Name: 具有细胞分辨率的全安装视网膜类器官可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T13:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 了解全安装视网膜类器官的光学透明化与免疫标记技术，实现细胞分辨率的共聚焦显微成像。该方法揭示神经元层结构与细胞连接，为视网膜发育及疾病机制研究提供关键见解。

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我们感谢Angel Sandoval、Eric Calatayud、Gustavo Castro-Olvera、Marta Martin和Alina Hirschmann（ICFO-光子科学研究所）提供的技术支持。本研究得到以下资助机构的支持：CELLEX基金会；Mir-Puig基金会；西班牙经济与竞争力部——卓越研究中心Severo Ochoa项目&amp;#38;D（CEX2019-000910-S，[MCIN/AEI/10.13039/5001100011033]）；西班牙科学、创新与大学部—国家研究局（PID2021-122807OB-C31 和 PID21-122807OB-C32）；卡洛斯三世健康研究所（PI22/01747）；La ONCE 基金会；加泰罗尼亚自治区政府 CERCA 计划；Laserlab-Europe（欧盟 H2020 协议编号 871124）；欧洲社会基金（PRE2020-095721，M.C.）

1. 自制荧光标记二抗的制备
注意：本方法可作为使用商用荧光抗体的替代方案（有关制备荧光二抗的优势，请参见讨论部分）。此外，若需进行直接免疫荧光检测，但目标荧光一抗无法从商业途径获得时，本方案也可用于将荧光染料与一抗进行偶联。通过调整标记反应中荧光染料的用量，控制染料与抗体的比例，可获得荧光信号更强的偶联抗体。然而，自行制备的二抗稳定性较差，且最终偶联产物的浓度比商用荧光抗体低10倍。本方案改编自 Bálint 等人9所描述的研究工作。
<ol>
	<li>将1 mg荧光染料溶解于无水DMSO中，并分装至离心管中，每管含荧光染料终质量为0.02 mg。使用真空离心浓缩仪去除全部DMSO，运行时间为1小时30分钟。将分装样品于-20 ºC避光保存。对于Alexa Fluor 405，应使用超纯H2O作为分装溶剂。</li>
	<li>进行标记反应时，将一份荧光染料分装物溶解于1–10 µL DMSO中（Alexa Fluor 405使用超纯H2O）。 
	注意：DMSO的确切用量需通过前期对照偶联实验确定。当使用新批次的荧光染料（或前一批次耗尽时），或首次使用新的荧光染料进行偶联反应时，均需进行此类对照实验。对照偶联实验通过使用不同量的荧光染料进行标记反应，以确定偶联物中荧光染料与抗体的最佳比例。在本实验中，最佳比例通常介于3 µL至5 µL之间。</li>
	<li>在避光条件下，于室温（RT）在摇床上将50 µL二抗IgG（或一抗）、6 µL 1 M NaHCO3以及1–5 µL荧光染料孵育40分钟。</li>
	<li>在反应进行的同时，打开纯化凝胶过滤柱的盖子，使缓冲液自然流过，完成柱子的预处理。每根柱子（每个标记反应使用一根）用3次2–3 mL PBS冲洗进行平衡。若最后一次平衡步骤在孵育结束前完成，请重新盖上盖子以防止柱子干燥，并等待标记反应完成。 
	注意：纯化凝胶过滤柱依靠重力运行。务必确保柱子在任何时候均不干燥，否则纯化效果将受到影响。</li>
	<li>当反应完成（步骤1.3）后，向标记反应体系中加入140 µL PBS，使总体积约为200 µL，并涡旋混匀。将此溶液加至柱子中央，待样品完全进入柱体后，加入550 µL PBS推动样品。当液体停止下滴后，再加入300 µL PBS进行洗脱，并收集至1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>通过测定样品在280 nm处的吸光度以及所用荧光染料的吸光度，计算抗体浓度和标记比率。应用比尔-朗伯定律计算摩尔浓度，公式如下： 
	<img alt="IgG浓度公式，含蛋白质分析中的吸光度与校正因子参数示意图。" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq1.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 1"> 
	其中A代表吸光度，ε代表摩尔消光系数，CF280为特定荧光染料在280 nm处的吸光度值，作为校正因子。随后，抗体浓度计算如下： 
	<img alt="IgG浓度公式，Afluorophore*稀释倍数/εfluorophore，定量分析方程。" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq2.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 2"> 
	标记比率为： 
	<img alt="标记比率公式，荧光染料与IgG的摩尔比，用于荧光分析的方程。" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 3"></li>
	<li>将标记后的抗体于4 ºC避光保存，可稳定保存长达6个月。</li>
</ol>
2. 免疫荧光标记
<ol>
	<li>在室温下用 4% 多聚甲醛（PFA）固定类器官 45 分钟。 
	注意：可选步骤：将类器官与抗原修复液孵育（步骤 2.2 和 2.3），以增强抗原的免疫反应性。</li>
	<li>将 0.117 mg 柠檬酸三钠二水合物溶于超纯 H2O 中，定容至 40 mL，并调节 pH 至 9，配制抗原修复液。</li>
	<li>在 60 °C 条件下，以轻微振荡（30 rpm）将类器官与抗原修复液孵育 1 小时。</li>
	<li>在室温下，用 PBST（含 1% Triton X-100 的 PBS）对类器官进行通透处理，轻微振荡孵育 4 小时。</li>
