Name: 用于开发用于细菌、肠道和免疫细胞毒理学和免疫调节疗法的异步系统的 3D Flipwell 工程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-17T12:40:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 了解3D Flipwell共培养系统的构建方法，用于模拟肠道黏膜环境并评估药物反应。该技术可研究肠道细菌、上皮细胞与巨噬细胞之间的相互作用，为免疫调节疗法开发提供新策略。

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第一作者衷心感谢富田纱织博士在远距离情况下仍提供的卓越指导能力、持续的指导与支持，以及娴熟且持续的项目设计，这些为出色的学习机会创造了条件。作者们还感谢Sharma博士在微生物学方面的专业知识与指导，感谢Veani R. Fernando博士在THP-1巨噬细胞制备方面的贡献，同时感谢Gebremichal Gebretsadik Weidengus和Islam博士在拍摄前协助准备所需的培养基、细胞及细菌培养物。
作者还感谢大都会医疗中心/癌症生物学部在拍摄过程中提供的热情接待和支持。主要作者感谢密歇根大学的Erin Janssen博士、Eliza Tsou博士以及Caroline Foster为本项目提供的支持，包括备用物资和拍摄期间使用的XL号实验服。
此外，作者感谢托莱多大学电子显微镜中心的 Andrew Kleinhenz 博士和 William T. Gunning 博士，以及仪器中心的 Cassandra Zamora 和 Kristin Kirschbaum 在电镜成像方面的建设性建议。本研究得到了托莱多大学健康科学校区医学院与生命科学学院癌症生物学系为 S.F. 提供的启动资金；俄亥俄州癌症研究资助（项目编号：5017）支持 S.F.；医学研究学会（托莱多基金会，编号：206298）奖项支持 S.F.；美国癌症学会研究学者资助（RSG-18-238-01-CSM）支持 S.F.；以及美国国家癌症研究所研究资助（R01CA248304）支持 S.F.。

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作者声明不存在利益冲突。作者在此声明，在法律允许的最大范围内，对所有明示或暗示的保证概不负责。在任何情况下，作者均不承担因使用Flipwell构建工具、BSL试剂、细胞系、细菌培养物，或在厌氧箱的厌氧环境中使用Flipwell系统所引起或相关的特殊、偶然、间接、惩罚性、多重或继发性损害责任，无论该责任基于任何成文法、合同、侵权或其他法律理论。该责任限制包括但不限于本文未明确描述的任何Flipwell使用方式。

重建肠道黏膜结构 体外我们设计了一种简单的共培养系统，该系统包含分层排列的肠道细菌、分泌黏液的结肠上皮细胞以及巨噬细胞。这种多层共培养系统使我们能够研究细菌分泌组、肠道上皮细胞与巨噬细胞之间相互作用对免疫原性重编程及黏膜防御机制的诱导作用。
制备3D Flipwell时一个重要的注意事项是，组装必须在无菌环境中进行，并在接种细胞前用紫外光灭菌数天。我们使用配备有正常功能紫外灯的BSL2级生物安全柜完成灭菌过程。在初始灭菌步骤中，按照说明使用了已灭菌的工具和70%乙醇。在构建阶段，经过多次尝试后可形成均匀一致的硅胶粘合珠，从而提高实验的可重复性。练习该技术并额外准备一些插入式组件堆叠可能有助于操作。在翻转插入组件后去除气泡时，我们发现15G灌胃针是最有效的工具，并已确定其用于此目的的最佳形状。在第二次接种细胞前，必须提前准备并灭菌该针具。
每种细胞类型在合并到共培养系统之前，都必须在独立的培养环境中进行培养&#160;。为了维持单层结肠上皮细胞的生长，必须考虑每种细胞类型的初始接种密度、总体培养时间，以及对细菌...

