用于开发用于细菌、肠道和免疫细胞毒理学和免疫调节疗法的异步系统的 3D Flipwell 工程

我们开发了一套模拟肠道黏膜环境的三维共培养系统，用于研究串串扰并评估可用于药物筛查和理解黏膜细胞相互作用的药物反应。不同团队开发了多种不同的培养系统，利用非常复杂的生物工程技术模拟肠道黏膜环境。但我们开发了一个共育系统，使用更便宜的材料更容易制作。

我们的共培养系统显示，蛋白质源药物能在肠道细菌、上皮细胞和免疫细胞之间引发协调反应，激活宿主免疫，可能与细菌代谢物结合，并介导跨物种交流。我们旨在研究好氧和无氧细菌菌株及其代谢物，揭示免疫调节效应，为基于细菌代谢物的新免疫治疗策略铺平道路。首先，打开培养皿盖并将其放在一旁。

将手术刀放在培养皿底部的边缘。拿一把无菌镊子，轻轻地从底部向上取下刀片，从包装中取出。另一只手拿起无菌手术刀刃，靠近插入器。

用C形动作从膜边缘刺入，轻轻地将手术刀刀片绕过插入垫底部，紧贴塑料壁。把PET膜剪下来，用第二组镊子把它取出来。然后用手术刀刮除白色膜屑，清洁刀片边缘和边缘。

接着，轻轻地将一颗2-3毫米的硅胶珠沿着内衬底部涂抹，注意不要接触膜。拿起第二组无菌产钳，小心地将第一组无膜插入物从保护包中取出。将两个内衬从底部对底部连接，使底圈对齐。

Flipwell堆叠胶合好后，放入原有无菌包装盒或深培养皿中晾干72小时。用指定的培养皿盖子盖住堆叠组件。要消毒烟囱组件，使用无菌镊子将Flipwell烟囱悬挂在指定的深培养皿边缘。

然后，关闭生物安全柜的玻璃窗框，打开紫外线灯。在胶原蛋白涂层之前测试泄漏，首先加入500微升无菌PBS或无菌去离子水。第二天，吸入用于测试的液体，然后在生物安全柜内干燥1-2小时。

要用胶原蛋白覆盖膜，打开培养皿盖，让Flipwell挂在培养皿边缘。小心地在插入物堆的一侧加入200微升胶原蛋白溶液。一小时后抽取胶原溶液，然后吸取200微升无菌PBS液。抽取PBS后，盖上培养皿盖子，让膜在柜内干燥60分钟。

膜干后，使用无菌镊子或镊子，将Flipwell翻转到相反侧，悬挂在培养皿边缘。制作细菌插入物时，将两组无菌产钳和24孔插入物放入生物安全柜内。用无菌镊子将插入物从无菌包装中取出。

用第二组镊子或镊子，把插入件底部的小塑料脚掰下来。通过将24孔插入物插入无菌Flipwell共培养插入物堆或原装12孔插入物中进行测试。开始播种Flipwell时，先在Flipwell顶端两侧各播种500微升的上皮细胞线。

用培养皿盖盖住组装体，然后在37摄氏度与5%二氧化碳共孵育一夜，直到细胞附着。打开培养皿盖，从Flipwell堆顶端吸取DMEM介质。使用无菌镊子时，小心地用钩子提起Flipwell，旋转180度。

用第二组无菌产钳，抓住Flipwell叠放的另一根向上钩。然后将组件放回培养皿中，并将钩子挂在培养皿边缘。在共培养插入物顶端加入500微升THP-1细胞悬浮液。

通过将培养基加入深层培养皿，调整结肠上皮细胞的HT-29培养基。为了去除气泡，用无菌产钳夹住Flipwell的手臂。小心地将一根加瓦针插入插入组件下方，非常轻柔地将软针尖顶向气泡。

小心且非常缓慢地拉起注射器活塞，观察气泡慢慢消失。然后小心地将针头和注射器从翻转孔中取出。用盖状针去除气泡后，在细胞培养箱中培养两种细胞类型。

用产钳将插入物放入无菌培养皿中，盖上盖子。将带Flipwell的培养皿转移到生物安全柜中，并在培养皿的另一侧放置细菌插入物。从Flipwell顶端取出300微升DMEM培养基，以便插入细菌，然后盖上培养皿盖。

现在，在24孔细菌插入物中加入50到100微升的槚孢杆菌培养物，并将其插入Flipwell顶部。旋转机械臂，挂在Flipwell共培养插入物堆的边缘。用第二组无菌产钳夹住那叠。

经过三小时的孵育后，使用无菌镊子将Flipwell中的细菌插入物取出。将Flipwell放入一个50毫升的锥形管内，无需拆卸。拆解Flipwell进行电子显微镜检查时，用双手握住它，拧下每个粘着的部分。

旋转带膜的插入件，然后放下，膜朝上。握住插入件，用手术刀小心切除膜，然后放入装有对甲醛溶液的1.7毫升管内。共軛显微镜时，在顶端添加300微升无菌PBS。

在用吸液法取出PBS后，小心地将菌块从培养皿中取出。现在，翻转Flipwell，向Flipwell共培养插入物堆栈的向上RPMI侧加入300微升PBS，然后抽取含磷酸盐的生理盐水。使用200微升的移液器，制备一个大滴的PBS。

拧开内衬组件，分离到内衬里。然后小心地将带有THP-1细胞的Flipwell堆放在200微升PBS滴落的顶部。在结肠上皮细胞的顶部加入200微升渗透缓冲液，静置10分钟。

免疫荧光染色时，移液器将300微升的初级抗体移液器注入插入片段顶部。将300微升的一次抗体加入12孔板的凹槽，然后将插入物置于滴滴上方。把抗体盖好。

染色显示，在sepiapterin处理后，肠道上皮腔的黏液分泌显著增加，这一点由上皮标志蛋白CK20和黏膜蛋白MUC2的增加所显示。在THP-1单一培养中，sepiapterin处理显著提升了M1巨噬细胞标志CD80的表达，同时下调了M2巨噬细胞标志物CD163，表明M1极化。扫描电子显微镜显示，sep处理的共培养中上皮细胞分泌黏液增加。

在单一培养和共培养中，Sepiapterin处理诱导的巨噬细胞形态类似于M1表型。在sepiapterin处理的单一培养中，细菌细胞表面出现了生物膜形成特征的皱纹。