	<li>在室温下，用封闭液（含 2% 牛血清白蛋白（BSA）和 0.1% Triton X-100）封闭类器官，孵育过夜（或超过 1 天）。 
	注意：一抗和二抗的浓度取决于具体抗体。对于整体样本的免疫荧光染色，我们使用的抗体浓度高于切片样本。一抗通常使用 10 µg/mL 的浓度，在大多数情况下相当于原液稀释 1:100（表 1）。我们自制的二抗使用浓度为 20–50 µg/mL。</li>
	<li>将类器官与用洗涤液（含 0.1% BSA 和 0.1% Triton X-100）稀释的一抗在 4 °C 条件下孵育 2 天，并保持轻微振荡。</li>
	<li>在室温下，用洗涤液轻微振荡洗涤类器官，每次 15 分钟，共洗涤 3 次。</li>
	<li>将类器官与用洗涤液稀释的二抗在 4 °C 条件下孵育 2 天，并保持轻微振荡。</li>
	<li>在室温下，用洗涤液轻微振荡洗涤类器官，每次 15 分钟，共洗涤 3 次。 
	注意：免疫标记完成后，可孵育所选的荧光染料。我们通常使用荧光核染料，如 DAPI（1:1,000）和 DRAQ5（1:500），或鬼笔环肽（phalloidin，1:100）来显示肌动蛋白丝网络。</li>
	<li>将类器官与用洗涤液稀释的荧光染料在室温下孵育 1 小时，并保持轻微振荡。</li>
	<li>在室温下，用洗涤液轻微振荡洗涤类器官，每次 15 分钟，共洗涤 3 次。</li>
</ol>
3. 使用 FluoClear BABB 进行光学透明化
注意：1-丙醇可能会损坏塑料容器，尤其是长期接触的情况下。为安全起见，请使用玻璃容器。
<ol>
	<li>脱水步骤
	<ol>
		<li>配制超纯水中的1-丙醇溶液2O 按指定百分比（15%、30%、45%、60%、75%、90%）加入，然后用三甲胺调节 pH 至 9.5。 
		警告：三乙胺吸入有毒。应在通风橱中操作。溶液若储存得当（密封良好的容器），可重复使用。使用前需调节pH值。</li>
		<li>将样品分别在浓度递增的1-丙醇溶液（15%、30%、45%、60%、75%、90%）中孵育，每种浓度孵育2小时，孵育温度为 30 °C 轻柔振荡。</li>
		<li>在100% 1-丙醇中孵育样品，过夜，置于 30 °C 轻柔振荡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>清除步骤 
	警告：BABB 是一种强效溶剂混合物，可溶解或严重损坏多种塑料。为确保安全，请使用带有兼容盖子的玻璃容器，并在通风橱内操作。
	<ol>
		<li>按1:2的比例混合苯甲醇（BA）与苯甲酸苄酯（BB）以配制BABB。</li>
		<li>将样本在室温下浸入BABB中过夜。</li>
		<li>成像前更换BABB溶液。 
		注意：对于直径约1 mm的类器官，BABB可在数十分钟内产生明显的透明化效果。根据样本的大小和性质，透明化程度可能有所不同，和/或需要更长的透明化溶液处理时间。我们建议在BABB浸泡前后分别采集图像，以优化透明化方案。</li>
		<li>将BABB透明化样品长期保存于BABB溶液中 4 °C避光以保护荧光。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 整体样本成像采集
<ol>
	<li>使用玻璃移液器将类器官置于含有一滴BABB的玻璃底培养皿中。确保样本与盖玻片表面接触。 
	注意：请小心操作，避免含有样本的BABB液滴接触培养皿的塑料边缘，否则会溶解塑料，从而损害样本并影响成像质量。</li>
	<li>使用配备低倍和高倍物镜的倒置共聚焦激光扫描显微镜，采集Z轴层扫图像，以获得具有细胞分辨率的样本完整三维结构信息。 
	注：本研究中使用了10倍数值孔径（NA）0.4的空气物镜和63倍NA 1.4的油镜，Z轴步长分别为3.5 µm和1 µm。</li>
</ol>
5. 图像处理
<ol>
	<li>根据透明化溶液与浸没介质之间折射率（RI）的不匹配，重新校准Z轴堆栈采集的步长。
	<ol>
		<li>按以下方式计算重新校准后的步长： 
		<img alt="显微镜步长重新校准公式，涉及折射率。" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 4"> 
		对于嵌入BABB中的样品，使用空气物镜且步长为3.5 µm的情况，计算如下： 
		<img alt="步长重新校准计算公式；光学测量精度方程。" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq5.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 5"></li>
		<li>在ImageJ中，更改体素深度（点击图像 | 属性...），设置为重新计算的步长。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生成Z轴堆栈的图像投影。
	<ol>
		<li>使用ImageJ，沿深度方向检查Z轴堆栈（点击图像 | 堆栈 | 正交视图）。将显示视网膜类器官的XY、XZ和YZ视图。</li>
		<li>保存感兴趣的区域（点击文件 | 另存为...）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用处理软件（参见材料表）创建Z轴堆栈三维渲染的动画。
	<ol>
		<li>通过勾选复选框，选择要可视化的通道。</li>
		<li>调整Z平面以观察样品内部（在复选框中启用裁剪功能）。</li>
		<li>使用视频编辑器录制动画（在复选框中启用视频编辑器）。直接使用鼠标拖放并进行缩放操作。点击添加以将不同片段加入动画。若需调整Z平面，请启用裁剪平面选项（点击设置... | 勾选裁剪平面框）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文所述方案有助于研究视网膜类器官在不同成熟阶段形成细胞的空间和时间分布，同时保持其天然的三维结构，这对于在个性化医疗未来背景下理解这些模型至关重要。该方法能够清晰展示视网膜在不同层次及特定细胞类型水平上的精细结构，可在维持整体三维环境的前提下，实现对亚细胞结构的可视化观察。
