定向细胞自我组装制造，为生物力学分析与组织工程细胞衍生的组织环

该程序的总体目标是从聚集的细胞和细胞衍生基质中创建可用于功能分析的 3D 组织构建体。这是通过首先铣削聚碳酸酯模具以创建圆底环形孔来实现的。接下来，将聚二甲基 Sloane 或 PDMS 浇铸到聚碳酸酯模具上以创建模板。

然后使用 PDMS 模板形成 aros wells。最后一步是将细胞接种到 aros 孔中，让它们聚集并形成有凝聚力的组织环。最终，该方法可用于使用不同细胞类型实现细胞自组装和组织工程，并能够分析细胞和细胞衍生的细胞外基质对组织结构和功能的贡献。

与其他组织工程方法相比，该技术的主要优点是我们可以完全从细胞和细胞外基质生成组织构建体，它们产生的速度比以前报道的要快，并且以有利于机械分析的形式，首先铣削半英寸厚的聚碳酸酯，以创建 15 个圆底环形孔，中心柱直径为 2 毫米。清洁聚碳酸酯模具以去除铣削过程中产生的任何塑料碎屑，然后让模具干燥。接下来，以 10：1 的比例混合 PDMS，对溶液进行脱气以去除所有气泡，然后将其倒入聚碳酸酯模具中。

然后再次在模具上对混合物进行脱气，以去除任何残留的气泡，并在 PDMS 固化溶解的同时，在 60 摄氏度的烘箱中固化 PDMS 四个小时。固化后，DMEM 中的 2%AROS 小心地将 PDMS 模板从聚碳酸酯上剥离，然后用肥皂和水清洗 PDMS，并将其与 DMEM AROS 溶液一起高压灭菌。现在将高压灭菌器 PDMS 模板放在水平表面上，并通过首先将 aros 移液到每个中心柱模具中，然后将 aros 移液到它们周围的空间中，用熔融的 aros 填充它。

让 aros 凝固约 15 分钟。然后倒置模具以从 PDMS 中释放 aros。从每个孔周围切下多余的 aros，然后将一个 aros well 放入 12 孔板的每个孔中。现在。

在 aros 孔的外部添加细胞培养基，不要覆盖孔的顶部。然后将板放入培养箱中，让它们在制备细胞时保持平衡。在 90% 汇合时胰蛋白酶、大鼠主动脉平滑肌细胞和复苏。

5 倍 10 至 6 个细胞/毫升的浓度悬浮细胞。然后将 100 微升重悬的细胞悬液移液到每个平衡的 aros 孔中。使用圆周运动将细胞施加到每个孔中。

将板放入培养箱中，静置 24 小时。每两天更换一次培养基，从孔周围吸出培养基，然后重新填充每个孔，直到 aros 模具完全浸没。在培养结束时，用 PBS 填充一个小培养皿。

将每个环滑过中心柱的顶部，将其从其 aros 模具中取出。将环放入带有 PBS Center 的培养皿中，PBS 中心是数字成像系统下方的一个环。使用边缘检测软件测量环在其圆周上、下、左、右四个位置的厚度。

进行单轴拉伸试验。将环形样品安装在两个细丝夹具上。拉长夹具，直到对环施加 5 毫牛顿的撕裂载荷。

然后输入根据厚度测量值计算的横截面积并记录标距长度。在撕裂负荷和 50 公斤帕斯卡之间对环进行 8 次预循环。在第八个前循环后，以每分钟 10 毫米的速度承受应力，以每分钟 10 毫米的速度拉至失效。

对于每个环，测量极限拉伸应力和失效应变，并根据采集的数据计算最大切线模量。除了功能性体外研究外，这些活细胞环还可以融合形成组织管。使用手术剪刀将硅胶管的末端以一定角度剪断，以形成斜边，然后在对硅胶管进行高压灭菌时对硅胶管进行高压灭菌。

用培养基填充培养皿，将经过灭菌的定制硅胶管架转移到生物安全柜中，然后放入空的培养皿中。接下来，从 aros 孔中取出环，并将它们放入装满培养基的培养皿中。使用前将硅胶管放入同一个培养皿中润湿。

使用镊子将硅胶管的尖端放入硅胶管的中心，然后将硅胶管轻轻滑到硅胶管上。沿着管子沿两个方向轻轻地连续推动环，使环彼此接触。安装环后，将硅胶管对准聚碳酸酯支架内，并将支架的两个部分拧在一起。

将 55 毫升培养基加入培养皿中。在培养期间每三天更换一次培养基以去除组织管。首先，用 PBS 填充培养皿。

然后从聚碳酸酯支架上松开硅胶管，用镊子将组织管从硅胶管滑入培养皿中。如果作正确，细胞会沉淀在 aros 井的底部，并在就位后 24 小时内收缩，在 Agarro 井的中心柱周围产生一个组织环，这是从大鼠平滑肌细胞产生的两毫米组织环的单轴拉伸试验中获得的应力应变曲线的代表性图。然后使用极限拉伸强度、最大拉伸模量和失效应变值来比较在不同培养参数下生长的组织环样品的机械性能。

组织环的机械性能可以通过改变培养参数来控制，包括细胞座数、培养物长度、培养基和所用细胞类型。除了大鼠平滑肌细胞。人类原代平滑肌细胞形成具有相似拉伸强度的组织环。

人类间充质干细胞也聚集形成环，但它们的强度不足以进行机械测试。我们的系统只需将细胞接种到我们定制的 aros 孔中，即可完全从细胞中制造工程组织构建体。一旦加工了最初的聚碳酸酯模具，我们就可以制作无限数量的 PDMS 模板，然后可以使用这些模板来制作模具，因此不需要额外的设备。

该系统用途广泛，因为我们在系统中使用了多种不同的细胞类型来制造组织环，因此该系统可用于组织工程应用以及细胞和细胞外基质对组织结构和功能贡献的体外研究。