Name: 一种扫描电子显微镜兼容的光学成像方法，用于中观全细胞脑映射 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-20T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 了解光学多层干涉断层扫描技术（OMLIT），这是一种用于中观全细胞脑成像的新型光学成像方法，可与扫描电子显微镜无缝集成，实现无偏倚的神经元和突触连接分析。

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本工作得到中国国家自然科学基金（32271430，62361166631）和中国科学技术部（2023YFF0715904）的支持。我们感谢苏州生物医学工程技术研究所公共技术中心以及合肥综合性国家科学中心人工智能研究院脑成像设施在OMLIT和连续电镜成像方面提供的支持。

所有动物实验均按照中国科学技术大学的机构指南及相关国家法规进行。OMLIT成像的样品制备遵循与传统电子显微镜相同的方案，我们所采用的具体步骤已在其他文献中描述21。简言之，在麻醉后，小鼠经心脏依次灌注二甲胂酸钠缓冲液、人工脑脊液（ACSF），最后灌注含戊二醛和多聚甲醛的固定液。随后小心取出脑组织，并切取约1 × 1 × 1 mm³的脑组织块。样品随后进行化学固定、连续重金属染色、脱水并包埋于树脂中。该方案的整体工作流程见图1。
<img alt="超薄切片示意图；胶带制备、安装、溅射镀膜、电子显微镜和光学显微镜成像步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68814/68814fig1.jpg" data-altupdatedat="1773720005000" data-alt="图1"> 
图1：工作流程概览。（A）本方案中提到的收集胶带（从左至右：聚酰亚胺、D-50 和碳纳米管涂层 PET）。（B）修整后样品的连续切片与收集。（C）将含有收集切片的带状物安装到圆形硅晶圆上。（D）光学显微镜成像，比例尺：100 µm。（E）碳镀膜。（F）电子显微镜成像，对应于图1D中标出的区域，比例尺：10 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68814/68814fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
1. 胶带准备
注意：以下操作应在洁净室中进行，以防止灰尘污染胶带。
<ol>
	<li>高反射率策略
	<ol>
		<li>选择 Kapton（下文简称聚酰亚胺胶带，厚度 50 µm）或 Panlite 薄膜（下文简称 D-50，厚度 50 µm），并将其安装至电动卷绕系统上。此处以聚酰亚胺胶带为例。 
		注：本研究中使用了一种由步进电机驱动、通过 Arduino 控制板调控的电动卷绕装置，用于将胶带从一个卷轴经溅射等离子体锥区传输至另一卷轴。为补偿因驱动卷轴上胶带累积导致的线速度增加（即收卷卷轴直径增大），编写了程序，在每次完成 360° 旋转后连续调低收卷卷轴的角速度。</li>
		<li>使用磁控溅射系统（双头溅射）在胶带表面沉积一层均匀的 Cr 薄膜（或其他金属如 Al、Ag 或 Cu）。将胶带置于距溅射靶材 80 mm 的位置以实现最佳沉积效果。在直流电源和由 99.99% 氩气调节至 1.0 Pa 的气压条件下进行沉积。</li>
		<li>将胶带卷绕速度设置为 0.6 mm/s，以获得 50 nm 的金属涂层厚度。沉积完成后，在高真空条件下缓慢冷却腔室至室温（RT），以最小化涂层应力。 
		注：相同胶带上最佳涂层厚度可能因所用金属类型不同而有所变化。可通过调节胶带移动速度获得多种涂层厚度，例如 50、70、100、150 和 200 nm。</li>
		<li>使用触针式轮廓仪、原子力显微镜或扫描电子显微镜评估涂层的厚度与均匀性。</li>