全组织成像的替代方法是对样本进行后续处理，以便在常规切片（石蜡包埋或冷冻保存）上进行成像。尽管切片能够提供有关蛋白质和结构定位的有价值信息，但这些数据仅限于单一平面，限制了对细胞空间连接关系的理解。因此，诸如视锥细胞与视杆细胞的比例，或特定区域轴突束的形成等特征可能无法被准确呈现，从而增加了三维结构解释的复杂性。视网膜类器官具有高度异质性，不同区域可能含有不同类型的细胞，和/或表现出不同程度的复杂性与分化状态。全组织成像可解决这一问题，因为它能够在整体上分析异质性梯度，而无需依赖于可能无法代表样本全貌的少数切片的选择。
光片荧光显微镜（LSFM）21,22,23 可作为激光扫描共聚焦显微镜的替代方法。在光片荧光显微镜中，样品通过一束薄薄的光平面进行照明 片 厚度仅为几微米的光层对样品进行照明，并使用相机检测来自该照明光学切片的所有荧光信号。光片荧光显微镜（LSFM）是一种基于宽场检测的技术，能够以极高的效率实现大体积样本（最大可达厘米级）的快速成像，同时显著减少光漂白和光毒性效应。然而，类器官可能表现出明显的球面像差，因为光线穿过曲面时，其折射程度会因入射角不同而有所差异。在本实验中，这种畸变导致了焦点丢失，使图像模糊，从而降低了深层结构的分辨率。对于直径约1毫米的视网膜类器官成像，激光扫描共聚焦显微镜被证明是最有效的成像方法。
本方案根据我们的实验需求定制，可作为研究人员开展光学透明化视网膜类器官整体成像的起始指南，若实验条件不同，则应进行相应调整。本节将详细描述该方法的关键步骤、改进措施及局限性。
一个关键步骤是选择透明化方案。需要考虑多个标准。首先，应考虑样本的类型。骨组织的透明化与脑组织的透明化不同，视网膜类器官的透明化也不同于胃类器官的透明化，因为每种样本都需要采用不同的方法。为了观察不同类型类器官的透明化效果，必须查阅文献，以确定已针对特定样本优化过的透明化方案。果糖/甘油是一种快速且无毒的透明化方法，已被证明适用于多种组织来源的类器官（如人呼吸道、结肠、肾脏、肝脏和乳腺肿瘤类器官，以及小鼠乳腺类器官）12，但该方法不适用于使人视网膜类器官透明化。据我们所知，目前尚无研究报道果糖/甘油法在神经组织或类器官中的应用。因此，我们认为该透明化方法不适用于神经组织的透明化处理。有必要进一步研究以阐明这种不兼容性的根本原因。
另一个需要考虑的关键因素是所需的视场（FoV），因为它直接影响成像策略和光学元件的选择。大视场通常使用低倍物镜实现，这些物镜通常设计为无需浸没介质（例如空气，折射率 RI = 1.00）下使用。当对经BABB透明化处理的样品（折射率 RI = 1.56）进行成像时，这些物镜会遇到更大的折射率失配，导致成像深度聚焦偏移，必须在后期处理中予以校正。相比之下，油浸物镜（折射率 RI = 1.51）与BABB等透明化溶液（折射率 RI = 1.56）之间的折射率失配较小，因此无需重新校准。
简单的浸渍法通常无法实现高透明度，因此不适用于获取整体样本的高质量图像。组织透明化方案会因样本的膨胀或收缩而影响有效分辨率。根据实验目的的不同，膨胀或收缩可能各有优势。能够扩增样本的方案可以提升相同光学系统下细微结构的分辨率，使得原本无法清晰显示的细节变得可见。当需要观察过大的样本（否则无法放入样品室）或需要适应物镜工作距离时，收缩则可能是有利的。然而，由于收缩会压缩样本并可能导致内部距离发生形变，因此该技术不适用于尺寸评估或细胞间距离的精确测量。
另一个需要考虑的重要因素是与荧光蛋白的兼容性。大多数基于有机溶剂的方案在使用折射率匹配溶液包埋时，由于需要高温或会降解荧光蛋白，从而导致荧光蛋白淬灭。幸运的是，大多数方法与免疫标记技术兼容。然而，每个抗原表位的兼容性均需通过实验加以验证。
此外，大分子IgG穿过组织时可能受阻，从而降低染色效率，并将靶向结构的可视化局限于样本表面。对整体样本进行抗体染色可能需要数天甚至数周时间，具体取决于样本的大小和性质，这显著延长了实验方案的持续时间。
最后，必须考虑与光学仪器的兼容性。大多数基于有机溶剂的方法（ECi 除外）具有很强的腐蚀性，无法与商用样品腔室和浸没式物镜在化学上兼容。此外，一些透明化溶液的折射率与现有物镜（通常为水镜）所需范围不匹配。
该方案中有若干步骤需要特别注意。FluoClear BABB 作为一种疏水性透明方法，需要预先进行脱水处理。pH 值在维持内源性蛋白（如 GFP）荧光特性方面起着重要作用，因此必须确保酒精溶液的 pH 值已正确调节。脱水是实现完全透明的关键步骤。通过将样品依次浸入浓度递增的酒精溶液中孵育，可获得最佳效果。
样本的大小在抗体能否到达其特异性靶标方面起着重要作用。抗体可能无法均匀渗透，而滞留在样本外部。若出现这种情况，可考虑更换其他类型的去污剂（如 Tween-20 或皂苷），或提高去污剂及抗体的浓度和孵育时间。如果这些调整仍不足够，还可采用其他策略来改善抗体的通透性。对于较大样本（厘米级）的整体免疫标记，研究人员发现十二烷基硫酸钠（SDS）可促进抗体更深入地渗透24。SDS 会导致抗体三级结构的部分丧失，从而有效地使蛋白线性化，使其更易深入组织内部。随后通过洗去 SDS，可恢复抗体的抗原结合能力，从而实现对较厚组织更均匀的染色，并减少样本表面标记较强而内部较弱的常见梯度现象。
自行制备荧光标记的二抗具有多项优势，可为免疫标记实验设计提供更高的灵活性，允许自主选择特定的荧光染料与二抗组合，从而增加同一样本中可同时使用的荧光颜色数量。此外，还可优化荧光染料与抗体的标记比例，因此通常具有更强的荧光亮度。然而，也需考虑一些因素。自制二抗通常比商业化产品稳定性较差，应尽量使用新鲜制备的抗体。大多数自制二抗在4 °C条件下可保持与抗原的结合能力3至6个月，但其稳定性需通过实验具体确定，因为某些组合可能降解更快。此外，某些抗体-荧光染料的组合可能改变抗体对其表位的亲和力，导致出现部分或完全的非特异性标记。为确保实验结果的可靠性，建议在将自制二抗用于正式实验样本前，先使用对照样本（如培养细胞）进行验证测试。
该优化方案结合光学透明化与免疫标记技术，便于对整体视网膜类器官进行共聚焦成像。该方法可保持类器官的结构完整性，并实现对其内部关键视网膜细胞类型的鉴定。因此，本方案为研究人员提供了一种强大的工具，用于研究视网膜类器官的成熟过程及空间组织结构。

