Name: 酿酒酵母新生与成熟转录本的RNA结构比较分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-27T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 了解酿酒酵母中新生与成熟RNA结构的比较分析方法CoSTseq。该技术可同时测定RNA聚合酶位置和碱基配对状态，揭示转录过程中的RNA折叠动态及其成熟过程中的结构变化。

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作者谨此感谢 Dr. SK Boopathy Jegathambal 提供的编程支持，以及 Neugebauer 实验室的成员，特别是 P. Bech，他们在研究过程中提供的有益讨论。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）（项目编号：R01GM112766，授予 KMN）以及美国心脏协会（AHA）博士前奖学金（项目编号：908949，授予 LS）的资助。LPS 获得了美国国立卫生研究院培训基金 5T32GM14943803 的支持。LRAB 获得了美国心脏协会博士后奖学金（项目编号：26POST1569544）的支持。在耶鲁基因组分析中心进行的数据采集工作得到了美国国立卫生研究院下属国家普通医学科学研究所的支持，资助编号为 1S10OD03036301A1。本研究的全部责任由作者承担，研究内容不一定代表 NIH 的官方观点。

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作者无任何利益冲突需要披露。

RNA由于碱基配对的动力学速度快于其合成速率，因此在转录过程中即开始折叠24,25,26,27目前，我们对新生RNA折叠的认识主要来自对原核生物RNA的单分子研究， 体外 探针，或 计算机模拟 方法。在本方案中，介绍了CoSTseq的详细工作流程；该技术能够 体内 相对于RNA聚合酶位置的新生转录本共转录折叠的检测 S. cerevisiae10. 本方案概述了数据分析流程，重点介绍质量控制步骤。
在应用CoSTseq及相关方法时，应遵循常规实验室安全规范，包括但不限于佩戴1至2副手套（尤其是在接触二甲基硫酸酯（DMS）等有害化学品时），以及穿着实验服以保护操作人员并降低RNA污染或降解的风险。处理RNA时必须...