		<li>使用等离子清洗机在 80 W 功率下对胶带进行清洗并使其具有亲水性，胶带移动速度为 7 mm/s。处理后，滴加在胶带表面的水滴应迅速铺展成一层薄液膜（图 2A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>低反射率策略 
	注：本方案允许使用 D-50 胶带或市售的碳纳米管（CNT）涂层聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）胶带。尽管后者在电子显微镜成像过程中可能引入一定程度的背景噪声（虽不强烈），但仍可能影响电镜图像的分割效果。因此，以下描述仍以 D-50 胶带为例。
	<ol>
		<li>准备 D-50 薄膜，并将整张薄膜裁切成约 7 mm 宽的胶带。使用胶带的一个暴露面用于收集切片，另一面则用一层哑光膜保护，以防划伤和污染。在后续硅片粘附步骤中去除哑光膜。</li>
		<li>当需要收集较多切片时，可将多段 D-50 胶带连接在一起。使用双面胶带固定各段胶带之间的接头。 
		注：粘贴胶带段时，应确保前一段胶带通过双面胶从上至下覆盖后一段胶带。尽量减少胶粘区域，并在胶带边缘留出余量，以防止卷绕过程中胶水被挤出而污染胶带表面（图 2B）。</li>
		<li>使用等离子清洗机对胶带进行清洗并使其具有亲水性，操作步骤与前述相同，达到相同效果。 
		注：除金属涂层和碳溅射步骤外，两种策略的其余步骤均相同。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 连续超薄切片与基于胶带的收集
<ol>
	<li>使用小型研磨机或类似的切割工具，对带有样品的一侧树脂进行粗修，去除周围的空白树脂，以暴露样品区域。</li>
	<li>将包埋在树脂中的样品块放入样品 holder 中，并拧紧 holder 的旋钮，牢固固定样品块。</li>
	<li>将样品 holder 安装到切片机的可移动臂上。在刀片 holder 上安装玻璃刀或金刚石修块刀（角度为 45°）。在显微镜下将样品表面修整成金字塔形状，并使表面平整。 
	​注意：修整后的样品块前后边缘应尽可能平行（见 图 2C）。</li>
	<li>修整并平整样品块的四个侧面，去除边缘多余的树脂，防止与金刚石刀发生潜在碰撞。旋转旋钮，确保修整后样品块的前后边缘处于水平对齐位置。</li>
	<li>取下修块刀，更换为设定为 45° 角的金刚石刀。将切片机底座的倾斜角度设置为 6°。缓慢转动旋钮移动刀片 holder，直至金刚石刀的前缘距离样品表面 1–2 mm。</li>
	<li>观察样品表面与刀刃之间出现的亮带，调节倾斜角度，使亮带在上下和左右方向均保持均匀。这有助于确保第一张切片包含整个样品表面，而不仅仅是某个角落。</li>
	<li>将蒸馏水注入金刚石刀的槽中，使液面上升并确保刀刃湿润。然后使用注射器抽出部分水，使液面略微下降，直至反射呈现银白色光泽。</li>
	<li>在控制单元中设置切片厚度（进给量）、切割速度和切片区间。将切片速度调节为 0.6 mm/s，切片厚度设为 60 nm（具体速度和厚度取决于样品质量）。</li>
	<li>开始切片。当切片机运行稳定并产生均匀切片后，暂停切片过程。使用细毛刷清除已切下的切片和任何碎屑。</li>
	<li>在自动超薄切片收集系统上安装涂覆胶带卷和空的收带卷。锁紧固定装置，并进行试运行，确保胶带以恒定速度平稳移动并正确缠绕到空卷轴上。</li>
	<li>将胶带收集装置的收集头浸入金刚石刀的水浴中。调整收集头的位置，使其与刀刃平行，距离为样品切片长度的 1.5 倍，以确保切下的切片能平稳地被胶带收集。固定收集装置后，恢复切片操作，同时启动胶带收集装置。</li>
	<li>在收集到足够数量的连续切片后，暂停切片过程。在未收集切片的胶带区域剪断胶带，继续运行胶带收集装置，直到剩余胶带全部缠绕到卷轴上。</li>