视网膜类器官
视网膜类器官是模拟人类视网膜的复杂三维结构，为研究视网膜发育、疾病机制及潜在治疗策略提供了重要的研究平台1它们保持了视网膜天然的三维结构，表现出转录组保真性和功能完整性，能够重现光转导和突触连接2此外，它们能够高度模拟 体内 发育3,4，相较于平面细胞培养，能够更真实地模拟生理环境。在先前的研究中，Isla-Magrané 等人建立了一种两步法方案，利用人诱导性多能干细胞（hiPSC）获得多眼样类器官，以模拟人类眼睛发育过程中的细胞特征5,6由于胎儿组织稀缺，人类眼睛发育的研究一直局限于解剖学研究。
采用本方案获得的视网膜类器官表现出正确的分层结构，包含所有主要的视网膜细胞亚型，如光感受器细胞、双极细胞、神经节细胞、无长突细胞和水平细胞以及巨胶质细胞，同时具备关键的形态学特征、正确的空间组织结构和细胞连接。尽管类器官模型具有潜在应用价值，但其存在显著的变异性，导致难以获得一致的结果。因此，迫切需要在更可靠的人源模型中应用多种先进技术。迄今为止，这些类器官仅通过组织学切片进行研究，因其复杂的细胞组成、高细胞密度和较大尺寸阻碍了光线穿透，导致深层区域的光学成像效果较差，从而限制了对其进行全面分析。
整体成像
传统的组织学技术涉及对固定组织进行切片和染色，能够提供特定区域的详细信息，但无法捕捉整个类器官的整体结构及其内部的空间关系。为克服这一局限，全组织成像成为研究视网膜类器官的一种重要工具。全组织成像可在保持类器官完整三维结构的前提下，实现对其整体的可视化，从而保留细胞类型和细胞外基质成分的空间分布。该方法特别适用于研究类器官内部及类器官之间的细胞组成，有助于更全面地理解其发育过程和功能组织结构。然而，由于视网膜类器官细胞密度高且结构紧密，因而具有不透明性（图1，未透明化）。样品固有的不透明性会导致光散射，从而阻碍显微镜对内部结构的精细观察。在此背景下，光学透明技术应运而生，成为一种强有力的解决方案。
光学透明技术
光学透明是指通过物理化学处理，使厚的生物样本变得透明，其原理是均质化组织的折射率（RI）梯度，使其与透明剂的折射率相匹配，并去除吸光物质7。这些方法可显著减少光散射，提高透明度。这种转变使我们能够穿透整个视网膜类器官进行观察，从而通过整体封片成像技术对其复杂的细胞结构和形态进行全方位分析。在实际操作中，这一过程通过将样本浸入高折射率物质中，并去除脂质和色素来实现。
现有的透明化方法在多个方面存在差异（例如透明程度、与显微技术的兼容性、适用的样本类型和荧光分子、可行性及所需时间），但尚无一种方法可被视为最佳的通用方案8。这些方法可归纳为四大类：（1）简单浸入法，（2）基于有机溶剂的疏水法，（3）基于过度水合的方法，以及（4）基于组织转化或水凝胶包埋的方法，Avilov 等人对此进行了很好的总结7。所有方法均包含折射率匹配步骤，通常是将样本浸入与组织平均折射率相匹配的溶液中。在疏水法中，通过将样本依次浸入浓度递增的有机溶剂（如甲醇或丙醇）中，以去除脂质和水分。
本方案是一种优化的方法，结合了光学透明化与免疫标记技术，可实现视网膜类器官的完整封片三维可视化，利用共聚焦显微镜进行全体积成像，同时保持其结构完整性。该方法能够识别类器官内的关键视网膜细胞类型，为研究人员提供了一种强有力的工具，可在生理相关背景下研究视网膜类器官的成熟过程及空间组织结构。

