通量的分析。本实验方案详细描述了在类器官研究中应用低相干HT的完整实验流程，涵盖类器官制备、成像采集以及基于机器学习的数据分析。通过整合计算分割与定量评估，该方法可实现对类器官关键特性（包括活力、结构组织性和药物反应性）的无偏倚评价。该技术能够在亚细胞分辨率下捕捉实时形态变化，因此在再生医学、疾病建模和药物筛选等基于类器官的研究中具有广泛的应用价值。本文所述的分步操作方法有助于在不同类器官系统中实现可重复性和广泛适用性。

图1 展示了sIOs的4D成像与定量分析的示意图。本方案通过四个步骤实现sIOs的连续活体成像和全面评估：培养、4D成像、图像处理和定量分析（图1D）。
经过5天的培养后，成熟的sIOs被转移至带有盖玻片底部的成像培养皿中，用于低相干全息层析成像（HT）观察（图1A）。该成像技术通过反卷积算法重建折射率（RI）断层图像（图1B），可实现对活体类器官的高分辨率、无标记成像。
随后使用基于机器学习辅助的分割方法进行图像处理，以实现精确的结构勾画（图1C）。首先，将原始折射率（RI）断层图像转换为HDF5格式，以兼容ilastik——一种基于交互式机器学习的分割工具。在ilastik中，通过训练体素级分类器生成类器官掩膜，以特异性识别类器...

我们介绍了一种利用低相干全息层析技术对类器官进行高分辨率、无标记、三维成像的逐步操作方案。本方案详细说明了类器官培养制备、成像采集以及计算图像分析的全过程，可实现对活体类器官结构动态变化及药物反应的实时可视化观察。

准确、无标记的肠道类器官成像对于研究其形态、生长动态以及对环境刺激的响应至关重要。

我们的目标是在监测类器官发育过程中及其对药物反应时的生物物理变化时，建立一种实时、无标记的成像方法。本方案通过人工智能驱动的突变分析和定量纹理筛选，支持对活体类器官进行高效成像和非侵入性药物测试，从而推动生物医学研究。我们计划进一步整合无标记三维成像与年度分析，以实现高分辨率、非侵入性的类器官研究，服务于疾病建模和精准医学。首先，从含有细胞外基质的48孔板的每个孔中吸除废弃培养基。向每个孔中加入200 µL细胞回收溶液，在4°C下孵育30分钟。使用移液器轻轻收集类器官悬液，并转移至微量离心管中。将离心管在150g下离心3分钟，然后小心移去上清液。为机械解离沉淀物，加入200 µL培养基重悬，使用P200移液器上下吹打20至30次，随后离心3分钟。离心并去除上清液后，向沉淀物中加入培养基与新鲜细胞外基质（ECM），体积比为1:4，轻轻吹打混匀。将混合物每滴15微升加入48孔板的每个孔中。将培养板倒置于37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育1小时，以使细胞外基质（ECM）聚合。聚合完成后，向每孔加入200微升新鲜培养基，并用PBS填充外周的空孔。为准备成像样品，将15微升类器官ECM滴加到1.5号盖玻片底部的成像培养皿中，在室温下孵育1分钟。将培养皿倒置放入37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育1小时。然后，轻轻加入足够的培养基，完全浸没类器官。传代后第五天，在成像前立即用 PBS 清洗样本两到三次。接着，开启环境控制器以进行成像。腔室控制器将自动将温度设置为 37 摄氏度，二氧化碳浓度设置为 5%。按下 Door 按钮以打开门。加入水以在腔室孔内形成一层薄水层。将成像培养皿放入容器支架中，插入成像腔室，并用针固定以防止移动。关闭门以避免外界光线干扰。现在，启动 TomoStudio X 软件并登录。单击“开始”以打开主窗口，然后单击左上角的“添加项目”并指定实验。确认已选择正确的培养基类型，以确保使用适当的折射率。在面板中点击目标孔，然后点击顶部的“创建”以将该孔登记为样本。接着，点击右上角的“ROI 设置”以定义培养皿中的感兴趣区域。设置完成后，点击右下角的“运行实验”以打开图像采集窗口。单击角落处的“Load Vessel”以显示明场图像。使用 Z 和 Z 按钮调整 Z 位置，使图像聚焦清晰。在“Single Imaging”选项卡中，调整 ROI 尺寸。在160微米×160微米的视野范围内捕获类器官，并采集深度达140微米的图像序列。进入“时间推移成像”选项卡以设置长期成像，设定所需的持续时间和时间间隔。点击“扫描”图标以捕获当前感兴趣区域（ROI）的位置。单击明场（BF）按钮以调节明场成像的强度和曝光值。在预览面板中移动感兴趣区域（ROI）框以选择目标区域。选定所需的感兴趣区域后，单击底部的“添加点”按钮，成像点列表将自动生成。现在，单击“采集”以开始成像并获取原始图像数据。通过单击桌面图标启动 HTX 处理服务器。将原始图像文件拖放到 HTX 处理服务器中。单击“处理”以从原始图像文件生成TCF文件。通过单击桌面图标启动TomoAnalysis Viewer。通过将处理后的TCF文件拖放到查看器窗口中来加载文件。双击文件缩略图以打开 ROI 断层图像。通过使用缩放、平移和滚动控件在 X、Y、Z 平面中导航，来查看二维视图。单击左侧的最大强度投影（MIP）渲染视图图标，切换至三维渲染模式。通过旋转、缩放和平移图像来浏览三维视图。对于基于机器学习的图像分割，将 TCF 图像文件导出为 HDF5 格式，以确保数据为多维格式，与 ilastik 兼容。打开 ilastik 并导航至新建项目。在“分割工作流程”部分选择像素分类，并将项目保存到指定文件夹中。要加载 HGF5 文件，请转到“输入数据”选项卡，点击“添加新文件”，选择相应的 H5 数据集，并确认图像通道分配正确。接着，转到“特征选择”选项卡，选择颜色、强度、边缘和纹理等特征，以优化分割效果。在“训练”选项卡中，使用不同颜色的画笔标记类器官和非类器官区域。点击“实时更新”以预览分割结果，并根据需要进行调整。完成后，进入“预测导出”选项卡。选择“简单分割”作为导出标记预测结果的来源，然后单击“全部导出”。根据分析需求，将导出格式设置为 H5 或 TIFF。进行定量分析时，请打开补充代码文件 2。在脚本中指定掩膜文件及其对应TCF文件的正确文件夹路径。运行代码以启动定量分析。该代码将计算每个数据集的类器官体积、蛋白质密度和总蛋白质含量。该图展示了用于可视化小肠类器官整体形态的高分辨率三维折射率重建结果。重建图像揭示了在三种不同光学切片深度下，对照处理组与顺铂处理组类器官之间明显的结构差异。与处理后10分钟的对照组类器官相比，顺铂处理组类器官表现出显著增大的体积、较低的蛋白密度以及更高的总蛋白含量，表明其早期即出现结构肿胀及蛋白组成改变。24小时的延时成像显示，对照剂处理的类器官保持了结构完整性，而顺铂处理的类器官则出现进行性结构退化，包括隐窝塌陷和细胞解离增加，提示存在时间依赖性的细胞毒性损伤。定量追踪证实，对照剂处理的类器官随时间推移体积和蛋白含量均有所增加，而顺铂处理的类器官在这两个参数上均呈现时间依赖性下降，表明顺铂抑制了生长并诱导了细胞降解。在24小时期间，对照剂处理的类器官蛋白密度保持稳定，而顺铂处理的类器官蛋白密度则进行性降低，提示细胞结构破坏以及因细胞脱落导致的细胞外间隙增加。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