	<li>取下含有收集切片的卷轴，放入电子干燥箱中。清洁胶带收集装置和切片机，并将所有配件归位。</li>
</ol>
<img alt="切片前准备；图示包括胶带夹心法；精密切割。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68814/68814fig2.jpg" data-altupdatedat="1773720005000" data-alt="图 2"> 
图 2：切片前的准备工作。（A）D-50 胶带表面在亲水处理前（上）和处理后（下）的水滴情况。（B）D-50 胶带连接区域的顶部和侧面示意图。蓝色：D-50 胶带；橙色：双面胶；绿色箭头：胶带移动方向。（C）修块后样品的正面视图，显示顶部和底部边缘相互平行。（D）自动胶带收集装置。a：D-50 胶带供带卷轴；b：胶带回收卷轴；红色箭头：胶带移动方向。（E）自动胶带收集装置上收集头的位置。右下角黄色框内显示的是即将被装置收集的新鲜切片。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68814/68814fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 在硅晶圆上固定样品
注意：确保工作区域清洁，以避免在后续步骤中灰尘污染胶带。
<ol>
	<li>使用经等离子体处理系统预清洗并亲水化处理的4英寸圆形硅片（功率80 W，时间3分钟）。</li>
	<li>戴上洁净手套，将硅片放置在平坦表面上，裁剪一段适当长度的双面导电碳胶带（两端各留出2-3 cm的余量）。撕去双面导电胶带一侧的白色保护层，自上而下将其贴附在硅片表面。 
	注意：双面导电胶带的两侧应相距约2 mm，胶带边缘需在硅片上清晰可见。对于宽度为25 mm的双面导电胶带，每片4英寸硅片可贴附三段胶带。</li>
	<li>在工作台上画出4英寸硅片的轮廓，并标记出将要贴附在硅片上的每段胶带的大致长度。根据先前标记的长度，裁剪已收集样品的胶带。 
	注意：裁剪后的胶带不应超出硅片边缘，且不得切割到样品区域。</li>
	<li>撕去双面导电胶带上的透明保护膜；若使用D-50胶带，此时还需移除胶带背面的保护膜。将胶带平行贴附于双面导电胶带之上。每段双面导电胶带上最多可贴附三段胶带。 
	注意：为降低D-50胶带错位或被灰尘污染的风险，可用先前撕下的透明保护膜覆盖部分导电胶带，仅暴露一小部分导电表面用于固定D-50胶带的一端。这有助于更方便地调整胶带方向。随后，缓慢揭去剩余的透明保护膜，使D-50胶带其余部分轻柔下落并贴附于导电胶带上。</li>
	<li>胶带安装完成后，胶带与导电胶带之间可能产生气泡，影响后续成像过程。将硅片放入真空腔室（或其他真空设备）中抽真空。真空处理完成后，确认气泡已完全消失。</li>
</ol>
4. 染色后处理
<ol>
	<li>配制4%醋酸铀和3%柠檬酸铅，并使用水浴锅预热至50°C。 
	注意：醋酸铀具有放射性，对肝脏和肾脏有显著毒性。柠檬酸铅可导致铅中毒，影响神经系统、肾脏和造血系统。操作这些试剂时应在通风橱中进行，并穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括实验服、腈类手套、口罩和护目镜。若发生皮肤或眼睛接触，应立即用大量清水冲洗，并向实验室安全人员报告，及时就医。</li>
	<li>将已抽真空且无气泡的硅片放入等离子亲水化系统中进行亲水化处理和清洁。</li>
	<li>使用去掉针头的10 mL注射器，连接0.22 µm注射式滤器，过滤4%醋酸铀溶液。将滤液滴加至切片表面，直至硅片上的切片完全被覆盖，静置3分钟。</li>
	<li>用蒸馏水洗涤3分钟，重复3次，然后用氮气吹干样品表面。</li>
	<li>使用去掉针头的10 mL注射器，连接0.22 µm注射式滤器，过滤3%柠檬酸铅溶液。将滤液滴加至切片表面，直至硅片上的切片完全被覆盖，静置5分钟。</li>
