Name: 生长在微重力人体肠道黏膜的多细胞三维器官模型的建立 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 学习利用旋转壁式生物反应器在微重力条件下培养人体肠道黏膜多细胞三维器官模型的方法。该技术可模拟体内细胞表型多样性，为研究肠道健康与疾病机制提供创新平台。

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本工作部分得到了美国卫生与公共服务部联邦研究基金 NIAID、NIH、DHHS 的资助，项目编号为 R01 AI036525 和 U19 AI082655（CCHI），授予 MBS；此外，AF 还获得了 NIH 基金 DK048373 的资助。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国家过敏与传染病研究所或美国国立卫生研究院的官方观点。

伦理声明：所有血液样本均采集自参与编号为 HP-00040025-1 研究方案的志愿者。本研究方案已获得马里兰大学机构审查委员会批准，授权从健康志愿者中采集血液样本，用于本文所述的各项研究。在采血前，已向志愿者说明本研究的目的，所有志愿者均在知情同意后签署同意书。
注：培养基添加剂的配制方法见表1；3-D培养基的配制方法见表2。
1. 培养容器的准备
<ol>
	<li>拧开50 ml容器加液口的盖子，加入50 ml无菌培养基例如，RPMI）。所有操作均须在超净工作台中无菌条件下进行。</li>
	<li>盖上瓶盖，并用70%乙醇擦拭任何表面洒出的培养基。</li>
	<li>让容器在室温下孵育至少15分钟至过夜。</li>
	<li>使用灌注口弃去培养基，并加入30 ml 3-D培养基。</li>
	<li>用70%乙醇擦拭任何表面上洒出的培养基。</li>
</ol>
2. 细胞的制备
<ol>
	<li>人上皮细胞系（HCT-8)24,40.
	<ol>
		<li>在添加了100 U/ml青霉素、100 µg/ml链霉素、50 µg/ml庆大霉素、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、10 mM HEPES缓冲液和10%热灭活胎牛血清（FBS）的RPMI培养基中培养细胞补充材料1当细胞融合度达到70%时，按1:5的比例传代。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人结肠成纤维细胞（CCD-18Co 细胞)24,41.
	<ol>
		<li>在添加了补充物的巴斯尔鹰牌培养基中培养细胞 补充材料1细胞汇合时，按1:3的比例传代。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人脐静脉内皮（HUVEC) 细胞24,42.
	<ol>
		<li>在添加了100 µg/ml肝素和3 μg/ml内皮细胞生长补充剂（ECGS）的内皮基础培养基（EBM）中培养细胞 补充材料1当细胞融合度达到70%时，按1:2的比例传代。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>淋巴细胞/单核细胞
	<ol>
		<li>通过密度梯度离心法，采用标准技术从血液中分离外周血单个核细胞（PBMC）43.
		<ol>
			<li>简而言之，使用10 ml移液器，将30 ml稀释血液（1:1血液:磷酸盐缓冲液（PBS））小心加入含有10 ml密度梯度离心介质的50 ml锥形管中。离心步骤后，淋巴细胞和单核细胞将位于 &#34;白色&#34; 密度梯度离心介质与血浆层之间的界面层</li>
			<li>使用移液管收集白色层。通过限制密度梯度离心介质的收集量，避免粒细胞污染。洗涤后43，使用新鲜或液氮冻存的PBMC2. 
			注意：需要强调的是，外周血单个核细胞（PBMC）主要由淋巴细胞和单细胞组成，另含少量树突状细胞及其他细胞类型。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在37 °C、5% CO₂的培养条件下进行所有细胞的标准培养2.</li>
</ol>
3. 胶原包埋细胞的制备
<ol>
	<li>根据需要设置的实验条件数量，确定所需插入式培养小室的数量。将相应数量的插入式培养小室放入6孔板的各孔中。</li>
	<li>制备HUVEC和成纤维细胞的悬浮液：
	<ol>
		<li>用 PBS 清洗培养瓶两次，使用含 0.05% 胰蛋白酶-四钠乙二胺四乙酸（Trypsin-EDTA）的 0.25%（1x）胰蛋白酶溶液消化细胞。加入足量的胰蛋白酶溶液以完全覆盖细胞培养表面。细胞通常在 5 至&#160;15 分钟</li>
		<li>在含有30 ml含30%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）的50 ml离心管中收集悬浮细胞。</li>
		<li>将试管在500 × g条件下离心10分钟。</li>
		<li>用30 ml DMEM-30% FBS培养基重悬细胞。</li>
		<li>用20 μl重悬的细胞与20 μl台盼蓝染液混匀，稀释后计数活细胞总数。将细胞混合液加入血细胞计数板。活的外周血单个核细胞（PBMC）呈无色透明状；死细胞则摄取染料而呈蓝色。
		<ol>
