免疫印迹分析

免疫印迹（通常称为Western blotting）用于在蛋白质样品中鉴定多克隆或单克隆抗体所识别的特定抗原。该实验通常在一维或二维凝胶电泳之后进行，包括将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。随后将膜与一抗和二抗孵育，二抗可直接或间接连接酶，再通过显色或荧光底物反应在膜上显示蛋白质抗原。

在本视频中，我们将逐步演示免疫印迹实验流程。大家好，我是来自UVPI与KE研究生院蛋白质组学中心合作项目的Sean Gallagher。今天我将向大家展示免疫印迹分析的操作方法。

该过程包括多个步骤，如蛋白质分离、将蛋白质转印至膜上、免疫检测以及使用显色和化学发光底物进行显影。现在让我们开始。在进行免疫印迹实验之前，必须首先通过电泳，利用小型或标准尺寸的一维或二维凝胶对蛋白质样品进行分离。

制备抗原样品，并将其加入凝胶的加样孔中，同时在凝胶的一个或多个泳道中加入预染或生物素标记的蛋白质分子量标准品。这些蛋白质标记物将随电泳转移至膜上，在免疫染色后可方便地指示膜的方向以及蛋白质的大小。电泳完成后，即可开始组装免疫印迹装置。

组装免疫印迹转膜装置时，首先拆开凝胶夹心结构并切去浓缩胶，将凝胶在室温下用转移缓冲液平衡30分钟。此平衡步骤是必需的，以防止转膜过程中凝胶尺寸发生变化。在凝胶平衡的同时，开始在足够大的托盘中组装转膜夹心结构，托盘内需加入转移缓冲液，确保能够完全覆盖塑料转膜盒。然后将一块 Scotch-Brite 垫或海绵放置在塑料转膜盒的底半部分。

然后取一张与凝胶大小相同的滤纸，用转移缓冲液预湿后，放置在 Scotch Bright 垫上。当凝胶完成30分钟的平衡步骤后，将凝胶置于滤纸上。

轻轻滚动试管或玻璃棒，以去除凝胶与滤纸之间的任何气泡。您也可以使用 BioRad 试剂盒附带的 BioRad 滚轮。操作滤纸、凝胶和膜时，请记得佩戴手套。

手上的油脂会阻碍转印。接下来，准备转印膜。将膜裁剪至与凝胶每边多出一到两毫米的相同尺寸。

然后将膜以45度角缓慢放入蒸馏水中，水会通过毛细作用逐渐上升进入膜内，最终润湿整个膜表面。如果将膜过快地插入水中，会导致空气被困在膜中，从而在膜上形成白色斑块。蛋白质将无法转移到这些区域。

膜完全润湿后，用转移缓冲液平衡10至15分钟。此润湿步骤适用于硝酸纤维素膜和尼龙膜。只有聚偏氟乙烯（PVDF）膜具有疏水性，仅将其放入蒸馏水或转移缓冲液中无法润湿。

PVDF 膜必须先浸入 100% 甲醇中 1 到 2 秒，然后在转移缓冲液中平衡 10 到 15 分钟。切勿让膜在任何时刻干燥。

如果发生这种情况，需再次用甲醇润湿，然后用转移缓冲液润湿。一旦膜准备就绪，立即将预先润湿的膜直接放置在凝胶的上表面。请记住，用移液管、玻璃棒或 BioRad 滚轮轻轻滚过膜表面，以彻底去除凝胶与膜之间的所有气泡。

接着用另一张沃特曼3毫米滤纸润湿，然后将其放在膜上，并再次去除所有气泡。然后在此滤纸上放置另一块苏打亮垫或海绵。

通过将转印夹心装置的上半部分锁定到位，完成免疫印迹夹心结构的组装。现在免疫印迹夹心结构已组装完毕，我们准备将蛋白质从凝胶转移至膜上。开始转印程序时，先用电泳转印缓冲液充满电泳转印槽，然后将含有夹心结构的转印夹具放入电泳转印装置中。

组装转印三明治时，需确保膜朝向电泳槽的阳极或正电极一侧，这一点非常重要。将电源的导线连接到电转印装置对应的阳极和阴极两侧。这种特定型号的转印仪配有冷却用的冰块。

现在，将凝胶中的蛋白质通过电泳转移至膜上，50伏特下转移30至60分钟并伴随冷却，或在4°C冷室中14伏特过夜转移。转移完成后，关闭电源并拆卸装置。随后从转印装置中取出膜，并通过裁切一角标记膜的方向。

此时，膜可以干燥并存放在可密封的塑料袋中，在 4°C 下可保存一年。在进一步处理之前，必须将干燥的 PVDF 膜放入少量 100% 甲醇中以润湿膜，然后置于蒸馏水中以去除甲醇。

标记好方向后，对凝胶进行染色以验证转膜效率。为了观察已转移的蛋白质，可使用环丙红对膜进行可逆染色，或使用卡马西蓝印度墨水、萘酚蓝或胶体金进行不可逆染色。这些不可逆染色步骤与尼龙膜不兼容。

