在微重力条件下培养的人类肠黏膜多细胞三维类器官模型的构建

本实验的总体目标是描述一种在旋转壁式生物反应器提供的微重力条件下培养的人类肠黏膜多细胞三维类器官模型的建立方法。该方法作为健康与疾病研究领域的发现工具，具有广泛的应用潜力，包括病原体相互作用、抗原转运以及炎症过程的研究。

该技术的主要优势在于能够模拟猫的表型多样性，并使用D-12容器生物反应器，后者可实现营养物质和氧气的有效扩散。首先，拧开培养容器加样口的盖子，加入50毫升的PMI培养基。待容器加满后，重新盖上盖子，并用70%乙醇擦拭洒出的培养基。

让容器在室温下孵育至少15分钟至过夜。准备继续操作时，通过加样口弃去培养基，并向容器中加入30毫升3-D培养基。盖上加样口的盖子，再次用70%乙醇擦拭洒出的培养基。

从培养箱中取出含有近融合状态的人脐静脉内皮细胞和人结肠成纤维细胞的培养瓶，用 PBS 洗涤两次。随后，用含 0.05% EDTA 的 0.25% 胰蛋白酶溶液覆盖细胞使其解离。待细胞脱落之后，将其收集至预先装有 30 毫升含 30% FBS 的 DMEM 的 50 毫升离心管中。

将离心管离心10分钟，使细胞沉淀。然后，用30毫升含有30% FBS的DMEM重新悬浮细胞。接着，取20微升重悬的细胞与20微升台盼蓝染料混合稀释。

使用细胞混合液上样血细胞计数板，并计数活细胞浓度。然后，将每种细胞类型以每毫升5000万至8000万个细胞的密度重悬于含30% FBS的DMEM中。首先，将适当数量的培养小室放入6孔板的孔中。

接下来，通过先将10倍浓度DMEM、10倍浓度重悬培养基、200毫摩尔L-谷氨酰胺以及热灭活胎牛血清加入50毫升锥形管中来制备胶原混合液。然后依次加入牛I型胶原、层粘连蛋白、IV型胶原、纤连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，最后加入氢氧化钠以中和溶液的pH值。若在操作过程中混合液出现黄色酸性外观，可加入数滴无菌的1摩尔氢氧化钠溶液以中和混合液。

关闭管盖，通过反复倒置混匀溶液，避免产生气泡。不混匀时，将溶液置于冰上，防止其发生聚合。混匀后，将细胞悬液加入胶原蛋白制备物中，并通过轻轻反复倒置管子混匀，避免产生气泡。

然后将它们放回冰上。向每个插入物中加入四到五毫升含细胞的胶原溶液，置于生物安全柜中静置一小时，使胶原凝胶形成，期间尽量避免移动。一小时后，将六孔板转移至培养箱中继续孵育一至两小时。

接下来，将培养板放回组织培养罩内，使用无菌镊子和手术刀将插入物中的膜无菌切割下来。将含有细胞的凝胶从膜上分离，并将分离的凝胶切成小块。通过加样口，将含有细胞的小块胶原凝胶加入一个预先装好的50毫升容器中。

接下来，按照随附的文字实验方案制备 HCT-8 人上皮细胞悬液。用含 30% FBS 的 DMEM 将细胞重悬，浓度为每毫升 1000 万个细胞。然后，通过 50 毫升容器的加样口加入 1 毫升 HCT-8 细胞悬液。

加入细胞后，再向容器中添加额外的 20 毫升 3-D 培养基，使其几乎装满。盖上盖子，并用 70% 乙醇润湿加样口的边缘。接着，将一支含有 3 至 4 毫升 3-D 培养基的 5 毫升注射器插入容器的一个端口，另一支空的 5 毫升注射器插入另一个端口。

通过另一注射器向容器内注入大致相同体积的培养基，同时用空注射器抽出可见气泡。待所有空气完全排出后，将容器放入生物反应器中，开启电源并将转速设定为每分钟13至14转。根据需要调节转速，以防止细胞接触容器壁。

在微重力条件下培养细胞，每三至四天更换一次培养基。更换培养基时，采用双注射器法，将约30毫升用过的培养基替换为新鲜的3-D培养基。培养三至五天后，按照随附文字方案所述方法分离外周血单个核细胞。

然后将容器从生物反应器中取出，通过加样口向容器中加入约2000万个由淋巴细胞和单核细胞组成的细胞。将容器重新放回生物反应器中，继续培养4至6天。在培养的第9天左右，向容器中再加入2000万个由淋巴细胞和单核细胞组成的细胞，并继续培养最多额外12天。

实验结束时，使用移液管收集每个小的凝胶碎片（现称为构建物），并将其放入含有10毫升10%福尔马林缓冲液的六孔板的孔中。在室温下固定构建物3小时，然后按照标准的组织学包埋、切片和染色流程进行操作。本视频介绍的方法可构建一种多细胞的三维人类肠黏膜类器官模型。

在微重力培养条件下，细胞在第20天会变得高度分化，并形成有序的、类似绒毛的结构。一旦掌握，若操作得当，该技术可在六小时内完成。在进行该操作时，重要的是要牢记遵循良好的细胞培养规范。

必须系统地对细胞进行活力、支原体污染以及细胞生长行为变化的检测。完成该操作步骤后，可进一步采用其他方法，如免疫组织化学，以鉴定细胞谱系和分化相关的标志物。观看本视频后，您应能够充分理解如何构建在微重力条件下培养的人类肠黏膜多细胞三维类器官模型。