Name: 单细胞组蛋白翻译后修饰（sc-hPTM2）多复分析的自动样品制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: 学习单细胞组蛋白翻译后修饰的自动化多重分析方法，使用同位素双标记策略实现高通量样品制备。该方法可高灵敏度定量分析染色质异质性，为表观遗传学研究提供可靠技术支撑。

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我们感谢阿尔伯特·爱因斯坦医学院分子细胞遗传学核心实验室的 Bernice Morrow 博士和 Jidong Shan 博士在维护 cellenONE 仪器方面所做的工作。

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</ol>

J.C. 是 SCIENION US Inc. 的员工。

在单细胞水平上检测组蛋白翻译后修饰的能力，是深入理解染色质调控真实异质性的关键一步。传统的群体检测方法虽然为组织中组蛋白翻译后修饰（hPTMs）的平均分布提供了宝贵见解，但却掩盖了日益被认识到具有生物学意义的细胞间变异5。当前的单细胞蛋白质组学方法使我们能够解析这一隐藏的复杂性层次，揭示可能介导差异性基因调控、细胞可塑性及疾病易感性的不同染色质状态4。组蛋白修饰特别适合于单细胞层面的研究，因其编码了指导转录结果的组合性信息13。例如，H3K9ac 与 H3K14ac 修饰的共存，比单一修饰更能有效指示转录激活状态10。在单细胞分辨率下捕捉此类共现模式，为表征染色质景观及其动态变化提供了全新的视角。
尽管具有上述优势，单细胞组蛋白翻译后修饰（PTM）分析在技术上仍然具有挑战性。其局限性包括蛋白投入量极低、需要精确的样品操作，以及难以区分技术性噪声与生物学噪声5...

