Summary
このプロトコルは、間葉系幹細胞および実験的移植の目的のために自己のペアを生成するために動物血清を使用することなく、内皮コロニー形成細胞の分離とその後の展開について説明します。
Abstract
へその緒は、間葉系幹細胞（とも呼ばれる間葉系幹細胞は、MSC）および内皮コロニー形成前駆細胞（ECFCs）を含む、高い増殖能を持つ前駆細胞の豊富な情報源となります。両方の細胞型は、組織の整合性を維持するためのキープレーヤーであり、おそらくまた、再生のプロセスと腫瘍形成に関与している。
比較的にそれらの生物学と機能を研究するためには、同じドナーから入手可能な両方の細胞型を持つことが重要です。また、同じ組織からのMSCsとECFCsを導出するために再生目的のために有益であるかもしれません。
細胞治療は、最終的にベンチからベッドサイドへの道を見つける必要があるので我々は分離する新しい方法を確立し、さらに動物性タンパク質を使用せずに前駆細胞を展開します。プールされたヒト血小板溶解液（pHPLは）完全に異種蛋白質への細胞の接触を避けるために、我々のプロトコルのすべての段階においてウシ胎児血清を取り替えた。
このビデオ一臍帯からの前駆細胞の分離と拡大のための方法論を示しています。
すべての材料および手順について説明する。
Protocol
パート1：セットアップ
1。細胞培養培地の調製
メディアの準備を開始する前に、必要なすべての材料や道具を集める。
雪解け2 ×プールしたヒト血小板溶解液の56 mlのアリコート（pHPL、自作：リファレンス1＆Joveの＃1523）、100倍ペニシリン/ストレプトマイシン液、L -グルタミンの2 × 5mLの（両方ともSigma社）を10ml。
EGM - 2培地（ロンザ）の1瓶（500 mL）を補足するために調整（、アムホテリシンは"単一のquots"として提供されているVEGF、bFGFは、EGF、IGF、ヒドロコルチゾン、アスコルビン酸、ヘパリン）サイトカインと成長因子のアリコートを解凍。
冷蔵庫からの各（i）1つ500mlボトルを取る最小必須培地（α- MEM）および（ii）内皮基礎培地（EBM）のα-改変。
次の手順のすべては、無菌条件下で層流の組織培養フードで実行されます。
滅菌水で1000 IU / mlの最終濃度に粉末を溶解することにより防腐剤フリーヘパリン（例えば、Biochrom）準備。
MSC -ミディアム：
、- MEMの500mlを使用してください（詳細は1を参照することも参照）融解pHPL 56 mLを加え、防腐剤フリーのヘパリンの2 IU / mLの（ストック溶液の= 224μL）が（の凝集によって培地の凝固を避けることができます10％のpHPLの最終濃度になるように血漿中のフィブリノゲン）。また、ペニシリン（100U/mL）/ストレプトマイシン（100μg/mL）ソリューションとL -グルタミンの2mMの（両方ともSigma社）を追加します。
20μmの孔径真空フィルター（ミリポア）を介してメディアをフィルタします。 （内容、日付）を適切にボトルにラベルを付けます。
ECFC -ミディアム：
サイトカイン - アリコート、防腐剤フリーヘパリンのpHPL、10 IU / mlの（ストック溶液の=1120μl）の56 mLを、ペニシリン（100U/mL）/ストレプトマイシン（100を追加し、EBMの一瓶（500 mL）を使用してG / 20μlの細孔サイズの真空フィルター（ミリポア社）で基礎培地とフィルタへのL -グルタミンの添加）ソリューションおよび2mM。 （内容、日付）を適切にボトルにラベルを付けます。
2。手術器具の滅菌
鉗子、外科用ハサミやメスホルダーの鋭いペアは、乾熱滅菌鉱石無菌使い捨てにする必要があります。
3。コードのコレクションのためのチューブの準備
50 mlのポリプロピレンチューブ（ファルコン）に無料のヘパリンとPBSで20mLの最終的な音量に調節する - 防腐剤500 IUを追加。分娩室にチューブを移す。
4。インフォームドコンセント（最寄りの倫理委員会またはIRBで確認）。
彼らはコードの一部を寄付し、十分にそれがサービスを提供する目的を通知したい場合は、配信前に親を求める。
5。コードの寄贈
胎盤と臍帯の配信と検査後10 cmの部分を切断してすぐに脊髄血管内に残った血液の凝固を避けるために、ヘパリンであらかじめ入力してチューブに移す。できるだけ早く、細胞分離の処理を進める。
