免疫印迹分析

免疫印迹，通常称为 Western blotting，用于鉴定蛋白质样品中多克隆或单克隆抗体识别的特异性抗原。该程序通常在 1D 或 2D 凝胶电泳之后进行，涉及将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。将这些膜与直接或间接偶联酶的一抗和二抗一起孵育，并使用有色或荧光底物反应在这些膜上可视化蛋白质抗原。

在本视频中，我们提供了免疫印迹程序的分步演示。嗨，我是来自 UVPI 的 Sean Gallagher，与 KE 研究生院的蛋白质组学中心合作。今天，我将向您展示免疫印迹分析。

它涉及许多步骤，包括蛋白质分离、蛋白质印迹到膜上、免疫探测以及使用显色和 kim 发光底物进行可视化。那么让我们开始吧。在开始免疫印迹程序之前，必须首先使用小尺寸或标准尺寸的一维或二维凝胶通过电泳分离蛋白质样品。

制备抗原样品并将其加载到凝胶上的泳道中，在一个或多个凝胶泳道中加入预染或生物素化蛋白质、分子量标准品。这些蛋白质标志物将转移到膜上，并方便地指示免疫染色后蛋白质的膜方向和大小。电泳完成后，我们就可以组装免疫印迹了。

组装免疫印迹 首先，拆卸凝胶夹心并去除堆积凝胶 平衡凝胶 30 分钟 在室温下，在转印缓冲液中，需要这种平衡，以防止在转印过程中凝胶大小发生变化，而凝胶处于平衡状态。开始将转印三明治组装在一个足够大的托盘中，以容纳塑料转印盒和转印缓冲液，以便覆盖转印盒。现在将苏格兰光亮垫或海绵放在塑料转印盒的下半部分。

然后取一张已切割成与凝胶相同大小的滤纸。用转移缓冲液预润湿，然后将其放在 scotch bright pad 的顶部。凝胶平衡 30 分钟后，将凝胶放在滤纸上。

通过在凝胶表面轻轻滚动试管或玻璃棒，去除凝胶和滤纸之间的气泡。或者，您可以使用 BioRad 套件随附的 BioRad 滚轮。作滤纸、凝胶和膜时，请记住戴上手套。

手上的油会阻碍转移。接下来，准备转移膜。将膜切成与凝胶相同的大小，每个边缘加 1 到 2 毫米。

然后将膜慢慢放入蒸馏水中，一个边缘呈 45 度角，水会渗入膜中，最终弄湿整个表面。如果将其快速插入水中，空气会被困住，并在膜上出现白色斑点。蛋白质不会转移到这些区域。

膜完全湿润后，平衡 10 至 15 分钟，然后转移缓冲液。这种润湿程序适用于硝酸纤维素膜和尼龙膜。只有 PVDF 膜是疏水性的，不会因放入蒸馏水或转移而变湿。缓冲区。

PVDF 膜必须首先在 100% 甲醇中浸泡 1 到 2 秒，然后平衡 10 到 15 分钟。在转移缓冲液中。任何时候都不要让膜变干。

如果发生这种情况，请再次用甲醇润湿，然后用转印缓冲液。膜准备好后，将预润湿的膜直接放在凝胶的顶部。请记住，通过在膜表面轻轻滚动试管玻璃棒或 BioRad 滚轮来去除凝胶和膜之间的所有气泡。

接下来湿，再用一张 watman 3 mm 滤纸。然后将其放在膜顶部，再次去除所有气泡。然后将另一个苏格兰亮色垫或海绵放在这张滤纸上。

通过将转印盒的上半部分锁定到位，完成免疫印迹夹心的组装。现在免疫印迹夹心已经组装好了，我们准备好将蛋白质从凝胶转移到膜上了。要开始转移程序，请用转移缓冲液填充电印迹槽，并将包含三明治的转移盒放入电印迹仪中。

对于三明治很重要，这样膜就面向阳极或水箱带正电的一侧。将电源的引线连接到电印迹仪的相应阳极和阴极侧。这种特殊的标准吸墨仪带有一个冷却冰块。

现在，电泳将蛋白质从凝胶转移到膜上，在 50 伏特下冷却 30 到 60 分钟，或在冷藏室中以 14 伏特过夜。转移完成后，关闭电源并拆卸设备。然后从印迹装置中取出膜，并通过切一个角来记下方向。

此时，膜可以干燥并存放在 4 摄氏度的可重复密封塑料袋中一年。在进一步加工之前，必须将干燥的 PVDF 膜放入少量 100% 甲醇中以润湿膜。然后在蒸馏水中除去甲醇。

标记方向后，对凝胶进行染色以验证转印效率。为了可视化转移的蛋白质，您可以用 cipro 红宝石可逆地对膜进行染色，或者用 kamasi 蓝印度墨水、萘酚蓝或胶体金不可逆地染色。这些不可逆的染色程序与尼龙膜不相容。

