August 12th, 2025
我们提出了一种使用低相干全息断层扫描对类器官进行高分辨率、无标记和三维成像的分步协议。该协议详细介绍了类器官培养制备、成像采集和计算图像分析,从而能够实时可视化活类器官中的结构动力学和药物反应。
我们的目标是建立一种实时、无标记的成像方法,以监测活类器官在开发过程中和对药物的反应的生物物理变化。该协议有助于简化活类器官的成像规模和非侵入性药物测试,并得到人工智能驱动的突变和生物医学研究的定量质地选择的支持。我们计划进一步整合无标记 3D 成像和一年分析,以在疾病建模和精准医学中进行高分辨率、非侵入性类器官研究。
首先,从含有细胞外基质的48孔板的每个孔中吸出用过的培养基。向每个孔中加入 200 微升细胞回收溶液,并在 4 摄氏度下孵育 30 分钟。使用移液器,轻轻收集类器官悬浮液并将其转移到微量离心管中。
将试管以 150g 离心三分钟,然后小心地除去上清液。为了机械地解离沉淀,重悬于200微升培养基中,并使用P200移液器将悬浮液上下移液20至30次,然后离心三分钟。离心并除去上清液后,以一比四的比例将培养基和新鲜的细胞外基质(ECM)加入沉淀中,轻轻移液以充分混合。
将每个圆顶 15 微升混合物分配到 48 孔板的每个孔中。将板倒置在 37 摄氏度、5% 二氧化碳培养箱中一小时,以使 ECM 聚合。聚合后,向每个孔中加入200微升新鲜培养基,并用PBS填充空的外孔。
要准备用于成像的样品,将 15 微升类器官 ECM 圆顶分配到 1.5 号盖玻片底部成像培养皿上,并在室温下孵育一分钟。将板倒置在 37 摄氏度、5% 二氧化碳培养箱中一小时。然后,轻轻加入足够的培养基以完全浸没类器官。
在传代后五天,在成像前立即用PBS洗涤样品2-3次。接下来,对于成像,打开环境控制器。腔室控制器单元会自动将温度设置为 37 摄氏度,二氧化碳设置为 5%按下门按钮打开门。
加水在腔室孔内形成一层薄层。将成像皿放入容器支架中,将其插入成像室,并使用销钉固定以防止移动。关上门,防止外界光线干扰。
现在,启动 TomoStudio X 软件并登录。单击“开始”以打开主窗口,然后单击左上角的“添加项目”并分配实验。确认选择了正确的介质类型以使用适当的折射率。
单击面板中所需的孔,然后单击顶部的创建以将孔注册为标本。然后,单击右上角的 ROI 设置以定义培养皿中的感兴趣区域。设置完成后,单击右下角的 运行实验 以打开 图像采集 窗口。
单击角落的 Load Vessel 以显示明场图像。使用 Z 和 Z 按钮调整 Z 位置以使图像对焦。在“单次映像”选项卡中,调整 ROI 大小。
在 160 微米 x 160 微米的视场内捕获类器官,并获取深达 140 微米的堆栈。导航到延时成像选项卡以设置长期成像并设置所需的持续时间和间隔时间。单击“扫描”图标以捕获当前的 ROI 位置。
单击 BF 按钮可调整明场成像的强度和曝光值。移动“预览”面板中的“ROI”框以选择“ROI”。选择所需的 ROI 后,单击底部的添加点,将创建成像点列表。
现在,单击“获取”开始成像并获取原始图像数据。单击桌面图标启动 HTX 处理服务器。将原始图像文件拖放到 HTX 处理服务器。
单击“处理”以从原始图像文件生成 TCF 文件。单击桌面图标启动 TomoAnalysis Viewer。通过将已处理的 TCF 文件拖放到查看器窗口中来加载它们。
双击文件缩略图以打开 ROI 断层扫描。通过使用缩放、平移和滚动控件在 X、Y、Z 平面中导航来检查 2D 视图。单击左侧的 MIP 渲染视图图标以切换到 3D 渲染模式。
通过旋转、缩放和平移图像来导航 3D 视图。对于基于机器学习的图像分割,将 TCF 图像文件导出为 HDF5 格式,以确保数据采用多维格式,与 ilastik 兼容。打开 ilastik 并导航到新建项目。
选择 像素分类 下 分段 部分,并将项目保存在指定的文件夹中。要加载 HGF5 文件,请导航到输入数据选项卡,单击添加新文件,选择适当的 H5 数据集,然后验证正确的图像通道分配。现在,导航到 特征选择 选项卡以选择颜色、强度、边缘和纹理等特征以优化分割。
在“训练”选项卡中,使用不同颜色的画笔笔触标记类器官和非类器官区域。单击实时更新以预览分割结果并在必要时进行调整。完成后,转到 预测导出 选项卡。
选择“简单分段”作为导出标记预测的源,然后单击“全部导出”。根据分析要求将导出格式设置为 H5 或 TIFF。对于定量分析,请打开补充编码文件 2。
为脚本中的掩码文件和相应的 TCF 文件指定适当的文件夹路径。运行代码以启动定量分析。该代码将计算每个数据集的类器官体积、蛋白质密度和总蛋白质含量。
该图说明了用于可视化小肠类器官整体形态的高分辨率、三维折射率重建。渲染的重建揭示了载体处理和顺铂处理的类器官在所有三个光学切片深度上之间的明显结构差异。与载体处理的类器官相比,顺铂处理的类器官在处理后 10 分钟显示出显着更高的体积、更低的蛋白质密度和更高的总蛋白质含量,表明早期结构肿胀和蛋白质组成改变。
24 小时的延时成像显示,载体处理的类器官保持了结构完整性,而顺铂处理的类器官经历了进行性结构降解,包括隐窝塌陷和细胞解离增加,表明存在时间依赖性细胞毒性损伤。定量追踪证实,载体处理的类器官的体积和蛋白质含量随着时间的推移而增加,而顺铂处理的类器官在两个参数上都表现出时间依赖性下降,表明顺铂抑制生长并诱导细胞降解。载体处理的类器官中的蛋白质密度保持稳定,但在顺铂处理的类器官中,蛋白质密度在 24 小时内逐渐降低,这表明由于剥落而导致细胞结构崩溃和细胞外空间增加。
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本研究提出了一种用于高分辨率、无标记、三维成像的原代器官的协议,便于实时观察结构动态和药物反应。该方法利用低相干全息断层扫描技术,增强了对原代器官发育过程中生物物理变化的监测能力。
Label-free, high-resolution 3D imaging of intestinal organoids using low-coherence holotomography enables real-time, quantitative assessment of organoid morphology and drug response without phototoxicity or sample perturbation. Integration with machine learning segmentation delivers scalable, unbiased analysis of viability and structural changes, supporting predictive confidence in early discovery and preclinical research. This workflow enhances translational continuity and de-risks mechanistic evaluation for organoid-based disease modeling and pharmaceutical screening.
This method bridges early discovery, screening, and preclinical research by providing a unified, label-free imaging and analysis platform for organoid-based studies.