一种扫描电子显微镜兼容的光学成像方法，用于中观全细胞脑映射

我们的研究聚焦于连接组学。我们开发了高通量光学或电子图像采集方法，能够分析神经回路和突触连接特征，从而破译神经回路的基本连接逻辑。最初的高转速连接组学因数据采集成本高且精确性高，仅限于小脑容量，而快速显微分析和靶向显微研究则有望实现全脑连接组学。

与其他显微镜方法（如各种拉森显微镜）相比，OMLIT能够捕捉所有具有树突和轴突忧虑信息的神经元图像。除了与电子显微镜的兼容性外，EF技术下还支持纳米级分辨率成像。OMLIT帮助构建全面的大脑模型，绘制所有远程投射，包括方向、强度和类型，结合本地微回路，结合序列主题。它提供了对整个大脑结构化结构和信息流动的洞见。

我们正在开发自动化OMLIT成像和EM数据采集，指导OMLIT定义的RI，实现跨大脑或全脑体积的高效连接组数据收集和分析。首先，选择厚度为50微米的Capton或D50薄膜，安装在电动绕组系统上。使用双头磁控管溅射系统，将铬或其他金属（如铝、银、铜）均匀薄膜沉积到磁带表面。

将胶带放置在距离溅射目标80毫米处的位置。在直流电下进行该工艺，压力为一帕斯卡，由99.99%氩气调节。现在，将磁带绕制速度设置为0.6毫米每秒，以实现金属涂层厚度达到50纳米。

沉积后，等胶带冷却到室温后，取出系统中的磁带。使用唱针剖面仪、原子力显微镜或扫描电子显微镜评估涂层的厚度和均匀性。为了降低反射率，使用80瓦功率的等离子体清洁剂清洁并使磁带亲水，同时以每秒7毫米的速度移动磁带。

处理后，在胶带表面放置水滴，以确认它们迅速扩散成薄膜。使用小型磨床或类似切割工具，粗略修剪样品侧的树脂，去除周围的空白树脂，露出样品区域。将树脂嵌入的块体放入样品架并拧紧以牢固固定块体。

将样本架安装在切片机的可动臂上。在刀架上以45度角安装玻璃刀或金刚石修边刀。在显微镜下，将样品表面修剪成金字塔形状并使其光滑，然后修剪并平滑样品块的四面以去除多余树脂。

旋转旋钮，使滑块的前后边缘水平对齐。取出修剪刀，换上钻石刀，并以45度角放置。将切片机底座的倾斜角度设为六度，并用旋钮缓慢移动刀柄，直到刀刃前缘距离样品表面1到2毫米。

观察样品表面与刀刃之间的明亮带，调整倾斜角度，使带从上到下和左右均等。现在，将蒸馏水注入钻石刀的凹槽中润湿刀刃。用注射器取出一些水，直到液体水平下降，反光呈现银色。

接着，在控制单元中设置截面厚度切割速度和切割窗口。根据样品质量，将切片速度调整为0.6毫米每秒，切片厚度调整为60纳米。开始用切片机切片。

一旦产生稳定且均匀的截面，暂停该过程。然后用细刷去除切割的部分和杂质。现在将涂层磁带卷轴和空卷带盘安装到自动超薄截面收集系统上。

固定锁紧机构并进行试运行，以确认磁带在恒定速度下移动顺畅且正确收回卷轴。将带带采集装置的采集头浸入金刚石刀的水浴中，并调整其头部使其与刀刃平行，角度为样品切片长度的1.5倍。确保收集设备安全，继续分段，同时运行磁带收集设备。

收集到足够多连续切片后，暂停切片。在没有分段的地方剪胶带。运行磁带收集装置，直到所有磁带都缠绕在卷轴上。

接着，取下卷轴，放入电子烘干炉。清洁磁带采集设备和切片机，并将所有配件放回原位。安装在硅晶圆上时，撕下双面导电胶带上的透明保护膜。

将胶带与双面导电胶带平行贴合，每块胶带最多贴三段。将硅晶圆放置在光学显微镜的台上，并用无残留胶带固定。使用五倍物镜拍摄硅片、磁带和样品的概览图像。

在概览图像中，勾勒出每个部分并排序，然后添加焦点和曝光点，以实现20倍或50倍放大率的自动成像，覆盖整个晶圆。成像后保存图像并检查质量，如果有模糊或质量差，则重新对焦和重新成像。通过选择导入，将TIFF图像栈导入VAST 22，然后选择从图像导入图像卷到VSV文件。

连接一个外部绘图板，使用画笔工具和绘制分段模式手动分割和描摹结构。使用快捷键A和Z键在图像切片间导航。现在，通过选择窗口、3D查看器、查看和更新，三维可视化分段结构。

最后，在选择文件并保存分割后保存分割结果。在高反射率图像中，细胞质和血管腔区的强度高于周围区域，而在低反射率图像中，细胞质和血管腔区的强度较低。量化结果表明，高反射率和低反射率策略。

它们在对比度和信息熵方面各有优势。OMLIT光学显微成像使得轴突、血管、细胞体和树突的识别成为可能。利用VAST手工分割煎蛋卷图像，显示出众多紧密排列的细胞体、树突和轴突。

分割结果与原始图像结合生成三维可视化。放大OMLIT图像分辨率不足，无法显示更细微的结构。同一区域的电子显微镜图像显示突触、线粒体、细胞核和囊泡。