<table><tbody><tr><td>10倍 NA0.40 干式物镜</td><td>Leica</td><td>HC PL APO CS2</td><td>-</td></tr><tr><td>63倍 NA1.40 油浸物镜</td><td>Leica</td><td>HC PL APO CS2</td><td>-</td></tr><tr><td>抗GFP抗体</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>-</td></tr><tr><td>苯甲醇（BA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13162</td><td>-</td></tr><tr><td>苯甲酸苄酯（BB）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W213802</td><td>-</td></tr><tr><td>底部玻璃培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>-</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>-</td></tr><tr><td>Chx10抗体</td><td>Sta Cruz Biotech</td><td>sc-365519</td><td>-</td></tr><tr><td>Cytiva Illustra Nap-5凝胶过滤柱，Sephadex G-25</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17-0853-02</td><td>-</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>-</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td>-</td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Thermofisher</td><td>62251</td><td>-</td></tr><tr><td>染料（羧酸，琥珀酰亚胺酯）</td><td>Invitrogen或Abberior</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>ImageJ/Fiji&amp;nbsp;</td><td>NIH</td><td>&amp;nbsp;v1.50i</td><td>-</td></tr><tr><td>倒置共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Leica microsystems</td><td>TCS SP8 STED 3X-FALCON</td><td>-</td></tr><tr><td>LAS X 3D图像处理软件</td><td>Leica microsystems</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>mQ H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>-</td><td>-</td><td>Synergy纯水净化系统提供的超纯水</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Acros Organics</td><td>424270010</td><td>-</td></tr><tr><td>未标记的二抗IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>视蛋白蓝色抗体</td><td>Millipore&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>AB5407&amp;nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>视蛋白RG抗体</td><td>Millipore</td><td>AB5745&amp;nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>4%多聚甲醛（PFA）</td><td>Thermo scientific&amp;nbsp;</td><td>J199943-K2</td><td>-</td></tr><tr><td>PBS溶液</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td>-</td></tr><tr><td>鬼笔环肽标记探针</td><td>Thermofisher</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>10010023</td><td>-</td></tr><tr><td>RECOV抗体</td><td>Millipore</td><td>AB5585-I&amp;nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>RHO（RET-P1）抗体</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O4886&amp;nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>柠檬酸三钠二水合物&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8532</td><td>-</td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td>-</td></tr><tr><td>TUJ1抗体</td><td>Covance&amp;nbsp;</td><td>MMS-435P&amp;nbsp;</td><td>-</td></tr></tbody></table>

