Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und anschließende Expansion von mesenchymalen Stromazellen und Endothelzellen Kolonie-bildenden Zellen, ohne die Verwendung von tierischen Serum autologen Paare für experimentelle Zwecke der Transplantation zu generieren.
Abstract
Die Nabelschnur ist eine reiche Quelle für Stammzellen mit hoher proliferative Potenzial, einschließlich mesenchymale Stromazellen (auch als mesenchymale Stammzellen, MSCs) und Endothelzellen koloniebildenden Progenitorzellen (ECFCs). Beide Zelltypen sind wichtige Akteure bei der Aufrechterhaltung der Integrität des Gewebes und sind wahrscheinlich auch in regenerative Prozesse und Tumorbildung beteiligt.
Zur Untersuchung ihrer Biologie und Funktion in einer vergleichenden Weise ist es wichtig, beide Zelltypen Verfügung vom gleichen Spender haben. Es kann auch nützlich sein für regenerative Zwecke abzuleiten MSCs und ECFCs aus dem gleichen Gewebe.
Da zelluläre Therapeutika schließlich finden sollten ihren Weg vom Labor zum Krankenbett haben wir eine neue Methode zur Isolierung und weiter ausbauen Vorläuferzellen ohne die Verwendung von tierischem Eiweiß. Pooled menschlichen Thrombozyten-Lysat (PHPL) ersetzt Rinderfötenserum in alle Schritte unseres Protokolls vollständig vermeiden Sie den Kontakt der Zellen an xenogenen Proteinen.
Dieses Video zeigt eine Methodik für die Isolierung und Expansion von Vorläuferzellen aus einer Nabelschnur.
Alle Materialien und Verfahren beschrieben werden.
Protocol
Teil 1: Einrichten
1. Vorbereitung von Zellkulturmedium
Vor dem Start des Mediums Vorbereitung sammeln alle Materialien und Werkzeuge, die Sie benötigen.
Thaw 2 x 56 ml Aliquots von gepoolten menschlichen Thrombozyten-Lysat (PHPL, self-made: Referenz 1 & JoVE # 1523), 10 ml einer 100x Penicillin / Streptomycin-Lösung, 2 x 5 ml L-Glutamin (beide Sigma).
Auftauen Zytokin-und Wachstumsfaktor Aliquots (VEGF, bFGF, EGF, IGF, Hydrocortison, Ascorbinsäure, Heparin, Amphotericin als "einzigen quots 'versehen) zur Ergänzung 1 Flasche (500 ml) von EGM-2 Medium (Lonza) eingestellt.
Aus dem Kühlschrank nehmen Sie eine 500 ml Flasche jeweils (i) alpha-modifizierte minimal essential medium (a-MEM) und (ii) endothelial Basalmedium (EBM).
Alle folgenden Schritte werden in einer laminaren Strömung Gewebekultur Haube unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
Bereiten Sie frei von Konservierungsmitteln Heparin (zB Biochrom) durch Auflösen des Pulvers zu einer endgültigen Konzentration von 1000 IU / mL mit sterilem Wasser.
MSC-Medium:
Verwenden Sie 500 ml a-MEM, fügen Sie 56 ml des aufgetauten PHPL (siehe auch Hinweis 1 für weitere Details) und 2 IU / mL (= 224 ul der Stammlösung) der frei von Konservierungsmitteln Heparin (verhindert Koagulation des Mediums durch Verklumpung der das Fibrinogen im Plasma), um eine endgültige Konzentration von 10% PHPL. Zusätzlich fügen Penicillin (100U/mL) / Streptomycin (100μg/mL)-Lösung und 2 mM L-Glutamin (beide Sigma).
Filter das Medium, durch ein 20 um-Porengröße Vakuum-Filter (Millipore). Beschriften Sie die Flasche entsprechend (Inhalt, Datum).
ECFC-Medium:
Verwenden Sie eine Flasche (500 ml) von EBM, fügen Sie die Zytokin-Aliquots, 56 ml PHPL, 10 IU / ml (= 1120μl Stammlösung) der frei von Konservierungsmitteln Heparin, Penicillin (100U/mL) / Streptomycin (100 g / ml)-Lösung und 2 mM L-Glutamin, die Basalmedium und Filter mit 20 ul-Porengröße Vakuum-Filter (Millipore). Beschriften Sie die Flasche entsprechend (Inhalt, Datum).
2. Sterilisation von chirurgischen Instrumenten
Pinzetten, scharfen Paar der chirurgischen Schere und Skalpell Inhaber muss Hitze sterilisiert Erz sterile Einmalprodukte werden.
