定向细胞自组装构建细胞来源组织环用于生物力学分析与组织工程

本实验的总体目标是利用聚集的细胞及其分泌的细胞外基质构建三维组织结构，用于功能分析。首先通过铣削聚碳酸酯模具制备具有圆底环形孔的模具，然后将聚二甲基硅氧烷（PDMS）浇铸到聚碳酸酯模具上，以形成模板。

然后利用PDMS模板制备aROS微孔。最后一步是将细胞接种到aROS微孔中，使其发生聚集并形成具有凝聚力的组织环。最终，该方法可用于实现不同细胞类型的细胞自组装和组织工程，并能够分析细胞及其分泌的细胞外基质对组织结构与功能的贡献。

与其它组织工程方法相比，该技术的主要优势在于，我们能够比以往报道的更快地完全由细胞及其产生的细胞外基质生成组织构建物，并且其形式适合进行力学分析。首先，将一块厚度为半英寸的聚碳酸酯材料进行铣削，加工出15个圆底环形孔，每个孔的中心柱直径为2毫米。用清洁剂清洗聚碳酸酯模具，去除铣削过程中产生的任何塑料碎屑，并让模具自然晾干。接下来，按10:1的比例混合PDMS基础剂与固化剂，对混合溶液进行脱气处理以去除所有气泡，然后将其倒入聚碳酸酯模具中。

然后再次将混合物置于模具上脱气，以去除残留的气泡，并将PDMS在60摄氏度的烘箱中固化4小时。在PDMS固化的同时，将2% AROS溶解于DMEM中。固化完成后，小心地从聚碳酸酯膜上缓慢剥离PDMS模板，随后用肥皂和水清洗PDMS，并将其与DMEM AROS溶液一同进行高压灭菌。现在将高压灭菌后的PDMS模板放置于水平表面上，先用移液器将熔融的AROS注入每个中心柱状模具中，再将AROS注入其周围的空隙中。

让琼脂糖凝胶固化约15分钟。然后将模具倒置，使琼脂糖块从PDMS上脱模。剪去每个孔周围多余的琼脂糖，然后将一个琼脂糖孔放入12孔板的每个孔中。

在Aros小室的外周加入细胞培养基，注意不要覆盖小室的顶部。随后将培养板放入培养箱中，使小室在细胞准备期间达到平衡。当细胞融合度达到90%时，用胰蛋白酶消化大鼠主动脉平滑肌细胞并重悬。

将细胞重悬于浓度为每毫升5 × 10⁶个细胞的溶液中。然后吸取100 µL重悬的细胞悬液，加入已平衡的aroS孔板的每个孔中。采用环形运动方式，将细胞均匀加入各孔。

将培养板放入培养箱中，静置培养24小时。每两天更换一次培养基，通过吸去孔周围培养基，然后重新加入培养基，直至aro模具完全浸没。培养结束时，用PBS填充一个小的培养皿。

将每个环从其 aros 模具中取出，通过将其沿中心柱顶部滑出。将环放置在含有 PBS 的培养皿中，并置于数字成像系统下。使用边缘检测软件测量环周四个位置（上、下、左、右）的环厚度。

进行单轴拉伸测试。将环形样品安装在两根细金属丝夹具上。拉伸夹具，直至环形样品受到5 mN的撕裂载荷。

然后输入根据厚度测量值计算得到的横截面积，并记录标距长度。在撕裂载荷与50千帕之间对环形试样进行八次预循环。第八次预循环后，以10毫米/分钟的速率施加应力，直至试样以10毫米/分钟的速率被拉伸至断裂。

对于每个环状结构，测量其极限抗拉应力和断裂应变，并根据获取的数据计算最大切线模量。除了功能性体外研究外，这些活细胞环还可融合形成组织管。使用手术剪将硅胶管的末端斜向剪切，以形成斜面边缘，然后在对硅胶管进行高压灭菌的同时完成灭菌处理。

将培养基加入培养皿中，在生物安全柜中转移已灭菌的定制硅胶管支架，并将其放入空的培养皿内。接着，从Aros小室中取出环状结构，放入盛有培养基的培养皿中。将硅胶管也放入同一培养皿中，以润湿备用。

使用镊子将硅胶管的末端插入环的中心，然后沿硅胶管轻轻滑动，使环彼此接触。将环逐个沿管子两个方向轻轻推动，使其相互接触。环安装完毕后，将硅胶管对齐放入聚碳酸酯支架内，并将支架的两部分拧紧固定。

向培养皿中加入 55 毫升培养基。在培养期间每三天更换一次培养基，以去除组织管。首先，用 PBS 填充培养皿。

然后从聚碳酸酯支架上取下硅胶管，用镊子将组织管从硅胶管上滑下并放入培养皿中。操作正确时，细胞会沉降到 Agarros 微孔板孔的底部，并在接种后 24 小时内收缩，在微孔中心柱周围形成一圈组织环。此图为由大鼠平滑肌细胞生成的 2 毫米组织环在单轴拉伸试验中获得的典型应力-应变曲线。随后利用该曲线的极限抗拉强度、最大抗拉模量和断裂应变值，来比较在不同培养条件下生长的组织环样品的力学性能。

通过改变培养参数（包括细胞接种数量、培养时间、培养基以及所使用的细胞类型），可以调控组织环的力学性能。除了大鼠平滑肌细胞外，人原代平滑肌细胞也能形成具有相似抗张强度的组织环。

人间充质干细胞也会聚集形成环状结构，但其强度不足以进行力学测试。我们的系统能够通过将细胞接种到定制的 aros 微孔中，完全由细胞构建出工程化组织结构。一旦初始的聚碳酸酯模具加工完成，我们便可制备出无限数量的 PDMS 模板，进而用于制作模具，因此无需额外的设备。

该系统的用途十分广泛，我们已在该系统中使用了多种不同类型的细胞来制备组织环，因此该系统既可用于组织工程应用，也可用于体外研究细胞和细胞外基质对组织结构与功能的贡献。