全胚层视网膜类器官的细胞分辨率成像

Whole-mount Retinal Organoid Visualization with Cellular Resolution

由人诱导性多能干细胞衍生的视网膜类器官是复杂的三维结构，能够模拟人类视网膜，为研究视网膜发育、疾病机制及潜在治疗策略提供了强有力的平台。此外，由于这些类器官来源于患者，其在个性化医疗中展现出巨大潜力，因而正变得日益流行。与传统的二维细胞培养相比，视网膜类器官保留了视网膜固有的三维结构，从而实现了更真实的组织表征，并支持更具生理相关性的研究。然而，其结构的复杂性、高细胞密度以及多样的组成成分给表征工作带来了显著挑战。
为了应对这些挑战，并在保留三维结构的前提下增进对视网膜类器官成熟过程的理解，我们结合光学透明化方法与免疫标记技术，利用共聚焦显微镜对整体安装的类器官进行全结构可视化。为此，我们采用了一种适用于低数值孔径和高数值孔径物镜的透明化方法，从而实现全体积成像，并以细胞分辨率捕获特定感兴趣区域。通过该方法，我们鉴定了负责视觉信息传递的三条主要神经元通路在三维空间中的形态与分布：视锥和视杆光感受器、双极细胞以及节细胞。我们的研究结果进一步阐明了可视化技术在解析类器官内视网膜细胞空间组织方面的应用价值。