			<li>将每种细胞类型重悬于DMEM-30% FBS培养基中，浓度为5 - 8 x 107 细胞/毫升- 1.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备含细胞的胶原凝胶 
	注意： 每个容器需要制备约 5 ml 含细胞的胶原凝胶。
	<ol>
		<li>在50 ml锥形管中，加入1×DMEM培养基，并添加50 µg/ml庆大霉素、2 mM L-谷氨酰胺和10%热灭活胎牛血清，再加入3 mg/ml牛I型胶原、10 μg/ml层粘连蛋白、40 μg/ml IV型胶原、10 μg/ml纤连蛋白、2 μg/ml硫酸乙酰肝素蛋白聚糖以及15 mM NaOH（调节至生理pH），配制胶原混合液。</li>
		<li>盖上管盖，通过反复倒置混匀数次，直至混合物完全均一。避免产生气泡。 
		重要提示：将混合物置于冰上，以防止凝胶化。
		<ol>
			<li>关键步骤： 如果混合物呈现酸性外观（黄色），则加入几滴无菌的 1 N NaOH 以中和混合物。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>以 1.0 - 1.2 × 10⁶ 和 1.5 - 2.0 × 10⁶ 个/mL 的密度分别接种浓缩的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和成纤维细胞6 细胞/ml，分别加入至上述制备的富集胶原混合物中。盖紧管盖，通过反复倒置混匀数次，直至混合物完全均一。避免产生气泡。重要提示：将混合物置于冰上，以防止凝胶化。</li>
		<li>向预先放入6孔板的每个插件中加入4-5 ml含细胞的胶原凝胶，在生物安全柜中静置1小时，避免移动，使其凝固。</li>
		<li>孵育1小时后，将6孔板转移至37 °C、5% CO₂的培养箱中2 孵育箱中继续孵育1至2小时。</li>
		<li>将6孔板放回超净台中，使用无菌镊子和手术刀在无菌条件下将插入膜从插入物上切下，使含细胞的凝胶与膜分离。将分离的凝胶切成小块（约5 × 5 mm）。</li>
		<li>通过灌注口将含有少量细胞的小块加入50 ml HARV中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备HCT-8上皮细胞悬液：
	<ol>
		<li>用 PBS 清洗培养瓶两次，使用 0.25% (1x) 胰蛋白酶-EDTA 溶液消化细胞。加入足量的胰蛋白酶溶液以完全覆盖细胞培养表面。细胞通常在 10 至 15 分钟内脱落。</li>
		<li>收集脱落的细胞至30 ml DMEM-30% FBS培养基中。</li>
		<li>将含有 DMEM-30% FBS 培养基的离心管在 500 × g 条件下离心 10 分钟。</li>
		<li>用30 ml DMEM-30% FBS培养基重悬细胞。</li>
		<li>按照3.2.5节所述方法计数活细胞总数。</li>
		<li>将HCT-8上皮细胞重悬于DMEM-30% FBS培养基中，细胞浓度为107 细胞/毫升- 1.</li>
		<li>通过加样口将1 ml浓缩的HCT-8上皮细胞加入50 ml HARV中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过灌注口加入额外的3-D培养基，直至容器几乎充满（约20 ml）。</li>
	<li>更换瓶盖，并用70%乙醇擦拭加样口边缘。</li>
	<li>在RWV的每个注射器端口放置一个注射器：在一个端口中放入装有3–4 ml三维培养基的5 ml注射器，在另一个端口中放入一个5 ml空注射器。</li>
	<li>通过另一注射器端口注入大致相同体积的培养基，同时将气泡吸至空注射器中，以去除可见气泡。</li>
	<li>将容器放入生物反应器中，打开电源，将转速设置为每分钟约13至14转。 
	注意：关键步骤： 在实验过程中，可能需要多次调整旋转速率，以保持细胞在容器内呈轨道运动，从而避免其与容器壁接触。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养细胞2 在RWV生物反应器提供的微重力条件下。</li>
	<li>每3至4天更换一次培养基，每次更换约30 ml新鲜的3-D培养基。</li>
	<li>4天（±1天）后，从生物反应器中取出血管，并向血管中加入淋巴细胞/单核细胞（2 × 10⁶ cells/mL）。7/血管</li>
	<li>将容器放回生物反应器中，在37 °C、5% CO₂条件下继续培养2 再额外培养5天（±1天）。</li>
	<li>在额外培养5天后（即培养第9天），将淋巴细胞/单核细胞加入到血管中（2 x 107/容器）并继续培养最多额外12天。</li>
	<li>每3至4天更换一次培养基，每次更换约30 ml新鲜的3-D培养基。</li>
</ol>
4. 用于组织学的三维培养物的收获
<ol>
	<li>使用移液管将每一块小的凝胶碎片（现在称为&#34;construct&#34;）收集至含有10 ml 10%甲醛缓冲液的六孔板中。室温下放置3小时，或4 °C下放置12–16小时。</li>
	<li>通过标记并往每个组织处理与包埋盒中加入两片活检泡沫垫，来准备组织处理和包埋用的盒。</li>
	<li>将包埋盒浸入10%甲醛缓冲液中。</li>
	<li>借助镊子将固定后的construct置于两片泡沫垫之间。</li>
	<li>再次将包埋盒浸入10%甲醛缓冲液中。</li>
	<li>按照标准流程进行包埋、切片和染色44。</li>
</ol>