パート2：セルの分離
- Incidinまたは70％エタノールで表面を洗浄により、層流の組織培養フードを準備します。場所滅菌150センチメートル2細胞培養プレート、75センチの細胞培養フラスコ（コーニングの両方）、PBSは、手術器具、セルスクレーパー、チューブホルダー、25 mLのstripettesとクリーニングフードで適切に平滑末端の針を備えた5 mLシリンジを滅菌。
- 37〜プレ暖かいご準備α- MEMとEGM - 2細胞培養培地℃の水浴インチ
- 分娩室からの細胞培養のフードを装備してラボにコードをもたらす。層流中にコードを転送した後汚染血液細胞を取り除くために（新しいプレートに移すこと）PBSで2回洗ってください。コードのもう一方の端を出てくる液体が（赤は血液の汚染を示す）完全に透明になるまでPBSで平滑末端針を装備した滅菌5mLをシリンジで一方の側にそれをcanulating後に臍静脈をすすぎます。
ECFCs：
- 75センチメートル2フラスコ（コーニング）を準備し、それにラベルを付け、予め温めておいたEGM - 2培地の15〜20 mLで埋める。
- 滅菌PBSで満たされた新しいプレートに電源コードを置きます。
外科はさみを取り、長さが約5cm（臍血管がその軸に沿ってねじれているので、短い作品は、処理しやすい）の2つの部分に臍帯を切る。 - 臍静脈（大血管）を見つけることを試みる、あなたの外科はさみいずれかのブレードを挿入し、縦方向に静脈をカット。あなたがさらにカットしながらアシスタント二つ鉗子で既にカット静脈を保持できる場合は、この時点で、それが有用である可能性があります。
- コードのパイを配置PBSのない新たなプレートのカット静脈とCEは、端から端まで拓本によって臍静脈の内側（内皮）表面のセルスクレイパーとこすりしてください。培地中のスクレーパーの先端を清掃して、準備したフラスコに細胞を移す。この手順を少なくとも10回を繰り返します。
- あなたのフラスコを閉じ、インキュベーター（37℃、5％CO 2、湿度95％）に入れて。
MSCは：
- 150センチメートル2培養プレート（コーニング）を準備してラベルを付ける。
- コードの一部を（内皮層を掻き後）に乗り、滅菌済みのハサミと滅菌メスを使用すると、非常に小さな部分に全体のコードを切断。コード片の最大サイズは1〜2 mmでなければなりません。
- お使いの事前標識培養プレートに滅菌ピンセットを使用してコードの部分を転送する。プレート培地で一杯にする前に5分間開いておくことで、プラスチック表面へ片の付着が強化される。
- コード片をプラスチックに適切に接続したら、静かにMEMを修正予め温めておいたアルファの30〜35 mLを加える。すべてのピースが接続されたままであることを確認するために最低速度を使用するようにしてください。
- プレートを閉じて、インキュベーター（37℃、5％CO 2、湿度95％）に入れて。
パート3：セルの拡張とフローサイトメトリーによる免疫表現型の確認
セルの拡張
EFCFs：
- すべての非接着細胞や粒子を取り除くために全体EGM - 2培地を倒立顕微鏡で、内皮細胞の付着翌日を確認し、交換。
- 週二回合流し、交換するまで培地の3分の1をセルを展開します。コンフルエンスに達したときに、0.05％Trypsin/0.7 mMのEDTAで細胞を切り離し、新しい培養容器に移す。あなたのT75フラスコ内の細胞の数に応じて、さらなる拡大のための低播種密度を保証するために、新しいフラスコの大きさと数を選択してください。
- 細胞の拡大時に培地の交換を3分の1週二回。
MSCは：
- コードからのMSCsの伸長は、多くの時間がかかりますので、添付された組織片の周囲に紡錘形細胞の出現のために倒立顕微鏡で確認するまでは、少なくとも3-4日を待つことができます。十分な細胞外増殖がある場合には、作品は、プラスチックとの接触を失うので、デタッチする傾向がある。
- 10-12日は、組織片を除去した後、0.05％Trypsin/0.7 mMのEDTAでプラスチックからMSCSを切り離し、新しい培養容器に移す。お皿の中で細胞の量に応じて、さらなる拡大のための低播種密度を保証するために、新しいフラスコの大きさと数を決定する必要があります。
- 細胞の拡大時に培地の交換を3分の1週二回。
フローサイトメトリー
必要な部品：