3. Vorbereitung von Rohren für Kabel-Sammlung
Add 500 IU Konservierungsmittel - free Heparin auf 50 ml Polypropylen-Röhrchen (Falcon) und passen Sie auf ein Endvolumen von 20 mL mit PBS. Übertragen Sie die Rohre in den Kreißsaal.
4. Informed Consent (bestätigt durch Ihren örtlichen Ethikkommission oder IRB).
Bitten Sie die Eltern vor der Auslieferung, wenn sie möchten ein Stück von der Schnur zu spenden und angemessen informieren sie über den Zweck es dienen soll.
5. Cord Spende
Nach der Lieferung und Kontrolle der Plazenta und Schnur schnitt ein 10 cm Stück und sofort übertragen, um Ihre Rohr mit Heparin vorgefüllte zu einer Koagulation des Blutes im übrigen die Schnur Gefäße zu vermeiden. Fahren Sie mit Zellisolation so schnell wie möglich.
Teil 2: Zellisolierung
- Bereiten Laminar-Flow-Gewebekultur Haube von Oberflächen mit Incidin oder 70% EtOH. Legen Sie sterile 150 cm 2 Zellkultur-Platten, 75 cm Zellkulturflaschen (beide Corning), PBS, sterilisiert chirurgische Instrumente, Zell-Schaber, Rohrhalter, 25 mL stripettes und 5 ml Spritzen mit stumpfen Ende Nadeln entsprechend in Ihrem gereinigt Kapuze ausgestattet.
- Pre-warm Ihre vorbereiteten α-MEM und EGM-2 Zellkulturmedium auf 37 ° C in einem Wasserbad.
- Bringen Sie das Kabel aus dem Kreißsaal in Ihrem Labor mit der Zellkultur Kapuze ausgestattet. Nach dem Übertragen der Schnur in der laminaren Strömung waschen Sie es zweimal in PBS (durch die Übertragung auf eine neue Platte) loswerden kontaminierender Blutzellen. Spülen Sie die Nabelvene nach canulating es auf der einen Seite mit einer sterilen 5 ml Spritze mit einer stumpfen Ende Nadel mit PBS, bis die Flüssigkeit aus dem anderen Ende des Kabels ausgestattet wird komplett transparent (rötlich zeigt Kontamination mit Blut).
ECFCs:
- Bereiten Sie eine 75 cm 2-Kolben (Corning), beschriften Sie sie und füllen Sie in 15-20 ml vorgewärmten EGM-2 Medium.
- Stecken Sie das Kabel in eine neue Platte mit sterilem PBS gefüllt.
Nehmen Sie die chirurgische Schere und schnitt die Nabelschnur in zwei Stücke von ca. 5 cm in der Länge (kurze Stücke sind leichter zu verarbeiten, weil die Nabelgefässe entlang ihrer Achse verdreht sind). - Versuchen Sie, die Nabelvene (großes Schiff) finden, legen Sie ein Blatt des chirurgischen Schere und schnitt die Vene in Längsrichtung. An diesem Punkt könnte es hilfreich sein, wenn ein Assistent die bereits aufgeschnittenen Vene mit zwei Zangen halten können, während Sie weiter zu senken.
- Stecken Sie das Kabel piece mit der aufgeschnittenen Vene in eine neue Platte ohne PBS, nehmen Sie die Zellschaber und kratzen der inneren (Endothelzellen) Oberfläche der Nabelschnur durch Abreibungen von einem Ende zum anderen. Übertragen Sie die Zellen, um Ihre vorbereiteten Kolben durch die Reinigung der Spitze des Kratzers in das Medium. Wiederholen Sie diese Prozedur mindestens 10 mal.
- Schließen Sie die Flasche und steckte es in einen Inkubator (37 ° C, 5% CO 2, 95% Luftfeuchtigkeit).
MSCs:
- Bereiten Sie eine 150 cm 2 Kultur (Corning) und beschriften Sie sie.
- Nehmen Sie das Stück Schnur (nach Abschaben der Endothelschicht) und schneiden das ganze Kabel in sehr kleine Stücke mit einer sterilen Schere und sterilen Skalpell. Maximale Größe des Kabels Stücke sollten 1-2 mm sein.
- Übertragen Sie Ihre Schnur Stücke mit der sterilen Pinzette in das pre-markierten Kultur Platte. Indem Sie die Platte für 5 Minuten vor dem Befüllen mit Medium öffnen, wird die Anlage der Stücke auf der Kunststoffoberfläche gestärkt.
- Sobald die Schnur Stücke angemessen auf die Kunststoff verbunden sind, sanft in 30-35 ml vorgewärmten alpha geändert MEM hinzuzufügen. Versuchen Sie, die niedrigste Geschwindigkeit nutzen, um sicherzustellen, dass alle Stücke verbunden bleiben.