作者声明已向美国专利商标局提交了美国非临时专利申请（申请号：13/360,539）。

在本研究中，我们描述了一种由多种细胞类型构成的人类肠黏膜生物工程模型的构建，这些细胞类型包括原代人类淋巴细胞、成纤维细胞、内皮细胞以及肠上皮细胞系24。在该三维模型中，细胞在富含胶原蛋白的细胞外基质中培养，并处于微重力条件下24。
如前所述，该模型的主要特征包括：（i） 能够模拟上皮组织单层结构的排列，（ii） 诱导上皮细胞形成适当的极性，并形成紧密连接、桥粒和微绒毛，（iii） 长期培养（长达20天）并保持原代细胞（即，成纤维细胞和内皮细胞）的高存活率，（iv） 表达类似组织的分化标志物，包括绒毛蛋白（villin）、细胞角蛋白（cytokeratin）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）和黏蛋白（mucin），（v） 在抗原刺激下能够产生大量细胞因子（例如，IL-8）和碱性磷酸酶，（vi） 营养物...

20世纪80年代初，科学家开始研究不同类型的支架，由此实现了构建三维模型的首次突破例如层粘连蛋白、I 型胶原、IV 型胶原和纤连蛋白）以及生长因子混合物，以增强细胞间及细胞外基质的相互作用 &#34;静态&#34; 3-D 模型1-7此后，这些模型面临的主要问题在于培养基和组织构建物内部营养物质和氧气的传递受限8与……中的细胞相反 体内 环境从周围血管网络持续获得营养物质和氧气，但这些模型的静态特性阻碍了营养物质和氧气向细胞的有效输送。例如，在静态条件下生成的细胞聚集体 体外 尺寸超过几毫米的静态模型 invariably 会形成缺氧、坏死的核心9RWV 生物反应器可能通过提供有利于营养物质和氧气高效扩散的流体动力学条件来规避这一问题 10-12然而，迄今为止，使用RWV生物反应器的研究仅限于包含一种或两种细胞类型 13-17此外，这些细胞并未形成与天然组织相似的空间取向，而是聚集成团。造成这些局限性的主要原因在于缺乏能够以整合方式容纳细胞的支架。迄今为止，在RWV生物反应器中使用的支架大多如此，仅有少数例外 16-18，主要为合成微珠、管状圆柱体或小片状材料 13-15,19-23这些是刚性材料，其成分和柔韧性无法调节，细胞仅能附着在其表面。因此，这些模型不太可能提供一个能够以整合方式评估各种细胞组分（如基质细胞）的系统。例如成纤维细胞、免疫细胞和内皮细胞）应分散于支架内，以紧密模拟人体组织。
本文描述了一种多细胞三维类器官模型的构建方法，该模型模拟人类肠黏膜组织，由肠上皮细胞系以及原代人淋巴细胞、内皮细胞和成纤维细胞组成24。这些细胞在RWV生物反应器提供的微重力条件下进行培养13,25-30。在我们的三维模型中，细胞外基质（ECM）具有多种独特性质，例如渗透压与培养基相近（如，培养过程中扩散限制可忽略不计），能够整合细胞及其他相关细胞外基质蛋白，并具备适用于生物反应器的适当刚度24。生物系统极为复杂，近年来，黏膜研究的重点已逐渐从孤立研究单个细胞转向考察细胞与其周围环境之间的相互作用。特别是细胞间相互作用对肠道细胞存活与分化的影响已有充分文献记载31-34。具体而言，上皮细胞与其微环境之间的信号交流对上皮细胞的增殖与分化具有深远影响35。目前普遍认为，在三维培养模型中，不仅细胞与细胞之间的相互作用，而且细胞与细胞外基质（ECM）的相互作用，对于上皮细胞的维持和分化均至关重要。先前的研究表明，肠道细胞外基质蛋白，如I型胶原24,36,37、层粘连蛋白38和纤连蛋白39，在引导肠上皮细胞获得类似于天然黏膜的空间取向方面发挥关键作用。因此，若研究人员希望重建肠道微环境复杂的细胞组成、结构架构及功能，则亟需开发能够模拟肠道表型多样性的新技术，例如我们所建立的三维模型24。这类模型在新型口服药物和疫苗候选物的研发与评估中具有重要意义。

<table><tbody><tr><td>四轴旋转/独立旋转壁式生物反应器（RWV）&amp;nbsp;</td><td>Synthecon</td><td>RCCs-4DQ</td><td>适用于最多4个容器。也可提供容器数量更多或更少的型号。