Summary
Bu protokol deneysel nakli amaçlı otolog yaratmanız serum hayvan kullanmadan mezenkimal stromal hücreleri ve endotel koloni oluşturan hücrelerin izolasyonu ve sonraki genişleme açıklamaktadır.
Abstract
Göbek kordonu, mezenkimal stromal hücreler (mezenkimal kök hücreler olarak da adlandırılır, MKH) ve endotel progenitör hücrelerin koloni oluşturan (ECFCs) de dahil olmak üzere yüksek proliferatif potansiyele sahip progenitör hücreler için zengin bir kaynaktır. Her iki hücre tipleri, doku bütünlüğünün korunmasında anahtar oyuncular ve muhtemelen de rejeneratif süreçleri ve tümör oluşumu ilgilidirler.
Biyoloji ve karşılaştırmalı bir şekilde çalışma için aynı vericiden alınan hücreler türleri olması önemlidir. Ayrıca aynı doku MKH ve ECFCs türetmek için rejeneratif amaçlar için faydalı olabilir.
Hücresel terapötikler sonunda Masadan yatağın başucuna kendi yolunu bulmak gerekir çünkü biz, izole etmek için yeni bir yöntem kurulmuş ve daha fazla hayvansal protein kullanmadan progenitör hücrelerin genişletmek. Pooled insan trombosit lizatı (pHPL) fetal sığır serumu tamamen xenogeneic proteinler hücreleri temas önlemek için tüm adımları protokol yerini aldı.
Bu video bir göbek kordonu progenitör hücrelerin izolasyonu ve genişleme için bir metodoloji ortaya koymaktadır.
Tüm malzeme ve usulleri açıklanan olacaktır.
Protocol
Bölüm 1: ayarlama
1. Hücre kültür ortamı hazırlanması
Orta hazırlığı başlamadan önce tüm malzemeleri ve gereken araçlar topluyoruz.
Çözülme 2 toplanmış insan trombosit lizat x 56 ml alikotları (pHPL, kendi kendine: Referans 1 ve Jüpiter # 1523), 100x Penisilin / Streptomisin çözümü, 2 adet 10 ml x 5 ml L-Glutamin (Sigma hem).
EGM-2 orta boy (Lonza) 1 şişe (500 ml) ek için ayarlanan sitokin ve büyüme faktörü alikotları (VEGF, bFGF, EGF, IGF, hidrokortizon, Amfoterisin 'tek quots' olarak askorbik asit, heparin,) Çözülme.
Buzdolabından bir adet 500 ml şişe (i) her minimal temel orta alfa-modifiye (MEM) ve (ii) endotel bazal, orta (KDT).
Aşağıdaki adımları, steril koşullar altında bir laminer akış doku kültürü kaputu yapılmaktadır.
1000 IU / mL steril su ile son bir konsantrasyon toz eriterek, koruyucu içermeyen heparin (örneğin, Biochrom) hazırlayın.
MSC-Orta:
500 mL-MEM kullanın çözülmüş pHPL 56 ml (da daha fazla ayrıntı için 1 referans) ve 2 IU / mL (= 224 ul stok solüsyonu), koruyucu içermeyen Heparin (orta, topaklanma yoluyla koagülasyon önler eklemek plazma fibrinojen)% 10 pHPL bir final konsantrasyonuna ulaşmak için. Ayrıca Penisilin (100U/mL) / Streptomisin (100μg/mL) çözüm ve L-glutamin 2mm (Sigma hem) ekleyin.
20 mikron gözenek boyutu vakum filtresi (Millipore) ile orta Filtresi. (Içerik, tarih) uygun şişe etiketi.
ECFC-Orta:
EBM bir şişe (500 ml) kullanın ekleyin, sitokin alikotları, koruyucu içermeyen Heparin pHPL, 10 IU / ml (= 1120μl stok solüsyonu) 56 mL, Penisilin (100U/mL) / Streptomisin (100 g / ml) solüsyonu ve 20 ul-gözenek boyutu vakum filtresi (Millipore) ile bazal, orta ve filtre L-glutamin 2mm. (Içerik, tarih) uygun şişe etiketi.
2. Cerrahi aletlerin sterilizasyon
Forseps, cerrahi makas ve neşter sahibinin keskin çifti ısı sterilize cevheri steril tek kullanımlık olmalıdır.