组蛋白是核小体的蛋白质组分，而核小体是染色质的重复单位。其N端尾部富含赖氨酸和精氨酸残基，并受到乙酰化、甲基化和磷酸化等翻译后修饰（PTMs）的高度调控。这些修饰影响DNA的可及性，从而调控转录、复制和修复等过程。组蛋白PTM模式的异常与多种疾病状态密切相关，从癌症到神经退行性疾病及衰老1,2。因此，组蛋白PTM分析在表观遗传学和蛋白质组学研究中备受关注。质谱（MS）可实现位点特异性和定量的组蛋白修饰分析，但组蛋白在分析上具有独特的挑战性。其氨基酸组成、多个修饰位点以及复杂的组合修饰模式使其比典型蛋白质更难分析。现有方法依赖于在酶解前对赖氨酸残基进行化学衍生化以阻断其活性，从而提高肽段回收率和色谱性能3。尽管该方法在群体细胞分析中有效，但多步骤的衍生化流程可能导致样品损失，这对于单细胞样本而言尤为不利。由于生物系统本质上具有异质性，单细胞分析正变得越来越重要。群体细胞的组蛋白分析会对大量细胞的信号进行平均，因而无法捕捉这种异质性。细胞亚群在染色质状态上可能存在差异，而这些差异可能驱动发育、细胞重编程或药物应答4,5。
本文介绍了一种用于多重单细胞组蛋白翻译后修饰分析（sc-hPTM2）的自动化样品制备方法。该方法基于CellenONE系统，可实现单个细胞及纳升级试剂的精确分配，且操作过程自动化。本方法是对纳米蛋白质组样品制备（nPOP）方法的一种改进，后者首次提出了在玻片上进行液滴制备的技术6。nPOP平台推动了自动化单细胞蛋白质组学的发展，但其标准的胰蛋白酶消化方案由于组蛋白富含赖氨酸且修饰位点密集，因而并不适用于组蛋白分析。本文中，我们对CellenONE系统进行了优化，引入了以丙酸酐进行组蛋白衍生化的金标准方法，并结合同位素标记，实现了在单细胞分辨率下对组蛋白翻译后修饰进行准确而全面的定量分析。具体而言，我们采用ArgC Ultra蛋白酶进行蛋白质消化，简化了实验流程。与胰蛋白酶不同，ArgC仅在精氨酸位点切割，无需对赖氨酸进行封闭，从而避免了两步衍生化策略，使流程更加高效。此外，本方法采用丙酸酐与氘代丙酸酐（propionic anhydride-d10）进行双重同位素标记，可同时分析两个单细胞样品7,3。在完成消化和标记后，回收单细胞样品，并通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）/MS结合数据非依赖性采集（DIA）方式进行分析。在我们的实验中，与该方法的先前版本相比，本方法在组蛋白翻译后修饰的定量灵敏度和重复性方面均有显著提升8。
为展示该方法，我们对源自HepG2/C3A肝细胞癌细胞的球状体中的单细胞组蛋白翻译后修饰（PTM）动态进行了分析。我们用丁酸钠处理这些球状体，丁酸钠是一种特征明确的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可增加组蛋白乙酰化水平，常用于探究染色质调控的基准试剂9,10。通过在单细胞分辨率下比较对照组与丁酸钠处理组的球状体，我们展示了代表性结果的原理验证，突显了该方法在染色质生物学和癌症表观遗传学中更广泛的应用潜力。值得注意的是，本实验方案参考了先前发表的研究，其中描述了三维球状体的培养与处理方法10、质谱中组蛋白肽段的获取11，以及使用EpiProfile软件进行数据分析的流程12。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Bio-Rad</td><td>2239480</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L 宽口移液器吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>14222703</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L 宽口移液器吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>14222730</td><td></td></tr><tr><td>384 孔低吸附 PCR 板&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30129547</td><td></td></tr><tr><td>96 孔真空过滤装置</td><td>Millipore</td><td>MAVM0960R</td><td></td></tr><tr><td>乙腈，Optima LC-MS/MS 级</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>PCR 板压敏封膜</td><td>Thermo Fisher</td><td>AB0626</td><td></td></tr><tr><td>无水乙腈</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA42311AK</td><td>用于标记母液（大量）</td></tr><tr><td>Arg-C Ultra，质谱级</td><td>Promega</td><td>VA1831</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养级水</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>CellenVIALs</td><td>SCIENION</td><td>/</td><td>货号需报价获取</td></tr><tr><td>DMSO，无水</td><td>Thermo Fisher</td><td>D12345</td><td>用于标记母液</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632-5G</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT17205CV</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Thermo</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>甲酸 98%&amp;ndash;100%，用于 LC-MS，LiChropur 级</td><td>Sigma</td><td>5330020050</td><td></td></tr><tr><td>汉克平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21022CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES（超纯）</td><td>Thermo Fisher</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 级乙腈</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 级水</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>羟胺溶液，50&amp;nbsp;wt. % 溶于 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>438227-50ML</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25015CI</td><td></td></tr><tr><td>n-十二烷基-β-麦芽糖苷（DDM）去垢剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>BN2005</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Exploris 480 质谱仪</td><td>Thermo Fisher</td><td>BRE725539</td><td></td></tr><tr><td>16% 甲醛水溶液，电镜级</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>PDC-CM（2 型涂层）</td><td>SCIENION</td><td>/</td><td>货号需报价获取</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT3002CI</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），10×，pH 7.4，无 RNase</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 二甲基亚砜（DMSO），LC-MS 级</td><td>Thermo Fisher</td><td>85190</td><td></td></tr><tr><td>移液枪</td><td>Eppendorf</td><td>Z666467 (Milipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>丙酸酐 &amp;ge;99%</td><td>Sigma</td><td>240311-50G</td><td></td></tr><tr><td>丙酸酐-d10 &amp;ge;98 原子% D，&amp;ge;99% (CP)</td><td>Sigma</td><td>615692-1G</td><td></td></tr><tr><td>冷冻离心机</td><td>Thermo</td><td>75-217-420</td><td></td></tr><tr><td>SciCHIP H1 涂层玻片</td><td>SCIENION</td><td>/</td><td>货号需报价获取</td></tr><tr><td>真空浓缩仪（适用于 96 孔板）</td><td>Thermo</td><td>15308325</td><td>Savant SPD1010</td></tr><tr><td>无菌操作台</td><td>Thermo</td><td>1375</td><td></td></tr><tr><td>无菌移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367549</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green 死细胞染料，用于流式细胞术</td><td>Thermo Fisher</td><td>S34860</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 酶（1×），无酚红</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Sigma</td><td>Z258415</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD10</td><td></td></tr></tbody></table>