- Schließen Sie die Platte und lege sie in einen Inkubator (37 ° C, 5% CO 2, 95% Luftfeuchtigkeit).
Teil 3: Cell Expansion und Bestätigung der Immun-Phänotyp mittels Durchflusszytometrie
Zell-Expansion
EFCFs:
- Überprüfen Sie die Befestigung der Endothelzellen am nächsten Tag auf einem inversen Mikroskop und Austausch ganze EGM-2 Medium, um loszuwerden, alle nicht-anhaftenden Zellen und Partikeln.
- Erweitern Sie die Zellen bis zur Mündung und zum Austausch ein Drittel des Mediums zweimal pro Woche. Wenn Konfluenz erreicht ist, lösen die Zellen mit 0,05% Trypsin/0.7 mM EDTA und sie auf neue Kulturgefäße. Abhängig von der Anzahl der Zellen innerhalb Ihres T75 Kolben, sollten Sie die Größe und Anzahl der neuen Flaschen zu niedrigen Aussaatdichte für die weitere Expansion zu gewährleisten.
- Börse ein Drittel des Mediums zweimal in der Woche während der Expansion der Zellen.
MSCs:
- Der Auswuchs von MSCs aus der Nabelschnur wird länger dauern, so können Sie warten mindestens 3-4 Tage, bis Sie überprüfen, auf einem inversen Mikroskop für das Auftreten von spindelförmigen Zellen in der Umgebung des angeschlossenen Gewebestücke. Wenn es genügend Zellen aus-Wachstum, neigen die Stücke zu trennen, weil sie Kontakt mit dem Kunststoff zu verlieren.
- Nach 10-12 Tagen entfernen Sie die Gewebestücke, nehmen Sie den MSCs aus dem Kunststoff mit 0,05% Trypsin/0.7 mM EDTA und sie auf neue Kulturgefäße. Je nach der Menge der Zellen in Ihrem Teller sollten Sie die Größe und Anzahl der neuen Flaschen entscheiden, niedrige Aussaatdichte für die weitere Expansion zu gewährleisten.
- Börse ein Drittel des Mediums zweimal in der Woche während der Expansion der Zellen.
Durchflusszytometrie
Benötigte Ausrüstung:
Durchflusszytometer (BD FACSCalibur), Micronic Röhrchen (Corning), Rohrhalter, Schaf-Serum (Blockierungsreagenz), Eppifuge (Eppendorf), monoklonale Antikörper
MSCs: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD73, CD90, CD105, Isotypkontrollen
ECFCs: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD34, CD90, CD105, CD144, CD146, Isotypkontrollen
- Nach Erreichen der Konfluenz, trennen Sie die Zelle mit 0,05% Trypsin/0.7 mM EDTA und Zentrifuge bei 300g für 7 min bei 4 ° C.
- Resuspendieren der Zellen in einer Konzentration von 1x10 6 Zellen / ml in modifizierter PBS und blockieren unspezifische Bindung des Antikörpers mit 10% v / v Schafserum für 20 min bei 4 ° C.
- Beschriften Sie die Micronic Röhrchen und fügen Sie die entsprechende Konzentration der fluoreszenzmarkierten Antikörpern.
- Dann werden 50 ul Zellsuspension (gesperrt) in jedes Röhrchen pipettieren und 30 min bei 4 ° C.
- Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von modifizierten PBS, um nicht-bindende Antikörper zu entfernen.
- Gehen Sie mit Ihrem markierten Zelle auf die Durchflusszytometer und führen Sie die Analyse.
Teil 4: ECFC Koloniewachstum, Fixierung, Färbung und Hierarchie-Analyse
- Seed das praktisch reine geerntet ECFCs bei sehr niedrigen Plattierungsdichte von 3 oder 10 Zellen pro Quadratzentimeter in Zellkultur-Platten für einzelne Kolonie Wachstum zu ermöglichen.
- Börse ein Drittel des Mediums zweimal pro Woche.
- Nach 14 Tagen (Ende der Kultur) zu entfernen Medium, zweimal waschen mit PBS und fixieren den Kolonien mit eiskaltem Fixierung Lösung (Aceton: Methanol = 3: 2) für 15 Minuten in den Kühlschrank stellen.
- Entsorgen Sie die Fixierung Lösung und lassen die Platten offen für 10 Minuten trocknen lassen.
- Rehydrieren die Zellen mit destilliertem Wasser für 10 Minuten.
- Add Harris Hämatoxylin-Lösung und färben die feste Kolonien für 12 Minuten.