	<li>用蒸馏水洗涤3分钟，重复3次，然后用氮气吹干样品表面。</li>
</ol>
5. 数据采集
<ol>
	<li>光学显微镜 
	注意：本节以研究型切片扫描仪（VS200，Olympus）为例说明光学显微镜的使用。其他显微镜，例如Axio Imager.A2 Vario（Zeiss，德国），也适用于此处所述的光学成像。其他光学显微镜的操作步骤通常相同。
	<ol>
		<li>将硅片放置在光学显微镜的载物台上，并用无残留胶带固定。</li>
		<li>使用5倍物镜获取硅片、胶带及样品的概览图像。</li>
		<li>在概览图像上勾画出每个切片区域并进行排序，然后添加对焦点和曝光点，以便在整个硅片的所有切片区以20倍或50倍放大倍数进行自动成像。</li>
		<li>成像完成后，保存图像并检查图像质量。若存在失焦或质量不佳的图像，需重新对焦并再次成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电子显微镜 
	注意：多种类型的电子显微镜均可对放置在硅片上的超薄切片进行连续成像。此处以Multibeam 505（Zeiss）为例。
	<ol>
		<li>使用高真空溅射镀膜仪对样品表面进行碳镀膜，碳层厚度为5.7 nm。 
		注意：对于已在高反射策略中进行金属镀膜，或在低反射策略中涂覆碳纳米管（CNT）的胶带，此步骤可省略。</li>
		<li>使用光学显微镜（Axio Imager.A2 Vario，Zeiss）采集硅片的光学导航图。</li>
		<li>将硅片放入扫描电镜（SEM）的样品室。通过依次识别样品台上两个嵌套的L形标记，将光学导航图与电子显微镜图像关联起来。</li>
		<li>在显微镜软件（v3.2，64位）中使用SAT模块，半自动地从光学导航图中识别切片位置和成像区域。</li>
		<li>设置图像像素大小为4 nm，停留时间为0.8 µs，并设定对焦点与位置以及存储路径。</li>
		<li>开始连续成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 数据处理
注意：OMLIT 图像的二维拼接由软件自动完成。对于大规模的 OMLIT 图像三维配准与分割，可使用其他更强大的人工智能算法。此处为便于大多数实验室验证该流程，演示如何使用 Fiji（v1.54p，64 位）和 VAST（v1.5.0，64 位）进行拼接、配准和分割。
<ol>
	<li>在 Fiji 中通过将包含所有图像文件的文件夹拖入 Fiji 界面来打开图像数据集，提示时选择虚拟堆栈（Virtual Stack）。</li>
	<li>使用矩形工具（Rectangle Tool）选择感兴趣区域（ROI），然后通过图像 &gt; 裁剪（Crop）对数据集进行裁剪。</li>
	<li>使用注册虚拟堆栈切片（Register Virtual Stack Slices）插件对图像堆栈进行对齐（插件 &gt; 配准 &gt; 注册虚拟堆栈切片）。</li>
	<li>将对齐后的数据集以 TIFF 格式保存（文件 &gt; 另存为 &gt; TIFF）。</li>
	<li>使用导入 &gt; 从图像导入图像体积至 .VSV 文件功能将 TIFF 图像堆栈导入 VAST22。 
	注意：如需更详细的教程，请访问网站：https://lichtman.rc.fas.harvard.edu/vast/</li>
	<li>连接外部数位板后，在绘制片段模式（Draw Segment Mode）中使用画笔工具开始手动分割与追踪（使用快捷键A和Z在图像切片间快速切换）。</li>
	<li>使用窗口 &gt; 3D 查看器 &gt; 查看 &gt; 更新功能在三维中可视化已分割结构。</li>
	<li>通过文件 &gt; 保存分割结果保存分割结果。</li>
</ol>