现在蛋白质已转移到膜上，请继续对蛋白质进行免疫探测和目视检测。在此步骤中，用特异性抗体探测膜上固定的蛋白质，以鉴定和定量存在的任何抗原。首先，将膜放入装有 20 毫升封闭缓冲液的塑料孵育盘中。

有些人使用袋子，但通常使用托盘，因为它们在处理不同一抗溶液中的大量试纸条时特别有用。接下来，在室温下在轨道摇床或摇床上搅拌孵育密封膜 30 至 60 分钟。在膜孵育时，稀释一抗和封闭缓冲液。

稀释度是根据经验确定的，但通常为 1 比 100 比 1 1000。对于多克隆抗体，杂交上清液为 1 比 10：100，对于含有单克隆抗体的鼠酸液，该值大于 1：1000。孵育完成后，倒出封闭缓冲液。

用稀释的一抗替换缓冲液，再次在室温下孵育 30 至 60 分钟，并持续搅拌。接下来，用 100 毫升搅拌，将膜清洗四次。TTBS 用于硝酸纤维素或 PVDF 过滤器，TBS 用于尼龙过滤器。

每次洗涤 10 至 15 分钟，同时洗涤膜，在封闭缓冲液中稀释二抗。二抗的实例包括辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶、抗 IG 偶联物、市售酶偶联物。二抗通常在使用前稀释 1 至 200 至 1 至 25， 000。

洗涤步骤完成并丢弃洗涤材料后，加入稀释的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶、抗 IG 偶联物，并在室温下持续搅拌孵育 30 至 60 分钟。30 至 60 分钟后，从垃圾箱中取出膜并洗涤 4 次，每次 10 至 15 分钟。如前所述，在 TTBS 中。

洗涤完成后，我们就可以继续进行可视化步骤了。但首先，我们将演示另一种免疫探测程序。这种替代免疫探测程序基于 Vector Labs 的载体染色 A BC 试剂盒。

它使用 avidan 生物素复合物将辣根过氧化物酶或 HRPO 或碱性磷酸酶 A A P 连接到生物素化二抗上。今天我们将演示 HRPO 套件。TTBS 非常适合用作 avadon 生物素系统的封闭缓冲液。

但对于尼龙过滤器，建议使用蛋白质结合试剂，因为脱脂奶粉中含有残留的生物素，会干扰免疫测定。它必须在封闭步骤中使用，仅用于开始平衡封闭缓冲液中的封闭缓冲液，并使用轨道摇床或摇动平台不断搅拌。在室温下孵育膜 30 至 60 分钟，同时膜保持平衡。

制备一抗溶液。将 TTBS 用于具有高灵敏度 Adin 的硝酸纤维素或 PVDF 膜。生物素系统。

含有 cera 的一抗的稀释度通常在 1000 分到 100， 000 分之间。使用化学发光化学需要更高的稀释范围。在我们的例子中，证明显色。

我们使用的是 1/5， 000 的原色稀释液。e 平衡完成后，去除封闭缓冲液。然后加入足够的一抗溶液以覆盖膜。

在室温下孵育膜 30 分钟，30 分钟后轻轻摇动。在 TTBS 中以硝酸纤维素膜的间隔 5 分钟洗涤膜 3 次在洗涤步骤中，用 10 毫升 TTBS 稀释一滴生物素化抗体，制备生物素化二抗溶液。洗涤步骤完成后，添加二抗溶液。

在室温下缓慢摇动膜 30 分钟，同时将膜与二抗一起孵育。准备 avadon 生物素 HRPO 来执行此作。将两滴 vti 染色试剂 A 和两滴试剂 B 混合到 10 毫升中。

用于硝酸纤维素的 TTBS。二抗孵育完成后，在室温下孵育 30 分钟。用 TTBS 或 TBS 在 15 分钟内洗涤膜 3 次。

接下来，将 avidan 生物素酶溶液添加到膜中，并在室温下缓慢摇动孵育 30 分钟。然后用 TTBS 以 10 分钟的间隔洗涤膜 3 次。现在免疫探测程序已经完成，膜结合的蛋白质已准备好用显色底物进行可视化。

对于最后的可视化步骤，底物 4 CN dab 斜杠 ICL 2 和 TMB 通常用于辣根、基于过氧化物酶的免疫检测程序。如果免疫探针程序中的最后一次膜洗涤是在 TTBS 中进行的，则在室温下以 50 毫升洗涤膜 15 分钟。TBS 现在将膜放入显色可视化溶液中。

蛋白质条带应在 10 到 30 分钟内出现。孵育 30 分钟后，弃去底物反应混合物，加入蒸馏水终止反应。免疫印迹是一种多步骤程序，被数千个实验室用于在一维或 2 维电泳后检测特定蛋白质的存在。

我刚刚向您展示了如何进行免疫血液分析。就是这样。祝您的实验好运，感谢您的观看。