3. Kordon koleksiyonu için tüplerin hazırlanması
50 ml polipropilen tüpler (Falcon) ücretsiz heparin ve son hacim 20 ml PBS ile uyum - 500 IU koruyucu ekleyin. Tüpleri teslim odasına aktarın.
4. Aydınlatılmış onam (yerel etik kurul veya IRB tarafından onaylandıktan sonra).
Kablonun bir parça bağış ve yeterli hizmet amaçları onları bilgilendirmek istiyorsanız teslimat için önce anne ve babalar sorabilir.
5. Kordon bağış
Plasenta ve kord teslimat ve teftişin 10 cm bir parça kesti ve hemen kordon damarları içindeki kalan kanın pıhtılaşma önlemek için heparin ile önceden doldurulmuş tüp transferinden sonra. En kısa sürede hücre izolasyonu ile devam edin.
Bölüm 2: Hücre izolasyonu
- Incidin veya% 70 EtOH yüzeylerin temizlenmesi, laminer akış doku kültürü kaputu hazırlayın. Yeri steril 150 cm 2 hücre kültürü tabak, 75 cm hücre kültürü şişeleri (Corning), PBS, steril cerrahi aletler, cep kazıyıcılar, tüp tutucu, 25 ml stripettes ve 5 ml şırınga temizlenir kaputu uygun künt sonunda iğne ile donatılmış.
- Pre-sıcak hazırlanan α-MEM ve EGM-2 hücre kültürü orta 37 ° C su banyosu.
- Doğumhane hücre kültürü kaputu ile donatılmış laboratuvar kablosu getirin. Laminer akım kablosunun aktardıktan sonra, kan hücrelerinin kontamine kurtulmak için (yeni bir plaka transfer) PBS içinde iki kez yıkayın. Umbilikal ven kablosunun diğer ucunu çıkan sıvı kadar PBS ile künt sonunda iğne ile donatılmış steril bir 5 ml'lik şırınga ile bir tarafta canulating sonra durulayın (kırmızımsı kan kontaminasyonu gösterir) tamamen şeffaf hale gelir.
ECFCs:
- 75 cm 2 balonuna (Corning) hazırlayın, etiket ve önceden ısıtılmış EGM-2 orta 15-20 ml doldurun.
- Kablosu steril PBS ile dolu yeni bir tabak içine yerleştirin.
Cerrahi makas alın ve yaklaşık 5 cm uzunluğunda iki adet (göbek damarları kendi ekseni boyunca bükülmüş, çünkü kısa parçalar, süreci daha kolay) içine göbek kordonu kesmek. - Umbilikal ven (büyük damar) bulmaya çalışın cerrahi makas, bir bıçak yerleştirin ve uzunlamasına damar kesmek. Bu noktada daha engellerken, bir asistan, iki forseps ile zaten kesilmiş damar tutabilir yararlı olabilir.
- Kord pasta yerleştirin.ce PBS olmadan yeni plaka kesme damar, hücre kazıyıcı ve bir ucundan diğer rubbings umbilikal ven iç (endotel) yüzey kazıma alır. Orta sıyırıcı ucu temizleme hazırlanmış balona hücrelere aktarın. Bu işlem en az 10 kez tekrarlayın.
- Şişeyi kapatın ve içine koymak, bir kuluçka makinesi (37 ° C,% 5 CO 2,% 95 nem) .
MKH:
- 150 cm 2 kültür plakasına (Corning) hazırlayın ve etiket.
- (Endotel tabakası kazıyarak sonra) kablosunun parça alın ve steril makas ve steril bistüri ile çok küçük parçalar halinde tüm kablosunu kesip. Kord adet maksimum boyutu 1-2 mm olmalıdır.
- Önceden etiketli kültür plakasına steril forseps ile kordon adet aktarın. Plaka orta ile doldurmadan önce 5 dakika boyunca açık bırakarak, plastik yüzey adet ek güçlendirilmiştir.
- Kord adet plastik uygun bağlandıktan sonra, yavaşça 30-35 ml MEM değiştirilmiş önceden ısıtılmış alfa ekleyin. Tüm parçaları takılı kalması emin olmak için en düşük hızda kullanmayı deneyin.