RNA 可通过分子内的碱基配对折叠成二级和三级结构，这些结构还可受到充当分子伴侣的蛋白质影响，从而引导 RNA 的正确折叠1。RNA 结构具有高度动态性，细胞内的 RNA 可根据其热力学景观采取多种构象，形成一组可能的 RNA 三维结构集合2。这种动态的构象变化可能影响基因调控和表达3,4。相反，RNA 也可形成高度稳定的结构，这些结构与其功能密切相关，例如 tRNA、小核 RNA（snRNA）和 rRNA。尽管这些例子强调了成熟 RNA 在调控中的重要作用，但真核生物的 RNA 加工过程通常与转录同时发生，包括前体 mRNA 剪接、3'端切割以及 RNA 修饰。同样，RNA 的折叠也可能在转录本成熟之前即已开始，如其他文献所述5。
尽管RNA序列可以编码其二级结构，但准确确定其结构通常需要在体外或体内进行实验验证in vitro或in vivo。随着诸如DMS-MaPseq（二甲基硫酸盐突变谱分析结合测序）等结构特异性化学修饰技术的发展，现已能够从活细胞中解析细胞内RNA的二级结构6。将DMS引入细胞后，它会特异性地甲基化腺苷、胞苷以及一定程度上的尿苷的沃森-克里克碱基配对面，而这些位点只有在未配对状态下才可被修饰。经DMS修饰后，可使用高保真且高度持续性的逆转录酶（如耐热II型内含子逆转录酶，TGIRT）7，将修饰过的碱基在最终构建的cDNA文库中转化为突变位点。这些突变可用于推断RNA在核苷酸水平上的可及性。尽管该技术功能强大，DMS-MaPseq及相关方法迄今主要被用于研究已完全折叠的成熟RNA6。
已开发出多种方法用于研究新生RNA的调控与加工过程。为克服RNA-seq技术的局限性，研究者开发了全局延伸测序（GROseq）技术。RNA-seq仅能检测细胞中RNA水平的稳态，因此所提供的信息是转录、RNA加工及降解等影响RNA水平过程的平均结果。GROseq利用溴代尿苷进行核内延伸实验，使RNA聚合酶（Pol）能够在新生RNA上以数十个碱基的分辨率添加核苷酸8。在此基础上发展出的精确延伸测序（PROseq）技术，则通过使用生物素标记的核苷三磷酸（biotin-NTPs）实现了在单碱基分辨率上对新生RNA上RNA聚合酶位置的定位。该方法中，当RNA聚合酶在新合成RNA的3'末端最后一次被检测到时，即加入一个生物素标记的核苷酸9。
最近，Schärfen 等人开发并使用了共转录结构追踪技术（Co-transcriptional Structure Tracking, CoSTseq），该技术利用并改进了生物素延伸标记（biotin run-on）和DMS探针法，实现了对酿酒酵母（S. cerevisiae）新生转录本RNA结构的测定10。CoSTseq 能够在活跃转录过程中测定RNA二级结构；本实验方案详细描述了在CoSTseq实验中如何将核内延伸标记（nuclear run-on）与DMS探针法相结合。由于CoSTseq在样品制备过程中需要精细操作，并且在数据分析阶段需严格把控数据质量，因此本方案详述了在Illumina测序平台上构建适用于双端测序文库的最佳实践。CoSTseq实验可同时获得新生RNA和成熟RNA，后者可作为DMS-MaPseq数据集进行分析，从而实现新生RNA与成熟RNA之间的严格比较（图1）。实验方面，需要获取用于维持酵母培养、开展核内延伸标记及DMS探针实验的相关试剂，具体要求如下文所述。新生RNA的产量对CoSTseq文库构建和数据分析的成功至关重要，因此合适的培养条件（包括适宜的培养箱和培养基）是确保获得足够起始材料的关键。最后，为开展CoSTseq数据的计算分析，建议使用高性能计算（High-Performance Computing, HPC）集群。
<img alt="酵母RNA分析示意图；通透化处理、DMS处理、RNA提取、文库构建。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69945/69945fig1.jpg" data-altupdatedat="1780372819000" data-alt="图 1"> 
图 1：同一生物样本中联合进行CoSTseq与DMS-MaPseq文库构建的流程概览。（A） 使用月桂酰肌氨酸钠（sarkosyl）对酵母细胞壁和细胞核膜进行通透化处理，可在核内转录延伸反应中使生物素标记的核苷三磷酸（biotin-NTP）掺入新生RNA的3'末端。（B） DMS对通透化细胞中的新生RNA和成熟RNA上未配对的A和C残基（有时也包括U）进行甲基化修饰，随后通过苯酚/氯仿抽提获得总RNA。接着，利用链霉亲和素偶联的磁珠从总RNA中纯化出新生RNA；再通过TRIzol抽提将新生RNA从磁珠上洗脱下来。与此同时，含有聚腺苷酸化mRNA的磁珠上清液可经乙醇沉淀；由此材料可通过寡核苷酸(dT)磁珠下拉法分离mRNA。在文库构建前，Poly A+ mRNA需进行片段化处理。（C） 分别使用模板转换逆转录酶从新生RNA或成熟RNA生成cDNA，随后连接5'和3'接头，以引入N7 UMI和条形码（CoSTseq的详细步骤见图 2）。需注意的是，DMS-MaPseq与CoSTseq的逆转录步骤将使用不同的异源双链接头，其突出端分别与CoSTseq中使用的biotin-NTP和DMS-MaPseq中使用的N突出端互补。为减少文库偏差，扩增时采用最少的PCR循环数，并进行片段大小筛选以去除接头二聚体。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69945/69945fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>10 mM ATP</td><td>Invitrogen</td><td>18330019</td><td></td></tr><tr><td>10 mM 生物素-11-CTP</td><td>Jena biosciences</td><td>NU-831-BIOX</td><td></td></tr><tr><td>10 mM GTP</td><td>Invitrogen</td><td>18332015</td><td></td></tr><tr><td>10 mM UTP</td><td>Invitrogen</td><td>18333013</td><td></td></tr><tr><td>10X NEBuffer 1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7001S</td><td>用于第7.2.1步</td></tr><tr><td>10X 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS</td><td>RPI&amp;nbsp;</td><td>L23100-500</td><td></td></tr><tr><td>酸性酚:氯仿&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>用于片段大小筛选的AMPure XP磁珠</td><td>Beckman Coulter&amp;nbsp;</td><td>A63880</td><td>用于第7.5.1步的片段大小筛选</td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>Gibco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Gibco</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Bicine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B3876-100G</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319988</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5767-500G</td><td></td></tr><tr><td>DIFCO 琼脂</td><td>BD DIFCO</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>二甲基硫酸酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D186309-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads&amp;trade; MyOne Streptavidin C1 磁珠&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>65001</td><td>用于第4.1节的生物素下拉实验</td></tr><tr><td>Dynabeads&amp;trade; mRNA DIRECT&amp;trade; 纯化试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>61011</td><td>用于第5.1节的Poly A筛选</td></tr><tr><td>EDTA，pH 8，0.5 M</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>03690-100ML</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td>共沉淀剂，用于第4.2.7步和第5.2.4步</td></tr><tr><td>Induro&amp;reg;&amp;nbsp;逆转录酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0681S</td><td>第6.3.1步使用的逆转录酶</td></tr><tr><td>异戊醇</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>W205710-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>JT-BAKER</td><td>9084-05-01</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart PCR 试剂盒&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>07958889001</td><td>高保真DNA聚合酶，用于第7.3.2步和第7.4.1步的PCR反应</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLCM2154</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>用于第6.3.3步和第7.2.2步的DNA纯化</td></tr><tr><td>Mth RNA 连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M2611A</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸纯化与浓缩试剂盒（Oligo Clean &amp; Concentrator）</td><td>Zymo Research</td><td>D4060</td><td>建议用于第7.1.2步的DNA寡核苷酸纯化</td></tr><tr><td>乙酸钾&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>236497-500G</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>JT Baker</td><td>3040-01</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钾</td><td>Avantor</td><td>6984-04-01</td><td></td></tr><tr><td>RNA 纯化与浓缩试剂盒-5（RNA Clean &amp; Concentrator-5）</td><td>Zymo Research</td><td>R1014</td><td>第5.3.2步中PNK处理后的RNA纯化试剂盒</td></tr><tr><td>RNaseOUT&amp;trade; 重组核糖核酸酶抑制剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10777019</td><td>第5.3.1步PNK处理过程中使用的RNase抑制剂</td></tr><tr><td>Sarkosyl</td><td>IBI Scientific</td><td>IB07080</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Quality Biological</td><td>351-035-721</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5150-1L</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠&amp;nbsp;</td><td>Macron</td><td>7708-10</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase&amp;middot;In&amp;trade; RNase 抑制剂（20 U/&amp;mu;L）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2696</td><td>第6.3.1步中使用的RNase抑制剂</td></tr><tr><td>T4 多核苷酸激酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>耐热性5&amp;rsquo; App DNA/RNA 连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0319L</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl，pH 7.4，1 M</td><td>Thermo Scientific</td><td>J60202.K2</td><td></td></tr><tr><td>吐温X-100（Triton X-100）</td><td>TEKNOVA</td><td>T1105</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol&amp;trade; 试剂</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>用于第4.2节新生RNA的洗脱；在第4节中也称为&quot;RNA试剂&quot;</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