该方案结合光学透明化与免疫标记技术，实现对整体视网膜类器官的全体积共聚焦成像。该方法可保持三维结构，从而实现对关键神经元通路的精细可视化，有助于深入研究视网膜成熟过程、空间组织特征，及其在疾病建模和个体化医学中的潜在应用。

由人诱导多能干细胞衍生的视网膜类器官是复杂的三维结构，可模拟人类视网膜，为……提供了一个强大的平台

我们的研究致力于开发和研究视网膜类器官，这类器官可作为人类体外模型，用于研究人类视网膜的形成过程、疾病的影响机制以及潜在的治疗方法。为了推动再生医学领域的研究，我们采用三维视网膜类器官结合光学透明化和免疫标记技术，通过共聚焦显微镜对整个结构进行可视化，并研究视网膜细胞的特殊组织结构。整体成像面临诸多挑战，例如在致密组织中抗体渗透不均以及类器官中的球面像差，这些问题会导致组织可视化过程中出现表面标记偏好和焦点丢失。我们的方法揭示了视网膜细胞的连接方式、细胞类型及其三维组织结构，为理解视网膜疾病的潜在病因提供了关键见解。[讲师] 首先，取用溶解于无水DMSO中、已脱水并冷冻保存的荧光染料分装样品。向一份分装样品中加入1至10微升DMSO。然后，将50微升二抗免疫球蛋白G或一抗、6微升1摩尔碳酸氢钠以及1至5微升荧光染料混合，在室温下避光于摇床上孵育40分钟。在反应进行的同时，取下纯化凝胶过滤柱的盖子，使缓冲液流过柱体。用2至3毫升PBS重复过柱三次，以平衡层析柱。若最后一次平衡在孵育结束前完成，请重新盖上盖子以防止柱体干涸，并等待反应完成。孵育结束后，向标记反应体系中加入140微升PBS，使总体积达到约200微升，并进行涡旋混匀。将溶液加至柱体中心位置，使其进入柱内。待最后一滴液体完全进入后，用550微升PBS推动溶液。当液体停止下滴时，用300微升PBS洗脱，并收集至1.5毫升微量离心管中。测定样品在280纳米以及荧光染料特异性波长处的吸光度，以计算抗体浓度和标记比率。将标记好的抗体于4摄氏度避光保存，可稳定长达六个月。用4%多聚甲醛在室温下固定视网膜类器官45分钟。固定后，在类器官上覆盖抗原修复液，将培养皿置于60摄氏度、以每分钟30转的轻微振荡条件下孵育1小时。接下来，使用含1% Triton X-100的PBS对类器官进行通透处理，在室温下轻微振荡孵育4小时。随后，在含2% BSA和0.1% Triton X-100的溶液中于室温封闭类器官，过夜或超过一天。次日，向类器官中加入稀释后的一抗，于4摄氏度轻微振荡孵育两天。用洗涤液在室温下轻微振荡洗涤类器官三次，每次15分钟。然后加入稀释后的二抗溶液，于4摄氏度轻微振荡孵育两天。按照前述方法再次洗涤类器官后，将类器官与稀释于洗涤液中的荧光染料在室温下共同孵育1小时，同时保持轻微振荡。之后再次进行洗涤。接下来，用超纯水配制15%、30%、45%、60%、75%和90%浓度的1-丙醇溶液，并用三甲胺调节各溶液pH至9.5。将样品依次置于浓度递增的1-丙醇溶液中，在30摄氏度下每步脱水2小时，同时保持轻微振荡。然后将样品转移至100% 1-丙醇溶液中，在30摄氏度下轻微振荡过夜孵育。为实现样品透明化，按1:2比例配制苯甲醇与苯甲酸苄酯混合液，制成BABB溶液。将样品浸入BABB溶液中，在室温下过夜处理。成像前更换新鲜的BABB溶液。使用玻璃移液器将类器官置于含一滴BABB的玻璃底培养皿中，确保其接触盖玻片表面。现在，使用倒置共聚焦激光扫描显微镜，结合低倍与高倍物镜，获取Z轴层扫图像以实现三维细胞分辨率。通过考虑透明化溶液与浸没介质之间折射率不匹配的问题，重新校准Z轴层扫采集的步长。启动ImageJ软件，通过选择“图像”并点击“属性”来更新体素深度，从而生成Z轴层扫图像的投影图。通过选择“图像”→“堆栈”→“正交视图”，检查Z轴层扫深度，显示视网膜类器官的XY、XZ和YZ视图。通过点击“文件”并选择“另存为”保存所需区域。最后，使用图像处理软件生成Z轴层扫三维重建图像的动画。经果糖甘油法透明化的视网膜类器官透明度提升最小，阻碍了对类器官核心区域的观察。ECI透明化方法改善了视网膜各层的可视性，但仍因持续的光散射而无法揭示类器官核心。经Fluoclear BABB透明化的类器官表现出最高的透明度，能够清晰显示皮层和核心结构，并保持一致的荧光信号。在明场图像中，ECI和Fluoclear BABB透明化处理的类器官均表现出明显的收缩现象，这是由于脱水步骤所致。BABB引起的收缩增加了样品的致密性，使得可利用高倍物镜对更深层结构进行成像。体外培养40天时，TUJ1免疫标记显示仅存在单层薄的神经元层，无明显分层结构。至90天时，细胞密集分布于顶端区域；到170天时，类器官已表现出清晰的分层组织特征，并形成明确的顶端区。在200天时，细长的细胞突起从表面向内部延伸；到250天时，类器官发育出三个明确的视网膜层。随着成熟过程，神经纤维从类器官中心向外周延伸，在体外培养250天时变得更为粗壮且结构复杂。表达蓝光和绿光/红光视蛋白的视锥光感受器在晚期出现，呈现细长形态并具有明亮的末端。视杆光感受器通过其中央分布的细胞核及周边的视蛋白分布得以识别。Chx10阳性细胞最初广泛分布，但在类器官成熟过程中逐渐特异性定位于内核层。经BABB透明化处理后，内源性GCaMP6s的表达得以保留，长期固定后仍可在神经视网膜中检测到GFP信号。