免疫细胞与肠道微生物组之间的相互作用显著影响多种疾病治疗的效果。这种相互作用会受到多种外部刺激的显著调节，包括但不限于宿主代谢异常、饮食变化、疾病表现以及药物治疗。这些变化可能导致微生物群组成失衡，这种情况被称为菌群失调1,2,3。
为了更好地理解肠道中微生物与宿主免疫细胞之间的相互作用，不同研究团队已开发出复杂的共培养系统，以模拟肠道黏膜环境。从Kim等人开发的“肠道芯片”系统4，到使用特殊吸水性基质的更复杂组装5，这些共培养系统构建难度较高，且由于共培养基质对分泌成分的吸收，无法完整保留所有分泌物质。因此，Noel等人开发了一种相对更易于制备的替代性共培养系统，用于模拟肠道黏膜6。该新系统采用单个培养小室，将结肠上皮细胞接种于膜的一侧，而将预先分化的巨噬细胞接种于另一侧6。然而，接种预先分化的巨噬细胞需要先在其他地方完成其分化过程，再将其解离并重新接种至共培养体系中，这一过程可能影响细胞的完整性和存活率。
通过改进以往的系统，我们开发出一种新型的三维（3D）多层共培养系统，称为3D Flipwell系统7,8。该系统由背对背堆叠的细胞培养小室组成，可在单一共培养体系中同步实现结肠上皮细胞的极化、黏液形成、巨噬细胞的分化及其极化过程。该系统使我们能够研究肠道黏膜环境的变化，以及肠道菌群、上皮细胞与免疫细胞之间的相互作用。此外，该系统还可用于评估外界刺激物（包括细菌代谢产物、毒素、膳食营养素和药物）对肠道黏膜及机体其他部分的影响7,8。
通过利用新型共培养小室系统，我们研究了不同细胞组分对七叶灵（SEP）的反应，SEP 是一氧化氮合酶（NOS）辅因子 BH4（四氢生物蝶呤）的内源性前体。我们先前已证明，SEP 通过将肿瘤相关巨噬细胞重编程为具有促免疫原性的表型，从而在乳腺肿瘤微环境中发挥促免疫原性作用9,10,11,12。我们还证实，在共培养体系中，SEP 可诱导肠道细菌生物膜的形成、结肠上皮产生黏液以及巨噬细胞向促免疫原性方向极化等同步事件，表明激活了黏膜防御机制7。这些发现支持该新型共培养系统在模拟肠道黏膜微环境中的应用价值7。
本实验方案的总体目标是提供逐步操作指南，用于构建一种新型的共培养体系，该体系包含肠道细菌、肠道上皮、黏液和免疫细胞，以模拟肠道黏膜环境。我们还展示了如何在外部刺激（例如SEP处理）的影响下，可视化共培养细胞之间的相互作用。未来需要利用该共培养系统开展进一步研究，以确定介导共培养中不同细胞间相互作用的分泌性细胞成分，并评估该共培养模型在新疗法高通量筛选中的应用价值。此外，为了更接近肠道黏膜环境的生理状态，该共培养系统还需进一步优化。例如，若需将需氧哺乳动物细胞与厌氧细菌共培养，则需在无氧培养基中单独培养这些厌氧菌，或使用液体石蜡覆盖培养体系以阻止氧气进入，正如其他文献所报道的那样。该共培养系统的此类高级应用与功能仍需进一步深入研究。