用于单细胞组蛋白翻译后修饰多重分析（sc-hptm2）的自动化样本制备

Automated Sample Preparation for the Multiplexed Analysis of Single-Cell Histone Post-Translational Modifications (sc-hPTM2)

组蛋白翻译后修饰（hPTMs）是染色质结构和基因表达的核心调控因子。其失调与发育、癌症及衰老密切相关。尽管质谱法是研究组蛋白翻译后修饰的首选方法，但大多数现有方案均针对大量样本设计，无法解析细胞间的异质性。因此，将组蛋白PTM分析扩展到单细胞水平至关重要，但在技术上具有挑战性，因为组蛋白丰度低、富含赖氨酸且存在大量修饰。
本文介绍了一种利用纳米级液体处理技术实现组蛋白翻译后修饰（PTM）分析的自动化单细胞蛋白质组学工作流程。该系统可对单个细胞进行纳升级别的处理，操作步骤极少且具有高度可重复性。该工作流程采用ArgC Ultra蛋白酶进行消化，该酶特异性切割精氨酸残基，避免了组蛋白蛋白质组学中通常所需的赖氨酸封闭衍生化步骤。为了实现不同条件之间的定量比较，我们采用丙酸酐及其氘代类似物丙酸酐-d10进行双重标记策略。这种自动化样品制备、同位素多重标记与ArgC Ultra消化相结合的方法，建立了一种高效且灵敏的单细胞组蛋白PTM分析方案。
该方法可用于在单细胞分辨率下研究染色质异质性以及表观遗传扰动的影响。为演示实验流程，我们利用HepG2/C3A肝细胞癌细胞生成了球状体，并使用丁酸钠进行处理，后者是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可诱导组蛋白高乙酰化。

为了展示我们利用该系统进行单细胞组蛋白蛋白质组学工作流程的应用，我们分析了经5 mM丁酸钠处理24小时的HepG2/C3A细胞球状体。在完成LC-MS/MS采集后，使用EpiProfile对轻标（丙酸酐）和重标（丙酸酐-d10）数据进行处理，获得归一化后的数据，以表示肽段和组蛋白修饰的丰度。随后使用QuantQC R软件包将液体处理仪的采集元数据与EpiProfile输出结果进行匹配，从而获取每个单细胞中肽段组成及其丰度信息；接着过滤掉在少于50%单细胞中未被稳定检测到的肽段变体，并剔除单细胞信号强度未超过空白样本信号150%的肽段变体。随后对数据进行log(1+x)转换归一化处理，生成用于下游分析的结果表格，该表格包含一列表示各种肽段变体，以及对应每个单细胞的多列，用以展示各鉴定出的肽段变体的丰度值。
图7A 展示了定量的前20种组蛋白H3肽段变体结果表的代表性子集。数值以对照组和丁酸钠处理组条件下的相对丰度表示。该概览突显了该工作流程能够在单细胞分辨率下检测多种翻译后修饰状态，包括甲基化、乙酰化以及组合修饰标记。例如，...