新生转录本与成熟转录本的rna结构比较分析 酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）

Comparative RNA Structure Analysis of Nascent and Mature Transcripts in Saccharomyces cerevisiae

转录过程中，新生RNA在离开RNA聚合酶（Pols）时即开始碱基配对。这种碱基配对促使RNA结构的形成，从而在RNA加工、翻译和稳定性水平上显著影响基因表达。目前研究RNA二级结构的既定方法仅限于成熟转录本，而对于折叠状态的研究仍知之甚少。此外，由于相对丰度较低（&#60; 1%）以及新生RNA的瞬时性为其分离与表征带来困难。共转录结构追踪技术（CoSTseq）结合转录延伸反应中掺入生物素标记的核苷三磷酸（biotin-NTP）和二甲基硫酸酯（DMS）探针，可同时获取RNA聚合酶的位置信息及新生转录本的碱基配对状态。在 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） CoSTseq 可获取由三种 RNA 聚合酶（RNA Pols）转录的新生 RNA 3'-端附近的序列与结构信息。在转录延伸过程中，生物素标记的核苷三磷酸（biotin-NTP）在聚合酶活性位点处掺入，有效阻滞 RNA 聚合酶的进一步延伸。随后，使用二甲基硫酸酯（DMS）处理样本，使未配对的腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U）发生甲基化修饰。接着通过生物素富集及使用模板转换逆转录酶进行 cDNA 合成，实现双端测序，并计算 DMS 反应活性随聚合酶位置的变化情况。CoSTseq 可与 DMS 探针技术（DMS-MaPseq）平行开展，从而同时捕获折叠后的成熟转录本结构信息。本文提供了 CoSTseq 与 DMS-MaPseq 平行实验的详细操作流程，包括转录延伸反应、文库构建及数据分析方法。

关键词：CoSTseq，DMS-MaPseq，新生 RNA，RNA 聚合酶，转录延伸，DMS 甲基化，结构探针，高通量测序，cDNA 合成，模板转换逆转录酶.