<table><tbody><tr><td>0.4% PFA（参见试剂与溶液部分的配方）</td><td>文中已描述</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml 血清移液管</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>12 孔组织培养板，&amp;nbsp; Costar</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 锥形管，SpectraTube</td><td>Alkali Scientific</td><td>C2715</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;l 吸头&amp;nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1700</td><td></td></tr><tr><td>24 孔插件 — 24 孔板用培养插件，PET 0.4 &amp;micro;m&amp;nbsp;</td><td>BrandTech Scientific</td><td>782710</td><td></td></tr><tr><td>3D Flipwells 预制，UV 灭菌&amp;nbsp;</td><td>实验室自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% PFA（参见试剂与溶液部分的配方）</td><td>文中已描述</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM Sepiapterin 储存液（SEP，参见试剂与溶液部分的配方）</td><td>Career Henan Chemical Co</td><td>CAS#: 17094-01-8</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 血清移液管</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>70–95% 乙醇（乙基酒精）</td><td>Decon Labs</td><td>04-355-151</td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td></td></tr><tr><td>动物饲喂针头，20 号，1.5&amp;rdquo; 长度，一次性使用&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-208-87</td><td></td></tr><tr><td>抗体稀释缓冲液（参见试剂与溶液部分的配方）</td><td>文中已描述</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Attofluor 细胞培养腔室&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌指示胶带</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-111</td><td></td></tr><tr><td>枯草芽孢杆菌野生型（3A1T）菌株，甘油保存菌种（）</td><td>Bacillus Genetic Stock Center（https:// bgsc. org/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>粉红色无粉腈类手套，不含乳胶，BioGrip</td><td>Top Quality Manufacturing</td><td>P2810</td><td></td></tr><tr><td>封闭缓冲液（参见试剂与溶液部分的配方 — 含 10% 正常山羊血清的 PBS）</td><td>文中已描述</td><td></td><td></td></tr><tr><td>封闭缓冲液（参见试剂与溶液部分的配方）</td><td>文中已描述</td><td></td><td></td></tr><tr><td>明场显微镜（Nikon 或同等型号）Eclipse Ts2</td><td>Nikon</td><td>TS2</td><td></td></tr><tr><td>Caco-2 细胞</td><td>ATCC</td><td>HTB-37</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养箱，37&amp;deg;C，5% CO2（Eppendorf CellXpert）</td><td>Eppendorf</td><td>6734010015</td><td></td></tr><tr><td>离心机（Eppendorf，Centrifuge 5804/5804 R 或同等型号）</td><td>Eppendorf</td><td>22622501</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管，SpectraTube</td><td>Alkali Scientific</td><td>C2750</td><td></td></tr><tr><td>12 孔板用培养插件，PET，0.4 &amp;micro;m，无菌</td><td>BrandTech Scientific, BRAND Insert 2in1, BIO-CERT</td><td>782730</td><td></td></tr><tr><td>DAPI VectaShield 封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>深型培养皿底部，100 × 25 mm，深型可堆叠聚苯乙烯培养皿，无菌&amp;nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>8609-0625</td><td></td></tr><tr><td>Drummond Pipet Aid XP</td><td>Drummond&amp;nbsp;</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5804 离心机，配备适用于 50 ml 锥形管的摆动转子</td><td>Eppendorf</td><td>22622501</td><td></td></tr><tr><td>镊子，不锈钢，无菌高压灭菌，2 套</td><td>VWR</td><td>82027-438</td><td></td></tr><tr><td>镊子，不锈钢，无菌高压灭菌，2 套，标本镊</td><td>VWR</td><td>82027-438</td><td></td></tr><tr><td>500 ml 玻璃烧瓶</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>4980-500</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板（带盖玻片的 Neubauer 型）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-312-90</td><td></td></tr><tr><td>HT-29-MTX-E12 细胞</td><td>Millipore Sigma</td><td>12040401</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoPen（可选）</td><td>Fisher Scientific</td><td>4021761EA</td><td></td></tr><tr><td>凯夫拉材质或其他抗切割手套（可选）</td><td>五金店或 Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>实验室胶带或封箱胶带</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>159015R</td><td></td></tr><tr><td>层流罩 1300 系列 A2 BSC II 级</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1375</td><td></td></tr><tr><td>带紫外灭菌功能的层流罩 SterilGARD</td><td>The Baker Company</td><td>SG403A-HE</td><td></td></tr><tr><td>耐溶剂记号笔</td><td>VWR</td><td>52877-310 或 95042-566</td><td></td></tr><tr><td>Caco-2 细胞培养基（基于高糖 DMEM，参见试剂与溶液部分的配方）</td><td>参见&amp;nbsp; 文中描述</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT-29 细胞培养基（高糖 DMEM，参见试剂与溶液部分的配方）</td><td>文中已描述</td><td></td><td></td></tr><tr><td>THP-1 细胞培养基（RPMI，参见试剂与溶液部分的配方）</td><td>文中已描述</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量离心管，1.7 ml，无菌&amp;nbsp;</td><td>Alkali Scientific</td><td>C3017-ST</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Thermo Fisher</td><td>3451</td><td></td></tr><tr><td>Miller LB 培养基（参见试剂与溶液部分的配方）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;L3522</td><td></td></tr><tr><td>尖嘴钳，2 套</td><td>五金店或 Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无粉无乳胶腈类手套 Aurelia Amazing</td><td>MidSci</td><td>92885</td><td></td></tr><tr><td>培养皿盖，无菌 Falcon 培养皿，100×15 mm 型</td><td>Corning Inc</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>佛波酯肉豆蔻酸乙酸酯（PMA）（100 ng/&amp;mu;l，参见试剂与溶液部分的配方）&amp;nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>Tlrl-pma</td><td></td></tr><tr><td>移液吸头（10 &amp;micro;l、200 &amp;micro;l、1000 &amp;micro;l），PurePoint 或同等产品</td><td>Alkali Scientific&amp;nbsp;</td><td>ST1010-CS, ST1200-CS, ST1000-CS</td><td></td></tr><tr><td>塑料保鲜膜</td><td>超市</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purecol 工作用胶原酶溶液（100 &amp;micro;g/mL）</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5005-100ML</td><td></td></tr><tr><td>圆形盖玻片 #1 1 oz（Corning 浮法玻璃或 Fisherbrand）</td><td>Corning 或 Fisherbrand</td><td>50143822 或 12-546-2 25CIR-2</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片，无菌，一次性&amp;nbsp;</td><td>Mopec 或 Feather #10</td><td>AJ136 或 2975#10</td><td></td></tr><tr><td>Sepiapterin（SEP，100 &amp;micro;M，参见试剂与溶液部分的配方）</td><td>Career Henan Chemical Co</td><td>CAS#: 17094-01-8</td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱，设定为 220 rpm，37&amp;deg;C</td><td>Eppendorf New Brunswick Scientific</td><td>M12990080</td><td></td></tr><tr><td>硅酮粘合剂 Loctite Clear Silicone IDH 或 3M 船用级透明硅酮密封胶，带尖嘴</td><td>Loctite 或 3M</td><td>1745658 或 PN08019</td><td></td></tr><tr><td>单通道移液器 Eppendorf Research Plus，200 &amp;micro;l</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>单通道移液器（10 &amp;micro;l、200 &amp;micro;l、1000 &amp;micro;l）</td><td>Eppendorf</td><td>2231001122</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计 NanoDropOneC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-400-519</td><td></td></tr><tr><td>无菌去离子水&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无钙镁磷酸盐缓冲液（PBS），无菌</td><td>Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;BSS-PBS-1X6</td><td></td></tr><tr><td>3 ml 或 5 ml 带鲁尔锁扣接头的注射器</td><td>BD</td><td>309585 或 309603</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 细胞</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>移液管，无菌</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>VWR</td><td>97063-702</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>擦拭纸 Kimwipes Professional，带防静电 LintGuard Polyshield</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;一抗：&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD163</td><td>Abcam</td><td>156769</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD68</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-683-0.1 mg</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD80，E3Q9V</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>15416</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CK20&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>PA5-82875</td><td></td></tr><tr><td>抗人 MUC2（996/1）</td><td>ThermoFisher</td><td>MA5-12345</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;二抗：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG（用于 CD80 和 CK20）</td><td>ThermoFisher</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠 IgG（用于 MUC2、CD68 或 CD163）</td><td>ThermoFisher</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂与溶液：&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Caco-2 培养基：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>含高糖（4.5 g/L）和 1%（v:v）GlutaMax 的 DMEM&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>10%（v:v）热灭活胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma</td><td>F2242-500ML</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸（1%），用于 Caco-2 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140076</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（1% v:v）</td><td>Sigma</td><td>F2242-500ML</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;HT-29-MTX 培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>含高糖（4.5 g/L）和 1%（v:v）GlutaMax 的 DMEM&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>10%（v:v）热灭活胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma</td><td>F2242-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES（终浓度 10 mM）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（1% v:v）</td><td>Sigma</td><td>F2242-500ML</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;THP-1 培养基：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清（FBS）（10% v:v）</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>F2242-500ML</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖（终浓度 4.5 g/L）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A249001</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax 1%（v:v）&amp;nbsp;（终浓度 2 mM）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES（终浓度 10 mM）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（1% v:v）</td><td>Sigma</td><td>F2242-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute（RPMI）-1640 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠（终浓度 1 mM）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Purecol 工作用胶原酶溶液（稀释至 1:30，100 &amp;micro;g/ml）：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purecol 3 mg/ml 稀释至 1:30，得 100 &amp;micro;g/ml&amp;nbsp;</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5005-100ML</td><td></td></tr><tr><td>无菌去离子水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;L-Sepiapterin 储存液（50 mM）：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Sepiapterin（SEP）</td><td>Career Henan Chemical Co</td><td>CAS#: 17094-01-8</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;佛波酯肉豆蔻酸乙酸酯储存液（PMA，5 mg/mL）&lt;/strong&gt;</td><td>InvivoGen</td><td>Tlrl-pma</td><td></td></tr><tr><td>1% BSA（牛血清白蛋白）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Miller LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;L3522</td><td></td></tr><tr><td>与二抗同源的正常血清</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>NS02L-1ML</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr></tbody></table>