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</ol>

未声明任何利益冲突。

本文中，我们开发了一种称为OMLIT的光学成像方法，该方法能够实现介观成像，并与基于胶带的连续扫描电子显微镜工作流程兼容。通过使用OMLIT方法，光学显微镜可从脑组织样本中捕获介观尺度的结构特征，包括血管、细胞体、细胞核、主要的树突分支以及部分较大的有髓轴突。此外，OMLIT可无缝整合到连续扫描电镜（SEM）流程中，在电子显微成像之前提供结构信息，并作为后续电镜采集时感兴趣区域定位的引导。我们展示了OMLIT成像过程的具体步骤，并在小鼠大脑皮层样本中验证了该方法的有效性。
OMLIT成像方案可分为高反射率和低反射率两种策略；这两种策略均需谨慎选择和处理胶带。在高反射率策略中，由于OMLIT成像效果主要由多层薄膜结构的干涉决定，聚酰亚胺或D-50胶带上的金属层若出现划痕或剥落，可能影响成像质量，并随机遮蔽感兴趣区域，导致数据丢失25。此外，在后续染色步骤中，我们发现铝容易与含铅离子的后染液发生反应20。对于低反射率成像策略，尽管聚酰亚胺胶带常用于连续电子显微镜成像，但我们通过OMLIT成像...

在细胞和亚细胞分辨率下对神经回路进行全面绘制，对于揭示大脑的结构与功能至关重要。传统的光学成像方法，如双光子显微镜1、荧光显微光学切片断层成像（fMOST）2,3,4以及VISoR系统5，已实现中尺度神经元成像和体内功能成像。然而，由于这些方法依赖稀疏标记，无法捕捉完整的细胞群体。另一方面，无标记光学成像技术，如功能光声显微成像（fPAM）6,7、光学相干断层成像（OCT）8和定量相位显微成像9，具备同时可视化视场内所有神经元的潜力。但这些方法通常受限于较低的轴向分辨率和较浅的成像深度，且其硬件复杂性阻碍了在脑图谱构建中的广泛应用。相比之下，连续切片电子显微镜（ssEM）技术，包括连续块面扫描电镜（SBF-SEM）10,11、聚焦离子束扫描电镜（FIB-SEM）12,13,14以及自动胶带收集超薄切片扫描电镜（ATUM-SEM）15,16,17，能够在纳米级分辨率下揭示密集的突触连接网络，为高分辨率连接组学提供了重要工具。然而，这些技术存在通量低、采集时间长、视场有限以及数据处理和硬件成本高的问题18。
为克服上述局限，我们开发了一种名为光学多层干涉断层成像（Optical Multilayer Interference Tomography, OMLIT）的成像方法。该方法以低成本、高通量的方式，实现对超薄切片上所有细胞的无差别、高对比度、宽视野成像，在大范围组织区域内达到亚微米级分辨率。同时，OMLIT 与连续切片扫描电镜（SEM）工作流程天然兼容：在进行高分辨率电子显微成像之前，OMLIT 可在同一组织切片上提供结构信息，从而实现精确的兴趣区域（ROI）导航，并显著减少后续电镜成像所需覆盖的面积与数据量。OMLIT 在介观尺度成像层面具有独特优势，是连接不同空间尺度神经结构图谱的关键桥梁。该方法具有非破坏性特点，保留了未来与特定标记策略（例如使用耐锇荧光蛋白19进行样品制备与成像）进一步整合的潜力。该技术可实现对选定脑区的介观尺度成像，快速获取这些区域内神经元的形态、数量、分布及密度信息，同时有助于对不同脑区间轴突投射与树突分布进行定量表征。对于成像结果中的特定兴趣区域，可进一步通过电子显微镜开展原位（in situ）超微结构分析。
OMLIT的成像原理已在郝凡的工作中有所描述20。简而言之，在成像过程中，超薄切片、涂层、收集带、导电带和晶圆共同构成一个多层薄膜结构。当平面波与该结构相互作用时，在各个界面处会产生反射波，并在探测空间中叠加，由于材料之间的反射率、折射率和吸收特性存在差异，从而导致光学干涉现象。基于该原理开发的MATLAB仿真程序与实验结果表现出良好的一致性。
根据胶带处理策略，OMLIT成像方案可分为两种类型。第一种为高反射率策略，即使用铬（Cr）、铜（Cu）、铝（Al）或银（Ag）等金属涂覆胶带表面，使细胞质区域和树脂填充的血管腔的光学强度高于周围区域。第二种为低反射率策略，采用未镀膜的Kapton胶带、D-50胶带或碳纳米管（CNT）涂层的PET胶带。在这种情况下，光学成像结果与前者相反：富含树脂且无膜的区域（如细胞质和血管腔）呈现较低的信号强度。
我们系统地总结并建立了针对两种不同成像策略的标准化操作流程。本文所呈现的方案提供了全面且详细的实验步骤。此外，还总结了实验过程中常见的问题，并提出了相应的解决方案。我们重点展示了一套采用低反射率策略获取的小鼠皮层数据集（805 × 857.5 × 11.66 µm³），以说明OMLIT成像方法的独特特征与优势。