通过低相干全息学对肠道类器官进行无标记、高分辨率 3D 成像和机器学习分析

无透镜光学断层成像是一个三维显微技术，在x、y和z方向上的空间分辨率分别达到&lt;1 μm × &lt;1 μm × &lt;3 μm，成像体积可达15–100...

无透镜片上断层显微技术结合多角度照明与像素超分辨率

光学相干断层扫描（OCT）是一种三维成像技术，可用于监测和表征多细胞肿瘤球体的生长动力学。本研究展示了基于体素计数法对肿瘤球体进行精确的体积定量分析，并利用内源性光学衰减对比实现无需标记的球体内坏死组织检测。...

利用光学相干断层扫描对三维肿瘤球体进行长期形态学与生理学监测

利用此处所述的单细胞分辨率三维成像方案，可完整捕获类器官的整个三维结构、细胞组成及其与原始组织的表型相似性。该方案适用于来源、大小和形状各异的多种类器官。...

单细胞分辨率下完整类器官的三维成像

我们介绍了连续切片带的制备方法，以及将其收集在大型转移支撑材料上以用作阵列断层成像样本的流程，同时包括在扫描电子显微镜中进行自动成像的操作步骤。该方案可实现对局部稀有事件的筛选、定位与靶向成像，并支持大规模数据的采集。...

使用扫描电子显微镜进行靶向获取体积信息的阵列断层成像工作流程

本文提供了详细、可靠且互补的实验方案，用于对厚度从100...

三维类器官和球状体模型的染色与高分辨率成像

本文介绍了一种新型培养基底的制备方案，该基底每平方毫米含有数百个微容器2，其中可培养类器官并利用高分辨率显微镜进行观察。还详细描述了细胞接种和免疫染色方案。...

一种用于类器官培养与三维成像的高通量平台

本方案描述了一种用于中高通量类器官药物筛选的半自动化方法，以及一种不依赖显微镜型号的自动化图像分析软件，可用于定量和可视化分析多参数的单个类器官药物反应，以捕捉肿瘤内异质性。...

利用宽场活细胞成像进行大规模及单肿瘤类器官分析的多参数类器官药物筛选

本文描述了一种能够在感染期间实现全器官范围内病原菌检测以及荧光报告基因活性定量的实验方法。...

高分辨率三维全器官微生物感染断层成像

该方案结合光学透明化与免疫标记技术，实现对整体视网膜类器官的全体积共聚焦成像。该方法可保持三维结构，从而实现对关键神经元通路的精细可视化，有助于深入研究视网膜成熟过程、空间组织特征，及其在疾病建模和个体化医学中的潜在应用。...

全胚层视网膜类器官的细胞分辨率成像

介绍了一种基于共聚焦拉曼显微技术的方法，可实现对植物细胞壁中木质素的无标记可视化，并可用于比较不同组织、样品或物种间的木质化程度。...

无标记 原位 植物细胞壁木质化的成像

了解低相干全息成像技术如何实现肠道类器官的无标记、高分辨率三维成像。该方法结合机器学习分析，支持实时监测类器官结构动态和药物反应，为疾病建模和精准医学研究提供非侵入性生物物理检测手段。

无标记、高分辨率三维成像结合低相干全息层析与机器学习分析肠道类器官

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