用于细菌、肠道及免疫细胞中毒理学与免疫调节治疗异步系统开发的3d flipwell工程

3D Flipwell Engineering for Developing Asynchronous Systems for Toxicologic and Immunomodulatory Therapies in Bacterial, Gut, and Immune Cells

为了研究细菌分泌组在免疫细胞极化和肠道黏膜稳态中的作用，我们开发了一种三维共培养模型，该模型采用市售的插入式培养小室并以背对背堆叠的方式组装。我们将此系统命名为3D Flipwells，成功实现了细菌、结肠上皮细胞和免疫细胞在分层结构中的共培养，以模拟肠道黏膜微环境。该共培养系统允许在膜的一侧接种结肠上皮细胞，另一侧接种未分化的非贴壁单核细胞，从而在同一共培养体系中同步实现结肠上皮细胞的极化、黏液层形成以及单核细胞向巨噬细胞的分化与极化，无需预先分化巨噬细胞后再进行分离和重新接种。该系统构建简便，仅需少量易得的材料和工具。我们通过分析共培养体系各组分对生蝶呤（SEP）——即四氢生物蝶呤（BH4）的内源性前体（一氧化氮合酶（NOS）的辅因子）——的响应，验证了该系统的实用性。结果表明，在3D Flipwells中给予SEP处理可诱导肠道细菌形成生物膜、结肠上皮产生黏液，并促进巨噬细胞向促免疫极化方向转变。这表明SEP通过不同细胞组分之间的相互作用，触发了黏膜防御机制的激活。未来还需进一步实验，以探究黏膜间通讯在免疫细胞重编程中的作用，并评估该共培养系统在筛选新型免疫调节疗法中的应用价值。

为了确定肠道细菌、结肠上皮细胞和巨噬细胞Flipwell共培养体系的生物学意义，我们使用了亚叶酸（sepiapterin, SEP）处理共培养体系。SEP是一种精氨酸代谢调节剂，可促进一氧化氮的生成9,10,11，并与对照组DMSO处理进行比较。我们采用免疫荧光（IF）显微镜和扫描电子显微镜（SEM）分析SEP处理对共培养体系中各组分的影响。染色结果显示，SEP处理后肠道上皮区黏液分泌显著增加，表现为上皮标志蛋白CK20和黏膜蛋白MUC2表达水平升高（图1）。此外，我们发现SEP处理提高了M1型巨噬细胞标志物CD80的表达，同时下调了M2型巨噬细胞标志物CD163，提示巨噬细胞向M1型极化（图2）。另外，SEM分析显示，SEP处理后三种组分均出现明显的表型变化（图3）。与免疫...