</td></tr><tr><td>一次性50 ml容器</td><td>Synthecon</td><td>D-405</td><td>含4个容器的盒子</td></tr><tr><td>HCT-8 上皮细胞&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-244</td><td></td></tr><tr><td>CCD-18Co 成纤维细胞&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1459</td><td></td></tr><tr><td>人脐静脉内皮细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1730</td><td>HUVEC</td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>bFGF</td></tr><tr><td>干细胞因子&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S7901</td><td>SCF</td></tr><tr><td>肝细胞生长因子&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H1404</td><td>HGF</td></tr><tr><td>内皮素3</td><td>Sigma</td><td>E9137</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td>从小鼠Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤中分离</td></tr><tr><td>血管内皮生长因子&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>V7259</td><td>VEGF</td></tr><tr><td>白血病抑制因子&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-4377</td><td>白血病抑制因子（LIF）</td></tr><tr><td>腺嘌呤</td><td>Sigma</td><td>A2786</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma</td><td>I-6634</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T-6397</td><td>T3</td></tr><tr><td>霍乱毒素</td><td>Sigma</td><td>C-8052</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>BD</td><td>354008</td><td>从人血浆中分离</td></tr><tr><td>脱铁转铁蛋白</td><td>Sigma</td><td>T-1147</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>硫酸乙酰肝素&amp;nbsp; 蛋白聚糖</td><td>Sigma</td><td>H4777</td><td>从小鼠基底膜中分离&amp;nbsp; Engelbreth-Holm-Swarm 肿瘤</td></tr><tr><td>IV型胶原蛋白</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>从人胎盘中分离</td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM，粉末</td><td>Invitrogen</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>10% 甲醛&amp;ndash;PBS&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>牛I型胶原蛋白&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1064401</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Invitrogen</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>基础伊格尔培养基</td><td>Invitrogen</td><td>21010-046</td><td>生物医学工程</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>内皮细胞基础培养基</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td>EBM-2</td></tr><tr><td>内皮细胞生长补充剂</td><td>Millipore</td><td>02-102</td><td>心电图系统</td></tr></tbody></table>