- Tabak kapatın ve içine koymak, bir kuluçka makinesi (37 ° C,% 5 CO 2,% 95 nem) .
Bölüm 3: Hücre genişlemesi ve flow sitometri ile bağışıklık-fenotip onay
Hücre Genişleme
EFCFs:
- Ters bir mikroskop ve döviz endotelyal hücrelerin ek bir sonraki gün kontrol edin bütün EGM-2 bağlı olmayan tüm hücreleri ve parçacıkların kurtulmak için orta.
- Orta izdiham ve döviz üçte biri haftada iki kez kadar hücreleri genişletin. Izdiham ulaşıldığında,% 0.05 'Trypsin/0.7 mM EDTA hücreleri ayırmak ve yeni bir kültür gemilere aktarmak. Sizin T75 şişesinin içinde hücrelerinin sayısına bağlı olarak, daha da genişlemesi için düşük ekim yoğunluğu garanti altına almak için yeni şişeler sayı ve büyüklüğü seçmelisiniz.
- Exchange üçte biri haftada iki kez hücrelerinin genişlemesi sırasında orta.
MKH:
- Kabloyu MKH akıbet daha fazla zaman alacaktır, bu yüzden bağlı doku parçaları çevrede iğ şekilli hücreler görünüm için ters bir mikroskop kadar en az 3-4 gün bekleyebilir. Yeterli hücre dışı büyüme olduğunda, adet plastik ile temas kaybı nedeniyle ayırmak için eğilimindedir.
- 10-12 gün doku parçaları kaldırdıktan sonra,% 0.05 'Trypsin/0.7 mM EDTA ile plastik MKH ayırmak ve yeni bir kültür damarlarının aktarabilirsiniz. Plağındaki hücrelerinin miktarına bağlı olarak daha da genişlemesi için düşük ekim yoğunluğu garanti altına almak için yeni şişe büyüklüğü ve sayısına karar.
- Exchange üçte biri haftada iki kez hücrelerinin genişlemesi sırasında orta.
Flow sitometri
Gerekli ekipman:
Akış sitometresi (BD FACSCalibur), mikronik tüpleri (Corning), tüp tutucu, koyun serum (reaktif engelleme), Eppifuge (Eppendorf), monoklonal antikorlar
MKH: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD73, CD90, CD105, izotip kontrol
ECFCs: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD34, CD90, CD105, CD144, CD146, izotip kontrol
- Izdiham ulaştıktan sonra, 4 dk 7 300g 0.05% Trypsin/0.7 mM EDTA ve santrifüj hücre ayırmak ° C
- Modifiye PBS ve% 10, 4 dakika 20 v / v koyun serum ° C blok belirsiz antikor bağlanma 1x10 6 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon hücreleri yeniden süspanse
- Etiket mikronik tüpleri ve floresan etiketli antikorlar uygun konsantrasyonda ekleyin.
- Her bir tüp hücre süspansiyonu (bloke) 50 ul ekleyin ve 30 dakika boyunca inkübe 4 ° C
- Bağlayıcı olmayan antikorlar kaldırmak için modifiye PBS ekleyerek hücrelerin yıkayın.
- Akış sitometresinin etiketli hücre ile gidin ve analiz yapmak.
Bölüm 4: ECFC koloni büyüme, fiksasyon, boyama ve hiyerarşi analizi
- Tohum santimetre kare başına 3 veya 10 hücre hücre kültürü plakaları çok düşük kaplama yoğunluğu neredeyse saf hasat ECFCs tek koloni büyümesi için izin vermek.
- Exchange üçte biri haftada iki kez orta.
- 14 gün (kültür sonu) orta kaldırdıktan sonra, PBS ile iki kez yıkayın ve buz gibi fiksasyon çözüm (Aseton 2: Metanol = 3) koloniler düzeltmek buzdolabında 15 dakika boyunca.
- Fiksasyon çözüm atın ve plakalar 10 dakika kuruması için açık bırakın.
- Distile su ile 10 dakika hücreleri rehidrate.
- Harris hematoksilen çözeltisi ekleyin ve 12 dakika boyunca sabit koloniler leke.
- H matoxylin çözüm çıkarın ve kalan boyama çözüm kurtulmak için musluk suyu ile plakalar durulayın.
