通过免疫印迹优化非洲 爪蟾 卵母细胞和胚胎中的蛋白质分析

在动物的一生中，硫酸盐的决定不断发生，从而促进成年有机体的正常发育和健康。这些决定取决于指硫酸盐调节剂的特定蛋白质。我们研究的目标是找到控制这些关键调节因子合成的机制。

除了提供免疫印迹和非洲爪蟾卵母细胞和胚胎的详细概述外，我们的方案还深入了解了该模式生物常见的挑战，例如抗体采购。通过深入研究双尾 C 的结合和抑制机制，我们的研究有助于建立比较其他转化调节剂的信息基础。要开始处理细胞进行免疫印迹，请在每个胚胎或卵母细胞中加入 10 微升冷冻细胞裂解缓冲液，用双去离子水稀释至一倍浓度。

使用微杵，在冰上均质样品。将试管放入台式离心机中，在4摄氏度下以5， 000g旋转样品10分钟，以沉淀碎屑，包括蛋黄和不溶性色素。将上清液转移到干净的 1.5 毫升管中，确保沉淀在转移过程中不会受到干扰。

向收集的上清液中加入等体积的两倍Laemmli样品缓冲液，并补充有5%体积重量的2-巯基乙醇。将混合物在 95 至 100 摄氏度下加热 10 分钟，使蛋白质变性。现在，从包装中取出 4% 至 12% 的 bis-tris SDS 预制凝胶，并撕下凝胶底部的贴纸。

将凝胶插入缓冲坝对面的电极组件中，并将整个组件放入垂直电泳槽中。然后，用Tris-MOPS-SDS运行缓冲液填充电极组件和罐底。轻轻地将凝胶梳和移液器运行缓冲液取出到孔中，以消除气泡并平衡缓冲液。

现在，将 5 微升预染色的蛋白质标准品加载到第一个孔中，将每个制备的样品 10 微升加载到剩余孔中。将盖子放在电泳槽上并将其连接到电源。然后，将电压设置为 200 伏以启动电泳。

一旦样品缓冲液染料正面离开凝胶，就停止电泳。在电泳完成之前，开始在转印夹中组装转印夹层。在玻璃烤盘中装满冷冻转印缓冲液，并在组装过程中将所有转印材料浸入该缓冲液中。

将转印夹放入盘中，黑色的一半靠在底部，白色的一半朝上，夹子向左打开。将一两块纤维海绵平放在转印夹的黑色一半上。将两张 0.35 毫米纤维素色谱纸切割成一定尺寸后，将一张放在海绵上。

电泳完成后，从电泳槽中取出凝胶。使用凝胶盒打开杆，小心地撬开凝胶板，同时确保凝胶保持附着在一侧。使用凝胶释放剂从凝胶顶部修剪孔。

将仍附着在塑料盒的一半上的凝胶放在滤纸上，然后取出剩余的半盒，使凝胶保持平放在纸上。接下来，切割一块 0.45 微米的硝酸纤维素膜以匹配凝胶的尺寸。从保护纸上取下膜，在转印缓冲液中短暂润湿，然后小心地将其放在凝胶顶部。

然后，在硝酸纤维素膜上铺上第二张滤纸。使用滚筒轻轻但牢固地压出所有气泡。在滤纸顶部堆叠一两个额外的纤维海绵以完成三明治。

关闭转印盒并将其夹紧以密封组装好的三明治。然后，将封闭的转印夹层插入转印芯中，夹子朝上，并确保夹子的黑色面朝向芯的黑色面。将转印芯放入电泳槽中。

在水箱中加入冰袋和搅拌棒，确保搅拌棒可以自由旋转。用冷冻的转移缓冲液填充罐，直到设备完全浸没，然后将盖子固定在顶部。将设备连接到电源，匹配电极颜色，并将条件设置为 100 伏，搅拌棒旋转一小时。

转移完成后，小心地打开盒并拆卸三明治。取下硝酸纤维素膜并标记与凝胶接触的一侧。然后，将硝化纤维素膜放入一个小容器中，使其平放在底部。

用丽春红染色剂完全覆盖膜，然后在摇杆上轻轻摇晃 5 到 10 分钟。倒入丽春红染色剂后，用双去离子水冲洗膜数次，直到去除多余的染色剂并且蛋白质条带在泳道中可见。然后，如图所示执行膜封闭、抗体孵育和洗涤步骤。

二抗孵育和洗涤完成后，膜就可以进行成像了。在黑暗的房间里，打开胶片显影剂并让它预热。剪下两块足够大的保鲜膜，以完全覆盖膜。

使用镊子，将硝酸纤维素膜面朝上放在第一个正方形的保鲜膜上。在 1.5 毫升试管中，混合等体积的增强型化学发光鲁米诺和增强剂试剂。然后，使用大约一毫升的混合物覆盖大多数膜。

使用保鲜膜轻轻纵膜，确保整个表面均匀涂覆并孵育一分钟。然后，用镊子抓住膜并轻轻抖掉液体，去除多余的ECL试剂。将膜面朝上放在第二个正方形的保鲜膜上，将其松散地折叠在膜上，然后将膜牢固地粘在放射自显影盒中。

接下来，按照所示步骤在暗室中使用放射自显影胶片对膜进行成像。实现所需的蛋白质可视化后，将显影膜与夜光标记对齐，并将它们用作指南，将预染色的蛋白质标准品标记在膜上的位置。成像完成后，小心地从保鲜膜上取下膜并将其浸入 TBSTW 中以洗掉残留的 ECL 试剂。

膜的丽春红染色证实了成功的蛋白质转移。在卵母细胞样本中未检测到内源性 B1 蛋白，但在第 7 期和第 10.5 期胚胎样本中以约 107 千道尔顿的浓度清晰检测到。使用 Bicc1 抗体在所有阶段的注射样品中检测到较小的 70 k0 千道尔顿蛋白条带，表明 HA-Bicc1 C 端融合成功表达。

HA 抗体仅在注射样品中检测到相同的 70 千道尔顿条带，证实了 Bicc1 抗体对融合蛋白的特异性。使用 CNOT1 抗体在所有样品中检测到两个高分子量条带，分别约为 250 和 270 千道尔顿。在所有样本中都检测到 54 千道尔顿 DDX6 蛋白的表达，但在 10.5 期胚胎中明显降低。