用于细菌、肠道及免疫细胞中毒理学与免疫调节治疗异步系统开发的3D Flipwell工程

我们开发了一种模拟肠道黏膜环境的三维共培养系统，可用于研究连续的细胞间相互作用，并评估药物反应，从而应用于药物筛选及黏膜细胞相互作用机制的解析。已有不同研究团队利用复杂的生物工程技术开发了多种不同的培养系统以模拟肠道黏膜环境。而我们开发的共培养系统则使用成本较低的材料，制备更为简便。

我们的共培养系统揭示了一种蛋白源性药物可触发肠道细菌、上皮细胞和免疫细胞之间的协调反应，可能通过我们的细菌代谢物激活宿主免疫，并介导跨物种通讯。我们的目标是研究需氧和厌氧细菌菌株及其代谢物，以揭示其免疫调节作用，为基于细菌代谢物的新型免疫治疗策略奠定基础。首先，打开培养皿盖并将其放置一旁。

将手术刀刀片放在培养皿底部的边缘。用一只手取一把无菌镊子，轻轻夹住插入物的底部，将其从包装中取出。用另一只手拿起无菌手术刀刀片，将其移至插入物处。

以C形动作在边缘刺穿膜，并将手术刀刀片轻轻沿着插件底部滑动，始终保持靠近塑料壁。将PET膜切割出来，并使用第二套镊子将其移除。然后使用手术刀刀片刮除任何白色的膜屑，以清洁插件的边缘和 rim 部分。

接下来，用无菌镊子小心地将第二层未带膜的插入物从其保护包装中取出。然后，将一滴2-3毫米宽的硅胶均匀地涂抹在带膜插入物底部边缘的整个圆周上，注意不要触碰到膜。将两个插入物底部对底部贴合，使它们的底边完全对齐。

当Flipwell堆叠粘合后，将其放入原始无菌包装袋或深型培养皿中干燥72小时。使用指定深型培养皿的皿盖覆盖堆叠组件。为对堆叠组件进行灭菌，使用无菌镊子将Flipwell堆叠悬挂在指定深型培养皿的边缘上。

然后，关闭生物安全柜的玻璃门，并打开紫外灯。在进行胶原蛋白包被前，为检测有无泄漏，首先加入 500 微升无菌 PBS 或无菌去离子水。第二天，在生物安全柜内将用于检测的液体吸出，随后将支架干燥 1–2 小时。

为用胶原蛋白包被膜，打开培养皿盖，使Flipwell悬挂在培养皿边缘。小心地将200 µL胶原蛋白溶液加到插入物堆叠的一侧。一小时后吸除胶原蛋白溶液，然后用移液器加入200 µL无菌PBS。吸除PBS后，盖上培养皿盖，在超净台内让膜干燥60分钟。

当膜干燥后，使用无菌镊子将Flipwell翻转至另一侧，并使其悬挂在培养皿边缘。制备细菌插入物时，将两把无菌镊子和24孔插入物放入生物安全柜中。用无菌镊子从无菌包装中取出插入物。

用第二把镊子或钳子，折断插入物底部的小塑料脚。通过将24孔插入物放入无菌的Flipwell共培养插入物堆叠中或原始的12孔插入物中，测试其是否适配。开始接种Flipwell时，在Flipwell顶腔侧的每一侧各接种500 µL上皮细胞系。

用培养皿盖盖住组装件，然后在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜，直至细胞贴壁。打开培养皿盖，从Flipwell堆叠的顶端吸除DMEM培养基。用无菌镊子通过钩子小心夹起Flipwell，并将其旋转180度。

用第二把无菌镊子夹住此时朝上的另一个钩子，将Flipwell小室堆叠放回培养皿中，并将钩子悬挂在培养皿边缘。向共培养小室堆叠的顶侧加入500 µL THP-1细胞悬液。

通过向深孔培养皿中添加培养基来调整结肠上皮细胞 HT-29 的培养基。为去除任何气泡，使用无菌镊子夹住 Flipwell 堆叠的臂部。将灌胃针小心地插入并置于插件组件下方，并非常轻柔地将软头接触气泡处。

缓慢而小心地向上拉动注射器活塞，观察气泡逐渐消失。然后小心地将针头和注射器从Flipwell中取出。使用灌胃针去除气泡后，将两种细胞类型均置于细胞培养孵育箱中进行培养。

用镊子将插入物放入无菌培养皿中，并盖上皿盖。将装有Flipwells的培养皿转移至生物安全柜中，放置于培养皿中细菌插入物的对侧。用移液器从Flipwell的顶端侧吸出300微升DMEM培养基，以留出空间放置细菌插入物，然后盖上培养皿盖。

现在，向24孔细菌插入板中加入50至100微升的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）培养物，并将其插入Flipwell的上侧。旋转臂部，将其悬挂在Flipwell共培养插入板堆叠的边缘上。用第二套无菌镊子夹持该堆叠。

经过三小时的孵育后，使用无菌镊子从Flipwell中取出细菌小室。将Flipwell整体放入50毫升锥形管中，无需拆解。若需为电镜观察而拆解Flipwell，请用双手握住装置，扭转并取下堆叠结构中每个粘合的部分。

旋转插入物，使膜朝上放置。用手固定插入物，用手术刀片小心地将膜切下，然后放入含有甲醛溶液的1.7毫升离心管中。进行共聚焦显微镜观察时，在顶端加入300微升无菌PBS。

用移液器吸出 PBS 后，小心地将插件堆从培养皿中取出。现在将 Flipwell 翻转，在朝上的 RPMI 侧的 Flipwell 共培养插件堆中加入 300 微升 PBS，然后吸去磷酸盐缓冲盐水。使用 200 微升移液器，形成一个较大的 PBS 液滴。

拧下插入组件，将其分离成单独的插入片。然后小心地将含有THP-1细胞的Flipwell小室置于200微升PBS液滴上方。在含有结肠上皮细胞的一侧加入200微升通透化缓冲液，静置10分钟。

进行免疫荧光染色时，将300微升一抗溶液用移液器滴加至小室的顶部。向12孔板的孔中加入300微升一抗溶液，然后将小室放入孔中，使其位于液滴上方。盖好抗体孔。

染色结果显示，经亚叶酸处理后，肠道上皮区的黏液分泌显著增加，表现为上皮标志蛋白CK20和黏膜蛋白MUC2的表达升高。在THP-1单培养体系中，亚叶酸处理显著上调M1型巨噬细胞标志物CD80的表达，同时下调M2型巨噬细胞标志物CD163，提示向M1型极化。扫描电镜显示，在亚叶酸处理的共培养体系中，上皮细胞的黏液分泌增加。

亚叶酸治疗诱导了单培养和共培养体系中巨噬细胞呈现类似M1表型的形态。经亚叶酸处理的单培养体系中的细菌细胞显示出皱缩表面，这是生物膜形成的特征。