<table><tbody><tr><td>胶带</td><td>3M</td><td>B5005094008</td><td>双面胶带</td></tr><tr><td>原子力显微镜</td><td>Bruker</td><td>Dimension Icon</td><td></td></tr><tr><td>自动超薄切片收集系统&amp;nbsp;</td><td>Lehua</td><td>AutoCUTS II</td><td></td></tr><tr><td>导电胶带</td><td>Ted Pella</td><td>FP16084-8</td><td></td></tr><tr><td>触针式表面轮廓仪</td><td>Bruker</td><td>DektakXT</td><td></td></tr><tr><td>切片用金刚石刀片</td><td>Diatome</td><td>DUJ3530</td><td>Diatome Jumbo 刀片</td></tr><tr><td>修块用金刚石刀片</td><td>Diatome</td><td>DTB90</td><td>玻璃刀片</td></tr><tr><td>电子显微镜</td><td>Zeiss</td><td>MultiSEM505</td><td>替代型号：GeminiSEM 300，Zeiss</td></tr><tr><td>FIJI（v1.54p，64位）&amp;nbsp;</td><td>开源软件</td><td>https://fiji.sc</td><td></td></tr><tr><td>修块用玻璃刀片</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸铅</td><td>Leica</td><td>T534/2</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td>VS200</td><td>替代型号：Axio Imager. A2 Vario，Zeiss</td></tr><tr><td>光学显微镜&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>&amp;nbsp;Axio Imager.A2 Vario</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗仪</td><td>Yidon Technologies</td><td>Hydro-S4</td><td>替代设备：Ted Pella Pelco 或其他台式等离子清洗仪</td></tr><tr><td>聚合物胶带</td><td>Melton</td><td>Kapton</td><td>该公司网站已无法访问。建议研究人员尝试本地可获取的 Kapton 胶带。</td></tr><tr><td>聚合物胶带</td><td>Teijin</td><td>PET</td><td>https://www.teijin.com/</td></tr><tr><td>聚合物胶带</td><td>Teijin</td><td>D-50</td><td>https://www.teijin.com/</td></tr><tr><td>硅晶圆</td><td>Saichi</td><td>912303</td><td>晶圆单面抛光。</td></tr><tr><td>溅射镀膜仪&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>ACE600</td><td>替代设备：双头溅射仪，Yujie</td></tr><tr><td>超薄切片机</td><td>Leica</td><td>UC7</td><td>替代型号：RMC PT-PC</td></tr><tr><td>醋酸铀</td><td>EMS</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>VAST（v1.5.0，64位）</td><td>霍华德·休斯医学研究所</td><td>https://software.dvid.io/vast/</td><td>VAST A1:D32Lite 是一款用于对大型三维显微图像数据集进行手动标注和分割的免费工具。</td></tr><tr><td>ZEN 软件（v3.2，64位）</td><td>Zeiss</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/zh/products/software/zeiss-zen.html</td><td></td></tr></tbody></table>

一种与扫描电子显微镜兼容的光学成像方法用于介观全细胞脑图谱绘制

A Scanning Electron Microscopy-Compatible Optical Imaging Method for Mesoscopic All-Cell Brain Mapping