在微重力条件下培养的人类肠黏膜多细胞三维类器官模型的构建

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

由于在三维（3-D）环境中生长的细胞有可能弥补二维（2-D）环境（例如，培养瓶或培养皿）中细胞培养的诸多不足。事实上，人们普遍认为，在培养瓶或培养皿中生长的细胞倾向于去分化，并丧失其来源组织的特化特征。目前，主要有两种类型的三维培养系统，其中细胞被接种到模拟天然细胞外基质（ECM）的支架中：（a）静态模型和（b）使用生物反应器的模型。首个突破是静态三维模型。使用旋转壁式生物反应器（RWV）等生物反应器的三维模型则是较新的发展。RWV生物反应器的最初概念于20世纪90年代初由美国国家航空航天局（NASA）约翰逊航天中心开发，被认为能够克服静态模型的局限性，例如缺氧和坏死核心的形成。RWV生物反应器可能通过提供流体动力学环境，促进营养物质和氧气的有效扩散，从而规避这一问题。这些生物反应器由一个旋转底座组成，用于支撑并旋转两种不同类型的培养容器，二者区别在于供气源类型：（1）中心带有同轴氧合器的慢转横向容器（STLVs），或（2）通过扁平硅橡胶气体交换膜供氧的高宽比容器（HARVs）。这些容器可在避免气泡形成及由此引起的湍流的同时，实现高效的气体交换。这些条件导致层流和极低的剪切力，从而在培养容器内模拟出低重力（微重力）环境。本文描述了一种由肠上皮细胞系以及原代人淋巴细胞、内皮细胞和成纤维细胞共同构成的多细胞三维类器官模型，用于模拟人类肠黏膜，其在RWV生物反应器提供的微重力条件下进行培养。

此前，我们构建了一种由肠上皮细胞系与原代人淋巴细胞、内皮细胞和成纤维细胞组成的多细胞三维类器官模型，用于模拟人肠黏膜结构，该模型在微重力条件下进行培养24（图 1）。成纤维细胞和内皮细胞被包埋于富含其他肠道基底膜蛋白的I型胶原基质中45（即层粘连蛋白、IV型胶原、纤连蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖），并接种于RWV生物反应器中。培养10至15天后，组织学染色分析显示，构建物中形成了类似绒毛的结构。其中约60%至80%的上皮细胞排列为单层极化细胞，细胞核位于靠近细胞外基质（ECM）的基底部，这是高度分化细胞的主要特征之一（图 2）。
<img alt="细胞培养过程示意图：在RWV系统中培养成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞的步骤。" src="/files/ftp_upload/54148/54148fig1.jpg" data-a...

在三维（3-D）环境中生长的细胞相较于在二维（2-D）环境中培养的细胞具有显著改进例如，培养瓶或培养皿）。本文描述了一种在旋转壁式生物反应器（RWV）提供的微重力条件下培养的人类肠黏膜多细胞三维类器官模型的建立方法。