- Entfernen H matoxylin und spülen Sie die Platten mit Leitungswasser, um loszuwerden, die restlichen Färbelösung.
- Machen Sie Fotos von jeder Kolonie vonmit einem Stereomikroskop und Import *. jpg oder *. tif-Format-Dateien auf Ihrem Computer.
- Öffnen Sie die Fotos mit ImageJ-Software und zu analysieren, die genaue Zellzahl jeder Kolonie wie in der Animation beschrieben.
- Öffnen Sie die ImageJ-Software und importieren Sie eine Kolonie Bild mit dem "File \ Open"-Funktion in dem Pulldown-Menü.
- Fahren Sie mit dem "Process \ Subtract Background"-Funktion
- Verwenden Sie die '* * elliptische oder Pinsel Auswahl "-Funktion in der ImageJ Menü, um die Kolonie-Marge zu markieren.
- Deaktivieren Sie das umgebende Bild mit dem "Bearbeiten \ Klare Outside"-Funktion und beschneiden Sie das Bild, indem Sie 'Bild \ Crop'.
- Stellen Sie die Schwelle manuell mit Hilfe der 'Bild \ Stellen \ Threshold "-Funktion, so dass alle Zellen vollständig sind rot gefärbt.
- Zählen Sie die Zellzahl der Kolonie, indem Sie 'Analyze \ Analyze Particles ". Wählen Sie die entsprechenden Einstellungen (optimiert für jeden Zelltyp) und wählen Sie 'OK'. Die Ergebnisse Box, einschließlich Zellzahl und ein neues Bild mit den entsprechenden Konturen der gezählten Zellen erscheint.
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Discussion
Es gibt eine Vielzahl von Quellen, aus denen MSCs oder ECFCs einschließlich Knochenmark, Fettgewebe, Nabelschnurblut, etc. zu bekommen, um
Es ist notwendig, um beide Arten von Vorläuferzellen aus der gleichen Quelle direkt miteinander zu vergleichen die Beteiligung der verschiedenen Zelltypen in Prozesse wie Gewebe-und Gefäß Regeneration oder Beitrag zur Tumorprogression.
Die Leichtigkeit, mit der zu isolieren und anschließend studieren autologen Paare ECFCs und MSCs vom selben Spender macht diese Methode von Vorteil für den Ausschluss der Spender Schwankungen innerhalb der einzelnen Experimente.
Mögliche Kontamination mit hämatopoetischen Zellen wird durch eine Passage Schritt minimiert und bestätigt mit der Durchflusszytometrie.
Wenn es richtig gemacht, sollten die isolierten Zellen (i) die Aufteilung der Funktionen von Vorläuferzellen, (ii) zur Verfügung stehen experimentelle Transplantation in ausreichenden Mengen und (iii) rein sein wie mittels Durchflusszytometrie bestätigt.
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Disclosures
Die Autoren haben keine finanziellen Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich Katharina Schallmoser für die Bereitstellung PHPL, Eva Rohde und Nicole Hofmann für hilfreiche Kommentare zum Manuskript, Daniela Thaler und Margaretha Fr hwirth für die technische Unterstützung, Monica Farrell für die sprachliche Bearbeitung, Uwe Lang, Margit Holzapfel und Sandra Eppich am Institut für Geburtshilfe für die Bereitstellung der Leitungen.
Diese Arbeit wurde von der Austrian Research Foundation (FWF, gewähren N211-NAN zu DS), der Österreichischen Forschungsförderungsgesellschaft (FFG, gewähren N200 zum DS) und The Adult Stem Cell Research Foundation (AR) unterstützt worden. AR ist ein Fellow des PhD-Programm Molecular Medicine der Medizinischen Universität Graz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alpha modified MEM | Sigma-Aldrich | ||
| L-GLutamin | Sigma-Aldrich | ||
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | ||
| EBM | Lonza Inc. | ||
| Single cytokine quots | Lonza Inc. | ||
| 75 cm2 flasks | Corning | ||
| 150 cm2 plates | Corning | ||
| Cell scraper | Corning | ||
| Trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| Monoclonal antibodies | BD Biosciences | ||
| PBS | |||
| 50 ml tubes | Falcon BD | ||
| 500 mL filter 20 μm pore size | EMD Millipore | ||
| Preservative free heparin | Biochrom AG |
References
- Schallmoser, K. Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells. Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).
- Reinisch, A. Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application. Regen Med. 2, 371-382 (2007).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. 113, 6716-6725 (2009).
- Strunk, D. Phenotypic characterization and preclinical production of human lineage-negative cells for regenerative stem cell therapy. Transfusion. 45, 315-326 (2005).