理解大脑中复杂神经网络的结构与功能关系，需要构建兼具大视野和亚细胞分辨率的脑图谱。然而，现有的光学显微镜和电子显微镜成像方法均存在局限性，难以对单个样本中的所有细胞进行完整成像。本实验方案介绍了一种名为光学多层干涉断层成像（Optical Multilayer Interference Tomography, OMLIT）的成像技术，该技术能够在完成电子显微镜样本制备后的脑组织样本中，实现对所有细胞的无差别光学成像，从而重建包含全部神经细胞的完整脑图谱。此外，OMLIT成像可与自动胶带收集超薄切片扫描电子显微镜（automated tape-collecting ultramicrotomy scanning electron microscopy, ATUM-SEM）的成像工作流程无缝整合。这使得研究人员能够在电子显微镜成像前获取细胞的介观尺度结构信息，有助于精确选择感兴趣区域，并显著减少高分辨率电子显微镜（EM）成像所需覆盖的面积和数据量。我们在成年小鼠大脑皮层的实际样本中验证了该方法的准确性与兼容性，展示了其在多尺度脑图谱构建中的广泛应用前景。

本实验方案的整体工作流程（图1）始于不同类型收集胶带的制备。图1展示了方案中提到的三种胶带（从左至右：Kapton胶带、D-50胶带和CNT涂层PET胶带），当它们置于相同的背景基底上时，表现出不同的光学特性。在样品制备和块面修整后，应首先收集若干切片用于电子显微镜成像，以确认制备结果符合预期。通过使用自动胶带收集系统，可将数千个切片收集并粘附至金属涂层或未涂层胶带上。随后，这些胶带以特定的方式和顺序排列在4英寸硅片上，形成切片阵列（图1B、C）。经过后续染色后，样品可用于光学显微镜成像。接着，对未涂层胶带增加碳溅射步骤，即可在同一组样品上进行多束电子显微镜成像（图1D–F）。图1F中的内容对应于图1...

我们介绍了一种名为光学多层干涉断层成像（Optical Multilayer Interference Tomography, OMLIT）的新型成像技术，该技术能够在介观尺度上对脑组织样本中的所有细胞进行无偏成像，并可无缝整合到同一标本基于胶带的连续扫描电子显微镜成像工作流程中。

