单细胞组蛋白翻译后修饰（sc-hPTM2）多复分析的自动样品制备

我们正在通过自动化多重方法推动单细胞蛋白质组学的发展，以研究翻译后修饰的全局染色质异质性。该方案的挑战在于皮克级蛋白质组制备、多重标记以及复杂组合修饰组蛋白肽的解析。首先，在冰冷PBS中以每微升200至500个细胞的最终浓度重建肝细胞癌细胞。

将每个喷嘴的脉冲宽度和驱动电压设置为制造商提供的数值。为了最大化拾取效率，确保两个喷嘴之间的Z偏移相差不超过50微米。确定每个喷嘴的最佳接触位置，并在喷嘴设置标签中对比Z高度读数。

对于双重复用方案，将单条滑管加载到罩子的滑管架上，然后转移到乐器上。使用移液器将150微升LCMS级DMSO注入新的PCR管中。把它放在洗涤站的第二位置，管盖朝向仪器门。

开始DMSO运行。在吸出DMSO后，获得一次稳定的滴落。注意PDC透明度的变化。

可能需要提高电压。通过进行掉落体积检查来验证稳定性。执行头部相机向导设置以对准相机。

使用DMSO，使仪器能够自动冲洗喷嘴，并拍摄所有载玻片的图像以实现质量控制。请查看这些图像，以确认每张切片上的DMSO液滴均一，并检查是否有缺失或偏离目标的液滴。抽气后，打开一个模块中的单元，进行背景捕获，然后运行映射程序以定义弹出区。

运行分析后，根据大小和伸长度对粒子进行门控选择单元。现在，用LCMS级水准备新鲜的消化主混合液。用真空泵在冰上将溶液脱气10分钟。

将消化混合物倒在载玻片上后，让仪器自动冲洗喷嘴并拍摄每一张载玻片。查看图像以确认每个液滴均匀接受消化混合物。将载玻片在室温下孵育一夜以进行消化。

开始蒸发运行和隔夜消化后，检查图像。如果水滴足够干燥，停止运行。如果没有，点击继续，再晾干五分钟。

标记时，首先准备多重组蛋白衍生的库存溶液。分配后，让仪器自动冲洗喷嘴并拍摄每一张玻片。检查图像以确认所有玻片上的液滴分布均匀并正确放置。

孵育完成后，分配羟胺溶液进行淬火。要取样，请在主标签页选择跑步，然后在跑步标签页开始跑步。取货完成后，检查图片是否有错误。

拾音器完成后，把拾音器盖从拾音器板上取下。然后在真空浓缩器中以低温干燥样品。数据采集时，可以编程高性能液相色谱方法。

将MS 2实验设定为隔离窗口为50质量过载，高能碰撞解离为27%，自动增益控制目标为1000%。用橡胶密封垫覆盖板，放入自动采样器内。获得原始文件后，简要检查色谱图，然后在EpiProfile 2.1版本中运行原始数据。查看归一化组蛋白PTM丰度的输出表，并用于后续分析。

对前20种组蛋白H3肽形态进行了定量，显示了它们在对照组和丁酸钠处理条件下的相对丰度。H3 K9乙酰化和H3 K 14乙酰化在丁酸钠处理后均表现出更高的相对丰度。而H3、K9乙酰化、K14乙酰化在处理细胞中表现得更为浓缩。

丁酸钠处理后，总乙酰化水平增加，处理细胞的误差分布较对照组更宽，反映单细胞水平捕捉的更高异质性。单一及共病组蛋白修饰的定量表明，乙酰化组合状态最受丁酸钠影响。丁酸钠处理细胞的更广泛分布表明球体内部单个细胞间的生物异质性增加。

该方案通过使科学家能够研究单细胞溶液中的染色质状态，弥合了表观遗传学研究的空白。该工作流程支持高通量样品制备、样品复用和无偏质谱技术，生成灵敏且定量的单细胞表观遗传数据。未来的研究将探讨染色质调控如何改变癌症、代谢疾病和衰老等疾病状态。