具有细胞分辨率的全安装视网膜类器官可视化

该协议结合了光学透明化和免疫标记，用于全安装视网膜类器官的全体积共聚焦成像。它保留了 3D 结构，能够详细可视化关键神经元通路，改善了对视网膜成熟、空间组织及其在疾病建模和个性化医疗中的潜在应用的研究。

我们的工作重点是开发和研究视网膜类器官，作为人类体外模型，以研究人类视网膜如何形成、疾病如何影响以及我们如何治疗它们。

为了推进再生医学领域的研究，我们使用3D视网膜类器官结合光学透明和免疫标记来可视化整个结构，并通过共聚焦显微镜研究视网膜细胞的特殊组织。

全贴片成像面临着挑战，例如抗体在致密组织中的渗透不均匀和类器官中的球面像差，这会导致组织可视化过程中的表面偏差标记和焦点损失。

我们的方法揭示了 3D 组织下的视网膜细胞连接、细胞类型，为视网膜疾病的根本原因提供了重要的见解。

[导师]首先，获得溶解在无水DMSO中的荧光团等分试样，脱水并冷冻。将 1 至 10 微升 DMSO 加入等分试样中。现在，将50微升二级免疫球蛋白G或一抗，6微升一摩尔碳酸氢钠和1至5微升荧光团混合，并在室温下在摇摆平台上孵育40分钟，避光。在反应进行时，取下纯化尺寸排阻柱的盖子，让缓冲液通过。通过将两到三毫升的PBS通过色谱柱运行三轮来平衡色谱柱。如果最后一次平衡在孵育结束前完成，请将盖子放回原处以避免它们拉扯，并等待反应完成。孵育后，向标记反应中加入140微升PBS，使体积达到约200微升，并涡旋。将溶液添加到色谱柱的中心，让它进入色谱柱。在最后一滴逃脱后，用 550 微升 PBS 推动溶液。当液体停止下降时，用300微升PBS洗脱，并收集在1.5毫升微量离心管中。测量样品在 280 纳米和荧光团特异性波长下的吸光度，以计算抗体浓度和标记比。将标记的抗体储存在 4 摄氏度下，避光，最多六个月。在室温下用4%多对异形醛固定视网膜类器官45分钟。固定后，在类器官上加入抗原修复液，将培养皿在60摄氏度下孵育，以每分钟30转的速度轻轻摇晃一小时。接下来，用含有 1% Triton X-100 的 PBS 透化类器官。将混合物在室温下孵育，轻轻摇动四个小时。现在，在室温下用 0.1% Triton X-100 封闭 2% BSA 中的类器官过夜或一天以上。第二天，将稀释的一抗添加到类器官中。在四摄氏度下孵育两天，轻轻摇晃。在室温下在洗涤液中洗涤类器官三次，每次15分钟，轻轻摇晃。现在，加入稀释溶液二抗，在四摄氏度下轻轻摇晃孵育两天。如前所述洗涤类器官后，将类器官与在室温下在洗涤溶液中稀释的荧光染料一起孵育一小时，并轻轻摇动。然后，再次清洗。接下来，在超纯水中制备浓度为 15%、30%、45%、60%、75% 和 90% 的 1-丙醇溶液，并用三甲胺将每个溶液调节至 pH 9.5。在30摄氏度下，以递增的梯度将样品依次脱水，每次两小时，轻轻摇动。然后，将样品转移到100%1-丙醇溶液中，并在30摄氏度下轻轻摇晃孵育过夜。为了样品澄清，以一比二的比例制备苯甲醇和苯甲酸苄酯混合物，制成BABB溶液。将样品在室温下浸入 BABB 中过夜。成像前刷新 BABB 溶液。使用玻璃移液器，将类器官放入玻璃底培养皿中，滴一滴BABB，确保其接触盖玻片的表面。现在，使用具有低倍率和高倍率物镜的倒置共聚焦激光扫描显微镜来获取 Z 堆栈图像以获得 3D 细胞分辨率。通过考虑透明溶液和浸没介质之间的折射率不匹配，重新校准 Z 堆栈采集的步长。现在，启动 ImageJ，通过选择 Image 并单击 Properties 来更新体素深度以创建 Z 堆栈的图像投影。通过选择图像，然后选择堆栈，然后选择正交视图以显示视网膜类器官的 XY、XZ 和 YZ 视图来检查 Z 堆栈深度。通过单击“文件”并选择“另存为”来保存所需的区域。 最后，使用处理软件创建 Z 堆栈 3D 渲染的动画。果糖甘油清除的视网膜类器官的透明度改善最小，阻碍了类器官核心的可视化。ECI 清除改善了视网膜层的可视化，但由于持续的光散射，仍然无法揭示类器官核心。Fluoclear BABB 透明的类器官表现出最高的透明度，以一致的荧光清楚地显示皮层和核心。由于脱水步骤，ECI 和 fluoclear BABB 清除的类器官在明场图像中都表现出明显的收缩。BABB 诱导的收缩提高了样品的致密性，从而能够使用高放大倍率物镜对更深的结构进行成像。体外 40 天的 TUJ1 免疫标记显示单个薄神经元层，没有可见的分层。到 90 天时，细胞密集地分布在顶端区域，在 170 天时，类器官表现出明显的分层组织迹象，具有明确的顶端区域。在 200 天时，细长的细胞突起从表面向内延伸到核心，类器官在 250 天时发育成三个不同的视网膜层。神经元纤维在成熟过程中从类器官中心向外围延伸，在体外 250 天变得更粗、更复杂。表达蓝色和绿色/红色视蛋白的视锥形感光细胞在晚期出现，并表现出细长的形态和明亮的尖端。表达视紫红质的视杆感光器通过其中央核和外周视蛋白分布进行鉴定。Chx10阳性细胞最初分布广泛，但后来在类器官成熟过程中特异性定位于内核层。BABB清除后内源性GCaMP6s表达得以保留，长期固定后在神经视网膜中可检测到GFP信号。