由于在三维（3-D）环境中生长的细胞有可能弥补二维（2-D）环境细胞培养中的诸多不足（例如，……）

本实验的总体目标是描述一种在旋转壁式生物反应器提供的微重力条件下培养的人类肠黏膜多细胞三维类器官模型的建立方法。该方法作为健康与疾病研究领域的发现工具，具有广泛的应用潜力，包括病原体相互作用、抗原转运以及炎症过程的研究。该技术的主要优势在于能够模拟猫的表型多样性，并使用D-12容器生物反应器，后者可实现营养物质和氧气的有效扩散。首先，拧开培养容器加样口的盖子，加入50毫升的PMI培养基。待容器加满后，重新盖上盖子，并用70%乙醇擦拭洒出的培养基。让容器在室温下孵育至少15分钟至过夜。准备继续操作时，通过加样口弃去培养基，并向容器中加入30毫升3-D培养基。盖上加样口的盖子，再次用70%乙醇擦拭洒出的培养基。从培养箱中取出含有近融合状态的人脐静脉内皮细胞和人结肠成纤维细胞的培养瓶，用 PBS 洗涤两次。随后，用含 0.05% EDTA 的 0.25% 胰蛋白酶溶液覆盖细胞使其解离。待细胞脱落之后，将其收集至预先装有 30 毫升含 30% FBS 的 DMEM 的 50 毫升离心管中。将离心管离心10分钟，使细胞沉淀。然后，用30毫升含有30% FBS的DMEM重新悬浮细胞。接着，取20微升重悬的细胞与20微升台盼蓝染料混合稀释。使用细胞混合液上样血细胞计数板，并计数活细胞浓度。然后，将每种细胞类型以每毫升5000万至8000万个细胞的密度重悬于含30% FBS的DMEM中。首先，将适当数量的培养小室放入6孔板的孔中。接下来，通过先将10倍浓度DMEM、10倍浓度重悬培养基、200毫摩尔L-谷氨酰胺以及热灭活胎牛血清加入50毫升锥形管中来制备胶原混合液。然后依次加入牛I型胶原、层粘连蛋白、IV型胶原、纤连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，最后加入氢氧化钠以中和溶液的pH值。若在操作过程中混合液出现黄色酸性外观，可加入数滴无菌的1摩尔氢氧化钠溶液以中和混合液。关闭管盖，通过反复倒置混匀溶液，避免产生气泡。不混匀时，将溶液置于冰上，防止其发生聚合。混匀后，将细胞悬液加入胶原蛋白制备物中，并通过轻轻反复倒置管子混匀，避免产生气泡。然后将它们放回冰上。向每个插入物中加入四到五毫升含细胞的胶原溶液，置于生物安全柜中静置一小时，使胶原凝胶形成，期间尽量避免移动。一小时后，将六孔板转移至培养箱中继续孵育一至两小时。接下来，将培养板放回组织培养罩内，使用无菌镊子和手术刀将插入物中的膜无菌切割下来。将含有细胞的凝胶从膜上分离，并将分离的凝胶切成小块。通过加样口，将含有细胞的小块胶原凝胶加入一个预先装好的50毫升容器中。接下来，按照随附的文字实验方案制备 HCT-8 人上皮细胞悬液。用含 30% FBS 的 DMEM 将细胞重悬，浓度为每毫升 1000 万个细胞。然后，通过 50 毫升容器的加样口加入 1 毫升 HCT-8 细胞悬液。加入细胞后，再向容器中添加额外的 20 毫升 3-D 培养基，使其几乎装满。盖上盖子，并用 70% 乙醇润湿加样口的边缘。接着，将一支含有 3 至 4 毫升 3-D 培养基的 5 毫升注射器插入容器的一个端口，另一支空的 5 毫升注射器插入另一个端口。通过另一注射器向容器内注入大致相同体积的培养基，同时用空注射器抽出可见气泡。待所有空气完全排出后，将容器放入生物反应器中，开启电源并将转速设定为每分钟13至14转。根据需要调节转速，以防止细胞接触容器壁。在微重力条件下培养细胞，每三至四天更换一次培养基。更换培养基时，采用双注射器法，将约30毫升用过的培养基替换为新鲜的3-D培养基。培养三至五天后，按照随附文字方案所述方法分离外周血单个核细胞。然后将容器从生物反应器中取出，通过加样口向容器中加入约2000万个由淋巴细胞和单核细胞组成的细胞。将容器重新放回生物反应器中，继续培养4至6天。在培养的第9天左右，向容器中再加入2000万个由淋巴细胞和单核细胞组成的细胞，并继续培养最多额外12天。实验结束时，使用移液管收集每个小的凝胶碎片（现称为构建物），并将其放入含有10毫升10%福尔马林缓冲液的六孔板的孔中。在室温下固定构建物3小时，然后按照标准的组织学包埋、切片和染色流程进行操作。本视频介绍的方法可构建一种多细胞的三维人类肠黏膜类器官模型。在微重力培养条件下，细胞在第20天会变得高度分化，并形成有序的、类似绒毛的结构。一旦掌握，若操作得当，该技术可在六小时内完成。在进行该操作时，重要的是要牢记遵循良好的细胞培养规范。必须系统地对细胞进行活力、支原体污染以及细胞生长行为变化的检测。完成该操作步骤后，可进一步采用其他方法，如免疫组织化学，以鉴定细胞谱系和分化相关的标志物。观看本视频后，您应能够充分理解如何构建在微重力条件下培养的人类肠黏膜多细胞三维类器官模型。

development-multicellular-three-dimensional-organotypic-model-human

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

生长在微重力人体肠道黏膜的多细胞三维器官模型的建立

改进的成像技术使得在器官发育过程中进行三维成像成为可能。本文介绍了一种完整的器官培养系统，可实现对胎鼠肠道中发育中的绒毛进行活体成像。...