本文提供了一个详细的实验方案，包含关键步骤，用于指导3D Flipwell的构建与使用。我们描述并展示了如何组装共培养插件堆叠，并利用其对肠道细菌、肠道上皮细胞和巨噬细胞进行分层共培养，以模拟肠道黏膜环境。

用于细菌、肠道及免疫细胞中毒理学与免疫调节治疗异步系统开发的3D Flipwell工程

为了研究细菌分泌组在免疫细胞极化和肠道黏膜稳态中的作用，我们建立了一种三维共培养模型，使用……

我们开发了一种模拟肠道黏膜环境的三维共培养系统，可用于研究连续的细胞间相互作用，并评估药物反应，从而应用于药物筛选及黏膜细胞相互作用机制的解析。已有不同研究团队利用复杂的生物工程技术开发了多种不同的培养系统以模拟肠道黏膜环境。而我们开发的共培养系统则使用成本较低的材料，制备更为简便。我们的共培养系统揭示了一种蛋白源性药物可触发肠道细菌、上皮细胞和免疫细胞之间的协调反应，可能通过我们的细菌代谢物激活宿主免疫，并介导跨物种通讯。我们的目标是研究需氧和厌氧细菌菌株及其代谢物，以揭示其免疫调节作用，为基于细菌代谢物的新型免疫治疗策略奠定基础。首先，打开培养皿盖并将其放置一旁。将手术刀刀片放在培养皿底部的边缘。用一只手取一把无菌镊子，轻轻夹住插入物的底部，将其从包装中取出。用另一只手拿起无菌手术刀刀片，将其移至插入物处。以C形动作在边缘刺穿膜，并将手术刀刀片轻轻沿着插件底部滑动，始终保持靠近塑料壁。将PET膜切割出来，并使用第二套镊子将其移除。然后使用手术刀刀片刮除任何白色的膜屑，以清洁插件的边缘和 rim 部分。接下来，用无菌镊子小心地将第二层未带膜的插入物从其保护包装中取出。然后，将一滴2-3毫米宽的硅胶均匀地涂抹在带膜插入物底部边缘的整个圆周上，注意不要触碰到膜。将两个插入物底部对底部贴合，使它们的底边完全对齐。当Flipwell堆叠粘合后，将其放入原始无菌包装袋或深型培养皿中干燥72小时。使用指定深型培养皿的皿盖覆盖堆叠组件。为对堆叠组件进行灭菌，使用无菌镊子将Flipwell堆叠悬挂在指定深型培养皿的边缘上。然后，关闭生物安全柜的玻璃门，并打开紫外灯。在进行胶原蛋白包被前，为检测有无泄漏，首先加入 500 微升无菌 PBS 或无菌去离子水。第二天，在生物安全柜内将用于检测的液体吸出，随后将支架干燥 1–2 小时。为用胶原蛋白包被膜，打开培养皿盖，使Flipwell悬挂在培养皿边缘。小心地将200 µL胶原蛋白溶液加到插入物堆叠的一侧。一小时后吸除胶原蛋白溶液，然后用移液器加入200 µL无菌PBS。吸除PBS后，盖上培养皿盖，在超净台内让膜干燥60分钟。当膜干燥后，使用无菌镊子将Flipwell翻转至另一侧，并使其悬挂在培养皿边缘。制备细菌插入物时，将两把无菌镊子和24孔插入物放入生物安全柜中。用无菌镊子从无菌包装中取出插入物。用第二把镊子或钳子，折断插入物底部的小塑料脚。通过将24孔插入物放入无菌的Flipwell共培养插入物堆叠中或原始的12孔插入物中，测试其是否适配。开始接种Flipwell时，在Flipwell顶腔侧的每一侧各接种500 µL上皮细胞系。用培养皿盖盖住组装件，然后在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜，直至细胞贴壁。打开培养皿盖，从Flipwell堆叠的顶端吸除DMEM培养基。用无菌镊子通过钩子小心夹起Flipwell，并将其旋转180度。用第二把无菌镊子夹住此时朝上的另一个钩子，将Flipwell小室堆叠放回培养皿中，并将钩子悬挂在培养皿边缘。向共培养小室堆叠的顶侧加入500 µL THP-1细胞悬液。