本文介绍了一种利用同位素双联标记策略和ArgC酶解实现单细胞组蛋白翻译后修饰分析自动化的实验方案。该工作流程能够以单细胞分辨率对染色质异质性和表观遗传响应进行定量、可重复且高灵敏度的分析。

用于单细胞组蛋白翻译后修饰多重分析（sc-hPTM2）的自动化样本制备

组蛋白翻译后修饰（hPTMs）是染色质结构和基因表达的核心调控因子。其失调与……密切相关。

我们正在通过一种自动化的多重方法推进单细胞蛋白质组学，以研究翻译后修饰的全基因组染色质异质性。该实验方案的难点在于皮克量级的蛋白质组制备、多重标记以及复杂组合修饰组蛋白肽段的解析。首先，在冰上预冷的PBS中重悬Hep G2/C3A肝细胞癌细胞，终浓度为每微升200至500个细胞。将每个喷嘴的脉冲宽度和驱动电压设置为制造商提供的数值。为了获得最大拾取效率，确保两个喷嘴之间的Z轴偏移量相差小于50微米。确定每个喷嘴的最佳接触位置，并在喷嘴设置选项卡中比较Z轴高度读数。对于tuplex多重检测方案，将单个载玻片加载到通风橱中的载玻片架上，然后转移至仪器中。使用移液器，将150微升LCMS级DMSO分装至新的PCR管中。将该PCR管放入清洗站的2号位置，管盖朝向仪器门方向。开始DMSO运行。在吸取DMSO后，获得一次稳定的液滴。注意PDC透明度的变化。可能需要增加电压。通过进行液滴体积检查来验证稳定性。执行喷头摄像头向导设置以校准摄像头。分配DMSO，并让仪器自动冲洗喷嘴，同时对所有载玻片进行成像以进行质量控制。检查这些图像，确认每张载玻片上的DMSO液滴均匀，并检查是否存在缺失或偏离目标位置的液滴。吸取细胞悬液后，打开一个模块中的细胞，执行背景成像，然后运行定位程序以定义喷射区域。运行分析，然后根据细胞大小和伸长程度对颗粒进行设门筛选。现在，用LCMS级水配制新鲜的消化主混合液。将溶液置于冰上，用真空泵脱气10分钟。将消化液加到载玻片上后，让仪器自动冲洗喷嘴并对每张载玻片拍照。检查图像，确认每个液滴均均匀覆盖消化液。将载玻片在室温下孵育过夜，以完成消化过程。启动蒸发程序并过夜消化后，检查图像。如果液滴已充分干燥，则停止程序；否则，单击继续，再干燥五分钟。标记时，首先制备用于多重组蛋白衍生化的储备溶液。加样后，让仪器自动冲洗喷嘴并对每张载玻片拍照。检查图像以确认所有载玻片上的溶液分布均匀且液滴位置正确。孵育完成后，加入羟胺溶液以终止反应。要采集样品时，在主选项卡中选择运行程序，然后在运行选项卡中启动运行。样品采集完成后，查看图像以检查是否存在任何错误。完成上样后，取下上样板的盖子。然后在真空浓缩仪中用低温干燥样品。进行数据采集时，设置高效液相色谱方法。设置质谱二级实验，包含50个质量电荷的隔离窗口、27%的高能碰撞解离以及1000%的自动增益控制目标。用橡胶密封垫覆盖样品板，并将其放入自动进样器中。获取原始文件后，先简要检查色谱图，然后使用EpiProfile 2.1版本分析原始数据。查看标准化组蛋白PTM丰度的输出表格，并将其用于后续分析。对前20种组蛋白H3肽段变体进行了定量，展示了其在对照组和丁酸钠处理条件下的相对丰度。H3 K9乙酰化和H3 K14乙酰化在丁酸钠处理后均显示出更高的相对丰度，而H3 K9乙酰化K14乙酰化在处理细胞中似乎更加富集。经丁酸钠处理后，总乙酰化水平升高，与对照组相比，处理组细胞的误差分布更广，反映出在单细胞水平上捕获到更高的异质性。单个及共发生的组蛋白修饰定量结果表明，组合型乙酰化状态受丁酸钠影响最为显著。丁酸钠处理组细胞更广泛的分散趋势表明，类球体中单个细胞间的生物学异质性增加。本方案通过使科学家能够在单细胞水平上研究染色质状态，填补了表观遗传学研究领域的空白。该工作流程支持高通量样本制备、样本多重化以及无偏倚质谱分析，从而生成兼具高灵敏度和定量性的单细胞表观遗传数据。未来的研究将探索染色质调控如何影响癌症、代谢性疾病和衰老等疾病状态。