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本文介绍一种培养具有完整屏障功能的人类肠类器官或结肠类器官单层细胞的实验方案，用于在细胞和生化水平上研究宿主上皮细胞与微生物群之间的相互作用。...

用于研究病原体、共生菌与宿主肠上皮相互作用的人类结肠类器官单层培养模型

本文介绍了由人源类器官衍生的肠上皮单层细胞的制备方法，用于研究肠道屏障功能、通透性及物质转运。由于类器官能够再现原始上皮组织对外界刺激的反应，因此该模型兼具细胞系可扩增性的优势以及原代组织的相关性和复杂性。...

类器官来源的上皮单层：一种用于肠道屏障功能研究的临床相关体外模型

本文介绍了两种可用于模拟肠道顶膜特异性相互作用的实验方案。类器官来源的肠道单层细胞培养和气液界面（ALI）培养可形成高度分化的上皮层，且可同时从管腔侧和基底侧进行操作；而极性翻转的肠道类器官则将其顶膜暴露在外，适用于高通量检测。...

利用肠道类器官模型研究顶端特异性相互作用的培养方法

将活检来源的肠道类器官与器官芯片技术结合，构建出一种微生理系统平台，用以模拟特定区域的肠道功能。...

结合人类类器官与器官芯片技术模拟肠道区域特异性功能

本实验方案描述了建立小鼠结肠类器官系统，用于研究在claudin-7基因敲除模型中结肠干细胞的活性与功能。...

小鼠结肠隐窝的三维培养用于研究肠道干细胞功能 离体

我们描述了一种分离小鼠小肠隐窝并从隐窝培养肠道三维类器官的方案。此外，我们还介绍了一种在无上皮下细胞微环境的条件下，由单个肠干细胞生成类器官的方法。...

从小鼠肠隐窝及单个干细胞进行类器官的三维培养用于类器官研究

在此，我们介绍一种用于生成大鼠肠道类器官并将其应用于多种下游实验的方案。大鼠常被作为首选的临床前模型，而稳定的肠道类器官系统填补了该领域对一种可靠的体外模型的需求。 体外 系统以配合 体内...

大鼠肠道类器官的生成与操作

本文介绍了一种构建基础的三维（3D）肠道细胞系模型系统的方法，以及对固定后的肠道类似物进行石蜡包埋以用于光学显微镜观察的实验方案。通过对特定蛋白进行染色，可从单次实验中分析多个可视化参数，有望应用于临床前药物筛选研究。...

含免疫组分的基础三维（3D）肠道模型系统

将犬类肠道类器官与“肠芯片”微流控系统相结合，为人类肠道疾病提供了具有相关性的转化研究模型。所介绍的方案支持三维形态发生和动态培养 体外 肠道建模，助力犬类和人类肠道疾病的治疗开发，推动同一健康（One...

利用炎症性肠病患者来源的肠道类器官在犬类肠芯片中实现三维形态发生

本研究概述了一种从猪的小肠和大肠来源的类器官生成二维单层细胞的方案。这些单层细胞的生长伴随着跨上皮电阻（TEER）值的升高，表明上皮完整性良好。此外，在Ussing室实验中，施加佛司可林后，这些单层细胞表现出生理性的分泌反应。...

二维猪肠道类器官反映原生肠道的生理特性

学习利用旋转壁式生物反应器在微重力条件下培养人体肠道黏膜多细胞三维器官模型的方法。该技术可模拟体内细胞表型多样性，为研究肠道健康与疾病机制提供创新平台。

在微重力条件下培养的人类肠黏膜多细胞三维类器官模型的构建

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