通过向深孔培养皿中添加培养基来调整结肠上皮细胞 HT-29 的培养基。为去除任何气泡，使用无菌镊子夹住 Flipwell 堆叠的臂部。将灌胃针小心地插入并置于插件组件下方，并非常轻柔地将软头接触气泡处。缓慢而小心地向上拉动注射器活塞，观察气泡逐渐消失。然后小心地将针头和注射器从Flipwell中取出。使用灌胃针去除气泡后，将两种细胞类型均置于细胞培养孵育箱中进行培养。用镊子将插入物放入无菌培养皿中，并盖上皿盖。将装有Flipwells的培养皿转移至生物安全柜中，放置于培养皿中细菌插入物的对侧。用移液器从Flipwell的顶端侧吸出300微升DMEM培养基，以留出空间放置细菌插入物，然后盖上培养皿盖。现在，向24孔细菌插入板中加入50至100微升的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）培养物，并将其插入Flipwell的上侧。旋转臂部，将其悬挂在Flipwell共培养插入板堆叠的边缘上。用第二套无菌镊子夹持该堆叠。经过三小时的孵育后，使用无菌镊子从Flipwell中取出细菌小室。将Flipwell整体放入50毫升锥形管中，无需拆解。若需为电镜观察而拆解Flipwell，请用双手握住装置，扭转并取下堆叠结构中每个粘合的部分。旋转插入物，使膜朝上放置。用手固定插入物，用手术刀片小心地将膜切下，然后放入含有甲醛溶液的1.7毫升离心管中。进行共聚焦显微镜观察时，在顶端加入300微升无菌PBS。用移液器吸出 PBS 后，小心地将插件堆从培养皿中取出。现在将 Flipwell 翻转，在朝上的 RPMI 侧的 Flipwell 共培养插件堆中加入 300 微升 PBS，然后吸去磷酸盐缓冲盐水。使用 200 微升移液器，形成一个较大的 PBS 液滴。拧下插入组件，将其分离成单独的插入片。然后小心地将含有THP-1细胞的Flipwell小室置于200微升PBS液滴上方。在含有结肠上皮细胞的一侧加入200微升通透化缓冲液，静置10分钟。进行免疫荧光染色时，将300微升一抗溶液用移液器滴加至小室的顶部。向12孔板的孔中加入300微升一抗溶液，然后将小室放入孔中，使其位于液滴上方。盖好抗体孔。染色结果显示，经亚叶酸处理后，肠道上皮区的黏液分泌显著增加，表现为上皮标志蛋白CK20和黏膜蛋白MUC2的表达升高。在THP-1单培养体系中，亚叶酸处理显著上调M1型巨噬细胞标志物CD80的表达，同时下调M2型巨噬细胞标志物CD163，提示向M1型极化。扫描电镜显示，在亚叶酸处理的共培养体系中，上皮细胞的黏液分泌增加。亚叶酸治疗诱导了单培养和共培养体系中巨噬细胞呈现类似M1表型的形态。经亚叶酸处理的单培养体系中的细菌细胞显示出皱缩表面，这是生物膜形成的特征。

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

用于开发用于细菌、肠道和免疫细胞毒理学和免疫调节疗法的异步系统的 3D Flipwell 工程

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高度自发荧光临床样本的迭代漂白扩展多重成像优化工作流程

了解3D Flipwell共培养系统的构建方法，用于模拟肠道黏膜环境并评估药物反应。该技术可研究肠道细菌、上皮细胞与巨噬细胞之间的相互作用，为免疫调节疗法开发提供新策略。

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