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单细胞组蛋白翻译后修饰（sc-hPTM2）多复分析的自动样品制备

本方案概述了一种利用质谱法（MS）全面表征组蛋白翻译后修饰的整合工作流程。该流程包括从细胞培养物或组织中纯化组蛋白、组蛋白衍生化与消化、采用纳米流速液相色谱进行质谱分析，以及数据分析的详细说明。本方案设计可在2至3天内完成。...

使用自下而上质谱法分析组蛋白翻译后修饰的完整工作流程：从组蛋白提取到数据分析

本文描述了将肽微阵列技术应用于识别组蛋白及其翻译后修饰的抗体特异性分析的方法。...

利用肽微阵列分析组蛋白抗体特异性

本文的目的是提供一份全面、系统的指南，用于高效纯化组蛋白H3和H4，并定量分析乙酰化组蛋白残基。...

组蛋白H3和H4蛋白的纯化及细胞与脑组织中乙酰化组蛋白修饰的定量

本工作流程描述了同时对多种蛋白质翻译后修饰（PTM）进行高效、经济的时间和成本控制下的富集，以实现定量全局蛋白质组学分析。该方案采用多抗体偶联的肽段水平PTM富集方法，随后结合数据非依赖性采集质谱分析，以深入理解PTM之间的相互调控关系。...

同时富集两种翻译后修饰以实现定量与修饰位点定位

在此，作者展示了MULTI-seq在表型分析及后续配对的单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞ATAC测序（scATAC-seq）中的应用价值，用于表征视网膜中的转录组和染色质可及性谱型。...

利用单细胞RNA测序和单细胞ATAC测序对视网膜基因表达与染色质可及性进行多重分析

本方案概述了如何利用三维细胞培养系统在接近生理状态下建模、处理和分析染色质修饰。...

三维肝组织细胞培养模型中组蛋白翻译后修饰的全局定量分析

本研究描述了一种利用细胞核内流式细胞术对分离自脑组织的小胶质细胞进行全基因组组蛋白修饰定量的实验方案。本研究还包含了用于数据采集的小胶质细胞分离方案。...

利用核内流式细胞术定量分析分离的小鼠脑小胶质细胞中组蛋白全局翻译后修饰

基于液相色谱、捕集离子淌度质谱和飞行时间质谱（LC-TIMS-ToF MS/MS）的分析工作流程，用于高置信度和高重复性的“自下而上”组蛋白修饰分析，并依据主要参数（保留时间 [RT]、碰撞截面 [CCS] 和精确质荷比...

使用液相色谱、捕获离子淌度谱和飞行时间质谱进行组蛋白修饰筛选

本方案可从多种临床样本中高效提取组蛋白，用于后续通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）进行翻译后修饰分析。通过实现对关键组蛋白修饰的可靠检测，该方法可作为大规模临床队列中全面表观遗传学分析的重要工具。...

从临床样本中提取组蛋白用于质谱法进行表观遗传学分析

近期在骨骼过度生长患者中发现人类纺锤体相关蛋白家族成员4（SPIN4）的遗传变异，这是一种新型发育障碍。本文介绍了一种实验方案及新研究成果，描述了在核小体背景下通过生物化学方法鉴定SPIN4结合底物——修饰组蛋白的过程。...

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空间分辨的、整合式单细胞多组学分析：在冷冻组织切片中对转录组与表观基因组靶标进行联合检测

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