理解大脑中复杂神经网络内部的结构与功能关系，需要构建脑图谱，以……

我们的研究聚焦于连接组学。我们开发了高通量的光学或电子图像采集方法，以实现对神经回路及其突触连接特征的分析，从而破译神经回路的基本连接逻辑。传统的高分辨率连接组学由于数据采集成本高昂且精度要求高，仅限于小体积脑组织；而快速显微分析和靶向显微研究则为全脑连接组学提供了可能。与其他显微技术（如各种Larsens显微镜）相比，OMLIT能够捕获所有神经元的图像，并包含树突和轴突的精细结构信息。除了与电子显微镜兼容外，OMLIT在EF下还可实现进一步的纳米级分辨率成像。OMLIT有助于构建全面的大脑模型，结合连续切片技术，可同时绘制所有长程投射的路径，包括其方向、强度和类型，以及局部微环路。该技术为全脑范围内的结构架构和信息流动提供了深入见解。我们正在开发由OMLIT定义的参考区域（RIs）引导的自动化OMLIT成像与电镜数据采集技术，以实现对大范围或全脑体积的高效连接组学数据采集与分析。首先，选择厚度为50微米的卡普顿膜（capton）或D50膜，并将其安装至电动卷绕系统上。使用双枪磁控溅射系统，在胶带表面沉积一层均匀的铬或其他金属（如铝、银或铜）超薄薄膜。将胶带置于距离溅射靶80毫米的位置。在直流电源和由99.99%氩气调节至1帕斯卡的压力条件下进行该过程。现在，将胶带的卷绕速度设置为0.6毫米每秒，以获得50纳米的金属涂层厚度。沉积完成后，待系统冷却至室温，取出胶带。使用探针台阶仪、原子力显微镜或扫描电子显微镜评估涂层的厚度和均匀性。对于低反射率策略，使用等离子清洗机在80瓦功率下以每秒七毫米的速度移动胶带，对其进行清洁并使其具有亲水性。处理后，将水滴置于胶带表面，确认水滴迅速铺展成一层薄膜。使用小型研磨机或类似的切割工具，对样品侧的树脂进行粗略修整，去除周围的空白树脂，暴露出样品区域。将包埋树脂的样品块放入样品 holder 中，并拧紧以牢固固定样品块。将样品台安装到切片机的可移动臂上。在刀架上以45度角安装玻璃刀或金刚石修块刀。在显微镜下，将样品表面修切成金字塔形状并进行修平，然后修切并平整样品块的四个侧面，以去除多余的树脂。旋转旋钮，使块状样品的前缘和后缘处于水平位置。取下修块刀，换上以45度角放置的金刚石刀。将切片机底座的倾斜角度设为6度，然后使用旋钮缓慢移动刀架，直至刀具前缘距离样品表面1至2毫米。观察样品表面与刀刃之间出现的亮带，并调节倾斜角度，使亮带在上下和左右方向均保持均匀。现在，将蒸馏水注入金刚石刀的槽中以润湿刀刃。用注射器吸除部分水，直至液面下降并出现银色反光。接下来，在控制单元中设置切片厚度、切割速度和切片窗口。根据样本质量，将切片速度调整为0.6毫米每秒，切片厚度调整为60纳米。使用超薄切片机开始切片。当产生稳定且均匀的切片后，暂停操作。然后使用细刷清除已切下的切片和碎片。现在，将涂有粘附层的胶带卷和空的收卷轴安装到自动超薄切片收集系统上。固定锁定装置，并进行试运行，以确认胶带以恒定速度平稳移动，并能正确收卷到收卷轴上。将胶带收集装置的收集头浸入金刚石刀的水浴中，并调整收集头使其与刀刃平行，间距为样品切片长度的1.5倍。固定收集装置后继续切片，同时运行胶带收集装置。收集到足够数量的连续切片后，暂停切片。在无切片的区域切断胶带。运行胶带收集装置，直至所有胶带完全缠绕到卷轴上。接下来，取下线轴并将其放入电子干燥箱中。清洁胶带收集装置和切片机，并将所有附件归位。若需在硅片上进行固定，需从双面导电胶带上剥离透明保护膜。将胶带平行于双面导电胶带贴附，每片上可放置最多三段胶带。将硅片置于光学显微镜的载物台上，并用无残留胶带固定。使用5倍物镜获取硅片、胶带及样品的概览图像。在概览图像上勾画出每个区域并进行排序，然后添加焦点和曝光点，以在整片晶圆上以 20 或 50 倍放大倍数进行自动成像。成像完成后，保存图像并检查其质量，若发现图像失焦或质量不佳，需重新对焦并再次成像。通过选择“导入”，然后选择“从图像导入图像体积至 VSV 文件”，将 TIFF 图像序列导入 VAST 22。连接外部平板设备，使用画笔工具和绘制分割模式，手动分割并追踪结构。使用快捷键 A 和 Z 在图像切片之间导航。接下来，选择窗口，然后选择 3D 查看器、查看并更新，以三维形式可视化已分割的结构。最后，在选择文件并保存分割结果后完成保存操作。在高反射率图像中，细胞质和血管腔区域的强度高于周围区域；而在低反射率图像中，细胞质和血管腔区域的强度则较低。定量结果显示了高反射率与低反射率策略的效果。在对比度和信息熵方面，每种方法均有其优势。OMLIT光学显微成像技术可识别轴突、血管、细胞体和树突。使用VAST对omelet图像进行手动分割，显示出大量紧密排列的细胞体、树突和轴突。将分割结果与原始图像结合，生成三维可视化图像。放大的OMLIT图像显示分辨率不足，无法揭示更精细的结构。同一区域的电子显微镜图像则揭示了突触、线粒体、细胞核和囊泡。

a-scanning-electron-microscopy-compatible-optical-imaging-method-for

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

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来源： Mukherjee, K., et. al. 利用连续块面扫描电子显微镜分析脑线粒体。 J. Vis. Exp.

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