- Her koloninin fotoğraflar çekinstereomikroskopta ve ithalat kullanarak *. jpg veya bilgisayarınıza *. tif formatındaki dosyalar.
- ImageJ yazılımı ile fotoğrafları açın ve animasyon açıklandığı gibi her koloninin doğru hücre sayısı analiz.
- ImageJ yazılımını açın ve menü aşağı çekme 'Dosya \ Open' fonksiyonunu kullanarak bir koloni resmi ithalat.
- Fonksiyonu '\ çıkart Arkaplan Süreci' ile devam edin
- Koloni marjı işaretlemek için ImageJ menüsünde '* eliptik veya fırça seçimi' işlevini kullanın.
- 'Düzenle \ Clear dışında' fonksiyonu ve kırpma '\ kırpma' seçilerek resmi kullanarak, çevredeki görüntü temizleyin.
- Kullanarak elle ayarlayabilirsiniz.Özellik 'Resim \ \ Eşik ayarlayın' tüm hücreleri tamamen kırmızı renkli, böylece fonksiyonu.
- "Analyze \ analiz Parçacıklar 'seçerek koloni hücre sayısını saymak. Uygun ayarları (her bir hücre tipi için optimize) seçin ve 'OK' i seçin. Hücre sayımı ve sayılan hücrelerin karşılık gelen ana hatlarını içeren bir yeni görüntü de dahil olmak üzere sonuçları kutusunda görünecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kemik iliği, yağ dokusu, kordon kanı, vb de dahil olmak üzere MKH veya ECFCs almak için çeşitli kaynaklardan vardır
Bu doku ve damar yenilenme veya tümör progresyonu katkı gibi süreçlerde farklı hücre tiplerinin doğrudan katılımını karşılaştırmak için aynı kaynaktan atalarıdır iki türlü elde etmek için gereklidir.
Izole etmek ve daha sonra aynı donörden ECFCs ve MKH otolog çiftleri çalışma kolaylığı olan bu yöntem bireysel deneyler içinde donör varyasyonlar hariç için avantajlı yapar.
Hematopoietik hücreler ile olası kontaminasyonu en aza indirilmeli ve bir Pasajlanması adım flow sitometri ile doğrulandı.
Eğer doğru yapılırsa, izole hücreler (i) progenitör hücrelerin payı özellikleri, (ii) deneysel nakli için yeterli miktarda olmalıdır ve (iii) flow sitometri tarafından onaylandıktan gibi saf olması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, herhangi bir mali çatışmalar faiz beyan etmek zorunda değilsiniz.
Acknowledgments
Yazarlar yazının yararlı yorumlar, Daniela Thaler ve Margaretha Fr hwirth teknik yardım için, dil düzenleme için Monica Farrell, Uwe Lang, Margit Holzapfel ve Kadın Hastalıkları Bölümü Sandra Eppich pHPL, Eva Rohde ve Nicole Hofmann sağlamak için Katharina Schallmoser teşekkür Kabloları sağlamak için.
Bu çalışma, Avusturya Araştırma Vakfı (FWF, DS hibe N211-NAN), Avusturya Araştırma Promosyon Ajansı (FFG, hibe N200 DS) ve Yetişkin Kök Hücre Araştırma Vakfı (AR) tarafından desteklenmiştir. AR doktora programı Graz Üniversitesi Tıp Fakültesi Moleküler Tıp üyesidir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alpha modified MEM | Sigma-Aldrich | ||
| L-GLutamin | Sigma-Aldrich | ||
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | ||
| EBM | Lonza Inc. | ||
| Single cytokine quots | Lonza Inc. | ||
| 75 cm2 flasks | Corning | ||
| 150 cm2 plates | Corning | ||
| Cell scraper | Corning | ||
| Trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| Monoclonal antibodies | BD Biosciences | ||
| PBS | |||
| 50 ml tubes | Falcon BD | ||
| 500 mL filter 20 μm pore size | EMD Millipore | ||
| Preservative free heparin | Biochrom AG |
References
- Schallmoser, K. Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells. Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).
- Reinisch, A. Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application. Regen Med. 2, 371-382 (2007).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. 113, 6716-6725 (2009).
- Strunk, D. Phenotypic characterization and preclinical production of human lineage-negative cells for regenerative stem cell therapy. Transfusion. 45, 315-326 (2005).