蛋白质已转移至膜上后，即可进行免疫检测及蛋白质的可视化检测。在此步骤中，利用特异性抗体对膜上固定的蛋白质进行孵育，以鉴定并定量其中存在的任何抗原。首先，将膜放入含有20毫升封闭缓冲液的塑料孵育盒中。

有些人使用袋子，但通常更倾向于使用托盘，因为它们在处理大量处于不同一抗溶液中的条带时尤为方便。接下来，将密封的膜在室温下于摇床或摇动平台上振荡孵育30至60分钟。在膜孵育的同时，稀释一抗和封闭缓冲液。

稀释倍数需通过实验确定，通常为1:100至1:1000。对于多克隆抗体，杂交瘤上清液的稀释比例为1:10至1:100，而含有单克隆抗体的小鼠腹水液稀释比例应大于1:1000。孵育完成后，倒出封闭缓冲液。

用稀释的一抗缓冲液替换原有缓冲液，室温下持续振荡孵育30至60分钟。接着，使用100毫升TTBS缓冲液洗涤硝酸纤维素膜或PVDF膜四次，或使用TBS缓冲液洗涤尼龙膜四次，每次均需振荡洗涤。

每次洗涤膜时，洗涤时间为10至15分钟，同时在封闭缓冲液中稀释二抗。二抗的例子包括辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗Ig抗体结合物，以及市售的酶标记结合物。二抗通常在使用前按1:200至1:25,000的比例进行稀释。

完成洗涤步骤并弃去洗涤液后，加入稀释的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗 Ig 抗体结合物，在室温下持续振荡孵育 30 至 60 分钟。30 至 60 分钟后，将膜从容器中取出，用 TTBS 缓冲液洗涤四次，每次 10 至 15 分钟，具体方法如前所述。

洗涤步骤完成后，我们即可进行可视化步骤。但首先，我们将演示一种替代的免疫探针检测方法。这种替代的免疫探针检测方法基于 Vector Labs 公司的 ABC 试剂盒。

利用亲和素-生物素复合物将辣根过氧化物酶（HRPO）或碱性磷酸酶（AAP）连接至生物素标记的二抗。今天我们将演示HRPO试剂盒的使用。TTBS缓冲液非常适合作为亲和素-生物素系统的封闭缓冲液。

但对于尼龙膜，建议使用蛋白质结合试剂，因为脱脂奶粉中含有残留的生物素，会干扰免疫测定。在封闭步骤中必须仅使用该试剂，首先将膜置于开放托盘中的封闭缓冲液内，在轨道摇床或摇动平台上持续振荡以开始平衡膜。在室温下孵育膜 30 至 60 分钟，同时完成膜的平衡。

配制一抗溶液。对于高灵敏度的硝酸纤维素膜或PVDF膜，使用TTBS缓冲液。

含有初级抗体的封闭剂的稀释比例通常在1:1000至1:100,000之间。使用化学发光法时需要更高的稀释倍数。在本例中，采用的是显色法。

我们使用一抗的稀释比例为1:5,000。平衡完成后，移除封闭缓冲液，然后加入足量的一抗溶液以覆盖膜。

30 分钟后，在室温下轻轻摇动孵育膜 30 分钟。用 TTBS 缓冲液将硝酸纤维素膜清洗三次，每次间隔五分钟。在洗涤过程中，通过将一滴生物素化二抗加入 10 毫升 TTBS 缓冲液中稀释，制备生物素化二抗溶液。完成洗涤步骤后，加入二抗溶液。

将膜在室温下缓慢振荡孵育30分钟，同时用二抗孵育膜。为此需制备avidon生物素HRPO。取两滴vti染色试剂A和两滴试剂B加入10毫升溶液中混合均匀。

用于硝酸纤维素膜的 TTBS。当二抗孵育完成后，在室温下孵育 30 分钟。用 TTBS 或 TBS 洗涤膜三次，总时长 15 分钟。

接下来，将链霉亲和素-生物素酶溶液加入膜上，在室温下缓慢振荡孵育30分钟。然后用TTBS缓冲液每隔10分钟洗涤膜三次。至此，免疫检测步骤已完成，膜上结合的蛋白质已可使用显色底物进行显影观察。

在最后的显色步骤中，通常使用四氯萘酚（CN）、DAB/ICL2 和 TMB 作为底物，与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的免疫检测方法配合使用。如果在免疫探针步骤的最后膜洗涤是用 TTBS 进行的，则需再用 50 毫升 TBS 在室温下洗涤膜 15 分钟，然后将膜放入显色检测溶液中。

蛋白质条带应在10至30分钟内出现。孵育30分钟后，弃去底物反应液，并加入蒸馏水终止反应。免疫印迹是一种多步骤实验技术，被数千个实验室用于在进行一维或二维电泳后检测特定蛋白质的存在。

我刚刚向您演示了如何进行免疫血液分析。以上就是全部内容。祝您的实验顺利，感谢观看。