本节展示了按照本方案所述实施 CoSTseq 工作流程及分析后所产生的实际结果。首先，本节描述了测序前后对成功文库制备进行质量评估后所预期的结果。在测序之前，研究人员可通过测试性 PCR 和 TapeStation 分析来确认经生物素富集后是否存在 RNA，这表明在 CoSTseq 文库制备过程中新生 RNA 已被成功分离。测序后的数据质量评估（例如通过读段覆盖情况的可视化检查，以及后续基于自定义 Python 程序的分析）可确保获得足够且丰富的数据用于下游分析。此阶段评估的一些关键指标包括：内含子区域的覆盖度、重复读段百分比、每个核苷酸的测序深度以及平均读段长度。这些指标界定了数据集的分析范围，降低了结果被过度解读的风险。其次，本节介绍了一些潜在的分析方法。例如，鉴于 DMS-MaPseq 可与 CoSTseq 联用，因此可在特定目标基因的某一区域内比较新生 RNA 与成熟 RNA 的 DMS 反应活性谱。RNA 聚合酶延伸过程中的动态 RNA 二级结构可在单核苷酸分辨率下实现可视化。此类分析对于丰度较高的细胞 RNA 分子尤为有效，因其可达到更高的测序深度，例如核糖体 RNA。
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RNA二级结构主要通过结构探针技术在成熟RNA中进行观察。共转录结构追踪测序技术（CoSTseq）将已用于研究聚合酶在新生RNA上位置的核内延伸技术与结构探针技术相结合，从而实现了对处于活跃转录过程中的RNA的二级结构的观测。