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科研

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Neuroscience

神经科学

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本文介绍了一种将人多能干细胞（hPSC）来源的视网膜组织移植到大型动物模型视网膜下腔的外科手术技术。...

在猫科大型动物模型中进行人胚胎干细胞来源视网膜组织的视网膜下移植

本研究旨在开发一种新型的人类类器官视网膜培养（HORC）模型，以防止在移植体操作过程中破坏视网膜的完整性。该目标通过将视网膜与其上方的玻璃体以及下方的视网膜色素 上皮-脉络膜（RPE-脉络膜）和巩膜共同培养来实现。...

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由人多能干细胞定向诱导视网膜类器官

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由健康及视网膜疾病特异性人诱导性多能干细胞生成视网膜类器官

本方案为视网膜类器官样本的透射电子显微镜制备提供了优化且详细的实验流程，适用于对成熟视网膜类器官中突触结构进行分析的相关研究。...

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小胶质细胞是视网膜中独特的常驻免疫细胞，在多种视网膜变性疾病中发挥关键作用。建立视网膜类器官与小胶质细胞的共培养模型，有助于更深入理解视网膜疾病的发病机制及发展过程。...

利用小胶质细胞构建视网膜类器官

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通过免疫染色法对小鼠视网膜血管周细胞进行三维可视化观察

视网膜在其层状结构中表现出复杂的空间组织。现代空间转录组学和测序技术需要厚度小于&lt; 20 µm的组织切片，这限制了其在视网膜研究中的应用。本新鲜冷冻冷冻切片方法可在保持视网膜平面空间关系的同时，制备小鼠视网膜的薄层en...

En face 小鼠视网膜冷冻切片用于高维空间分子分析

了解全安装视网膜类器官的光学透明化与免疫标记技术，实现细胞分辨率的共聚焦显微成像。该方法揭示神经元层结构与细胞连接，为视网膜发育及疾病机制研究提供关键见解。

全胚层视网膜类器官的细胞分辨率成像

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