生长在微重力人体肠道黏膜的多细胞三维器官模型的建立
July 25th, 2016
细胞在三维（3-D）的环境中生长代表的2-D的环境中（ 例如 ，瓶或菜）在细胞培养的显着改进。这里，我们描述根据通过旋转壁上容器（RWV）生物反应器提供微重力培养人肠粘膜的多细胞三维器官模型的发展。
该程序的总体目标是描述在微重力下由旋转壁容器生物反应器提供的人类肠粘膜的多细胞 3-D 器官型模型的开发。这种方法作为健康和疾病发现工具具有广泛的潜力。包括与病原体的相互作用、抗原运输和炎症过程。
该技术的主要优点是模仿猫的表型多样性，并使用 D-12 血管生物反应器，允许营养物质和氧气的有效扩散。首先从培养容器的填充口拧下盖子，加入 50 毫升我们的 PMI。容器装满后，盖上盖子并用 70% 乙醇擦拭任何溢出的培养基。
让容器在室温下孵育至少 15 分钟至过夜。准备继续时，使用填充口丢弃培养基，并向容器中加入 30 毫升 3-D 培养基。盖上加注口的盖子，然后再次用 70% 乙醇擦去任何溢出的培养基。
从培养箱中取出含有人脐静脉内皮细胞和人结肠成纤维细胞的近汇合烧瓶，并用 PBS 洗涤两次。然后，使用含 0.05% 胰蛋白酶 EDTA 的 0.25% 胰蛋白酶溶液覆盖细胞，以分离细胞。细胞分离后，将它们收集在预装有 30 毫升含 30% FBS 的 DMEM 的 50 毫升试管中。
将试管离心 10 分钟以沉淀细胞。然后，将细胞重悬于含有 30% FBS 的 30 毫升 DMEM 中。接下来，用 20 微升台盼蓝染料稀释 20 微升重悬细胞。
用细胞混合物加载血细胞计数器并计数活细胞的浓度。然后，在含有 30% FBS 的 DMEM 中以每毫升 50 至 8000 万个细胞的浓度重悬每种细胞类型。首先，将适当数量的培养插入物放入六孔板的孔中。
接下来，首先将 10x DMEM、10x 重构培养基、200 毫摩尔 L-谷氨酰胺和热灭活 FBS 添加到 50 ml 锥形管中，以制备胶原蛋白混合物。然后加入 1 型牛胶原蛋白、层粘连蛋白、4 型胶原蛋白、纤连蛋白、硫酸肝素蛋白多糖，最后加入氢氧化钠以中和溶液的 pH 值。如果混合物在任何时候出现淡黄色的酸性外观，请加入几滴无菌的 1 正常氢氧化钠来中和混合物。
关闭试管，通过倒置几次来混合溶液，同时避免形成气泡。不混合时，将溶液放在冰上以防止其聚合。混合后，将细胞悬液添加到胶原蛋白制备物中，并通过轻轻倒置试管数次来混合试管，以避免形成气泡。
然后将它们放回冰上。在每个插入物中加入 4 到 5 毫升含有胶原蛋白的细胞溶液，让胶原蛋白在通风橱中凝胶，一小时内几乎不动。1 小时后，将 6 孔板转移到培养箱中再放置 1 至 2 小时。
接下来，将板放回组织培养罩中，并使用一对无菌镊子和手术刀无菌地从插入物上切下膜。从膜上分离含有凝胶的细胞，然后将分离的凝胶切成小方块。使用填充端口将含有胶原蛋白方块的小细胞添加到预装的 50 毫升容器之一中。
接下来，如随附文本方案中所述，制备 HCT-8 人上皮细胞的悬浮液。在含有 30% FBS 的 DMEM 中以每毫升 1000 万个细胞的浓度重悬细胞。然后，使用其填充端口将 1 毫升 HCT-8 细胞悬液添加到 50 毫升容器中。
添加细胞后，向容器中再添加 20 mL 3-D 培养基，使其几乎装满。盖上盖子，用 70% 乙醇润湿加注口的边缘。接下来，将含有 3 至 4 毫升 3-D 培养基的 5 毫升注射器放入容器的一个端口中，将一个空的 5 毫升注射器放入另一个端口。
拉入空注射器以去除任何可见的气泡，同时通过另一个注射器将大致相同体积的培养基注入容器中。去除所有空气后，将容器放入生物反应器中，打开电源并将速度设置为每分钟 13 至 14 转。根据需要调整速度以防止细胞接触容器壁。
在微重力下培养细胞，每三到四天更换一次培养基。要更换培养基，请使用双注射器方法，用新鲜的 3-D 培养基替换大约 30 毫升用过的培养基。培养 3 到 5 天后，如随附的文本方案中所述分离外周血单核细胞。
然后从生物反应器中取出容器，并通过填充端口将大约 2000 万个由淋巴细胞和单核细胞组成的细胞添加到容器中。将容器放回生物反应器中，再培养 4 到 6 天。在培养的第 9 天左右，将额外的 2000 万个由淋巴细胞和单核细胞组成的细胞添加到容器中，并继续培养长达 12 天。
在实验结束时，使用移液管收获每个小凝胶片段，现在称为构建体，并将它们放入含有 10 毫升 10% 福尔马林缓冲液的六孔板的孔中。在室温下固定构建体 3 小时，然后进行标准组织学包埋、切片和染色方案。本视频中介绍的方法生成了人肠粘膜的多细胞 3-D 器官型模型。
在微重力培养中，细胞在第 20 天分化良好并形成有序的绒毛样特征。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在六个小时内完成。在尝试此程序时，请务必记住遵守良好的细胞培养指南。
系统地控制细胞的活力、支原体污染和细胞生长行为的变化至关重要。按照此程序，可以执行其他方法，如免疫组化，以识别谱系和细胞分化的标志物。看完这个视频，你应该对如何开发在微重力下培养的人类肠道粘膜的多细胞 3-D 器官型模型有一个很好的了解。
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概述
本文描述了在旋转壁容器（RWV）生物反应器下微重力条件下培养的人类肠道黏膜多细胞3-D类器官模型的开发。这种创新方法相比传统的2-D方法增强了细胞培养。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 微重力研究
背景
- 3-D细胞培养模型更好地模拟体内条件。
- 微重力环境可以影响细胞行为和相互作用。
- 旋转壁容器生物反应器促进营养和氧气扩散。
- 理解肠道黏膜对于健康和疾病研究至关重要。
研究目的
- 开发人类肠道黏膜的3-D类器官模型。
- 探索微重力环境中的细胞相互作用。
- 为研究健康和疾病机制提供平台。
使用的方法
- 利用旋转壁容器生物反应器进行细胞培养。
- 制备多细胞模型以模拟肠道黏膜。
- 评估细胞相互作用和反应。
- 评估营养和氧气扩散效率。
主要结果
- 3-D模型成功模拟了肠细胞的表型多样性。
- 微重力条件影响了细胞行为和相互作用。
- 该模型显示了研究病原体相互作用和炎症过程的潜力。
- 在生物反应器设置中实现了高效的营养和氧气扩散。
结论
- 开发的模型是细胞培养技术的重大进步。
- 它为肠道健康和疾病机制提供了新的见解。
- 这种方法可以成为未来生物医学研究的有价值工具。