新生转录本与成熟转录本的RNA结构比较分析 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

在转录过程中，新生RNA在离开RNA聚合酶（Pols）时即开始碱基配对。这种碱基配对允许形成RNA结构，从而……

我们研究了共转录的RNA加工过程，其中包括新生RNA在从合成它的RNA聚合酶中 emerging 时如何折叠。在本方法出现之前，我们无法监测RNA在合成过程中的折叠情况，这限制了我们的研究进展。因此，这一新方法弥补了这些不足。CoSTseq 技术的开发旨在研究酵母中新生 RNA 的折叠过程。该方法在分析丰度较高的 RNA 时尤为有效。首先，将酿酒酵母菌株 BY4741 接种于 50 毫升 YPAD 培养基中，在 30 摄氏度、200 转/分钟振荡条件下培养，直至菌液达到对数中期。收集约三毫升酵母培养物，其对应的光密度值为1.8个单位，在4°C条件下使用预冷的离心机以2,500 × g离心3分钟。将上清液弃入废液容器中。用10毫升冷的磷酸盐缓冲液重悬沉淀物，并在4°C条件下再次以2,500 × g离心3分钟。去除上清液，将酵母沉淀置于冰上保存。用10毫升预冷的0.5% Sarkosyl小心重悬酵母沉淀，避免产生气泡。将重悬的酵母在冰上孵育20分钟以促进通透化，然后在4°C下以400 × g离心5分钟收集细胞，并用P-1000移液器将通透化的酵母细胞重悬于100微升无核酸酶的水中。制备含有新鲜添加的5毫摩尔二硫苏糖醇的2.5倍转录缓冲液工作液，并将2.5倍结构探针缓冲液预热至30摄氏度。在一支干净的2毫升离心管中，加入所有必需的反应组分并充分混匀。接着，向反应管中加入100微升已制备的酵母细胞，置于设定为30摄氏度、转速为每分钟500转的恒温混匀仪中孵育2分钟。然后迅速加入200 µL预热的2.5X结构探针缓冲液和25 µL二甲基硫酸酯试剂。轻轻涡旋混匀两次，立即将离心管放回设定为30 °C、500 rpm的恒温振荡器中。继续在恒温混匀仪中孵育4分钟，各样本间隔30秒。提前配制终止缓冲液和洗涤缓冲液，并置于冰上预冷备用。向反应管中加入一毫升终止缓冲液，以终止二甲基硫酸酯甲基化反应。随后将经二甲基硫酸酯标记的样品在预冷的离心机中于 3,500 × g 离心五分钟。离心后，将上清液弃入适当的废液容器中。向沉淀中加入1毫升预冷的洗涤缓冲液并重悬。以3,500 × g再次离心5分钟。立即进行RNA提取，不要冷冻酵母沉淀。将二甲基硫酸酯标记的酵母沉淀重悬于600 µL RNA裂解缓冲液中，然后将悬液转移至含有40 µL 20%十二烷基硫酸钠的离心管中。在65 °C下孵育样品30秒，同时以950 rpm振荡。接下来，按照标准操作程序进行RNA的苯酚-氯仿抽提。涡旋振荡链霉亲和素磁珠，并将44 µL磁珠转移至新的离心管中，每管对应80 µg总RNA样品。将磁珠置于磁力架上，直至磁珠完全沉降。去除保存缓冲液后，将磁珠重悬于1毫升预洗缓冲液A中。室温孵育2分钟，然后置于磁力架上分离并弃去上清液。洗涤后，将磁珠重悬于88微升2×结合缓冲液中。取80微升该悬液转移至无菌的1.5毫升离心管中，管中已含有80微克生物素标记的RNA样品溶于80微升溶液中。将珠子样品混合物在室温下于旋转仪上旋转20分钟。然后将离心管置于磁力架上，收集含有成熟RNA的流穿液，并将其保存用于沉淀，以通过DMS-MaPseq工作流程对成熟RNA进行poly-A筛选。接着，用500微升高盐缓冲液将珠子-新生RNA复合物清洗两次。然后用 500 微升 1× 结合缓冲液洗涤一次，再用 500 微升低盐缓冲液进行最终洗涤。现在向磁珠-新生 RNA 复合物中加入 300 微升 RNA 试剂，充分重悬后，在 60 摄氏度的温控混匀仪中孵育 5 分钟。接着加入 60 微升氯仿，涡旋振荡，室温孵育 3 分钟。将样品在预冷的离心机中于 14,000 × g 离心五分钟。最后，将上层水相约 180 微升转移至新的收集管中。弃去剩余的有机相，保留珠粒和残留的水溶液。纯化新生RNA后，进行模板转换逆转录，连接5'接头，并对文库进行测序筛选。在1%琼脂糖凝胶上对PCR产物进行检测，结果显示引物二聚体形成极少，共转录结构追踪测序（CoSTseq）和DMS-MaPseq文库在约300个碱基对处呈现特征性弥散条带。CoSTseq样本1的毛细管电泳图谱证实文库大小分布集中在约285个碱基对处出现峰值。ASC1 mRNA的比对结果显示，CoSTseq文库在内含子区域存在覆盖，证实该RNA为新生RNA；而DMS-MaPseq文库缺乏内含子覆盖，表明该RNA为成熟RNA。18S pre-rRNA的共转录折叠矩阵显示，随着RNA聚合酶在rDNA位点从第790位移动至第811位，DMS反应性呈现出急剧变化。ADH1 mRNA 的 DMS 反应性分析显示，新生形式与成熟形式之间具有相似的图谱，表明存在结构稳定的区域。相比之下，SSA2 mRNA 在新生形式与成熟形式之间表现出不同的 DMS 反应性区域，提示其在成熟过程中发生了结构变化。利用 CoSTseq 技术，研究人员能够确定体内新生 RNA 的二级结构以及 RNA 聚合酶在 RNA 转录本上的位置。CoSTseq 具有时间敏感的步骤，并使用有毒化学品。建议每次处理的样本不超过两个。从 CoSTseq 获得的总 RNA 中，非生物素化的 RNA 可用于结合传统的 DMS-MaPseq 进行成熟结构探针分析。

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了解酿酒酵母中新生与成熟RNA结构的比较分析方法CoSTseq。该技术可同时测定RNA聚合酶位置和碱基配对状态，揭示转录过程中的RNA折叠动态及其成熟过程中的结构变化。

新生转录本与成熟转录本的RNA结构比较分析酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

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