フローサイトメーター（BD FACSキャリバー）、micronicチューブ（コーニング）、チューブホルダー、ヒツジ血清（ブロッキング試薬）、Eppifuge（エッペンドルフ）、モノクローナル抗体
MSCは：CD45、CD14、CD19、HLA - DR、CD31、CD73、CD90、CD105、アイソタイプコントロール
ECFCs：CD45、CD14、CD19、HLA - DR、CD31、CD34、CD90、CD105、CD144、CD146、アイソタイプコントロール
- コンフルエントに達した後、4℃で7分間℃で300グラム0.05％Trypsin/0.7 mM EDTAおよび遠心機で細胞を切り離す
- 変更されたPBSと4で20分間、10％v / vのヒツジ血清℃のブロック非特異的抗体結合で1 × 10 6細胞/ mLの濃度に細胞を再懸濁し
- micronicチューブにラベルを付け、蛍光標識抗体の適切な濃度を追加してください。
- 各チューブに細胞懸濁液（ブロック）の50μlを加え、4℃で30分間インキュベート℃に
- 非結合抗体を除去するために修正されたPBSを添加し、細胞を洗浄する。
- フローサイトメーターにラベルされた細胞に移動して、分析を行います。
パート4：ECFCコロニーの成長、固定、染色し、階層分析
- 単一のコロニーの成長を可能にする細胞培養プレートの平方センチメートル当たり3または10の細胞の非常に低い播種密度でシード実質的に純粋な収穫ECFCsを。
- 交換培地の三分の一週二回。
- 14日は（文化の終わり）培地を除去した後、PBSで2回洗浄し、氷冷固定液（アセトン2：：メタノール= 3）でコロニーを固定し、冷蔵庫で15分間。
- 固定液を捨て、プレートを10分間乾燥するために開いたままにしておきます。
- 10分間蒸留水で細胞を再水和。
- ハリスヘマトキシリン溶液を追加し、12分間固定コロニーを染色。
- H matoxylin溶液を除去し、残りの染色液を取り除くために水道水でプレートをすすぎます。
- して、各コロニーの写真を撮る実体顕微鏡とインポートを使用して*. jpgまたは*. tif形式のファイルをコンピュータに。
- ImageJのソフトウェアで写真を開いて、アニメーションで説明したように各コロニーの正確な細胞数を分析する。
- ImageJのソフトウェアを開き、プルダウンメニューで"ファイル\開く"機能を使用してコロニーのイメージをインポートします。
- 機能'\減算バックグラウンドプロセス"を使用して進む
- コロニーのマージンをマークするImageJのメニューで'*楕円*またはブラシの選択"機能を使用してください。
- "編集は\クリア外"の関数と作物'\トリミング画像"を選択することで画像を使用して周囲の画像を消去します。
- すべての細胞が完全に赤色に着色されるように、関数の'\ \しきい値の調整イメージ"を使用して手動で閾値を調整します。
- "分析\分析粒子"を選択することにより、コロニーの細胞数をカウントします。適切な設定を（各セルのタイプに最適化された）を選択し、"OK"を選択します。細胞数と計数した細胞の対応するアウトラインを含む新しいイメージを含む結果ボックスが、表示されます。
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Discussion
骨髄、脂肪組織、臍帯血、等を含むMSCSまたはECFCsの取得元となる、さまざまなソースがあります
それは、直接組織と血管再生や腫瘍の進行への寄与のようなプロセスでの異なる細胞型の関与を比較するために、同じソースから前駆細胞の両方のタイプを取得する必要があります。
分離し、その後同じドナーからECFCsとMSCの自家ペアを研究する際の容易さは、個々の実験内でドナーの変化を除くためにこの方法が有利です。
造血細胞と汚染の可能性は継代の手順により最小化し、フローサイトメトリーで確認されます。
正しく行えば、分離した細胞は、（i）前駆細胞の機能を共有し、（ii）十分な量の実験的移植のために利用できるはずですし、フローサイトメトリーによって確認されたように（ⅲ）純粋である。
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Disclosures
著者は宣言するために興味のある金銭的競合を持っていない。
Acknowledgments
著者は、原稿に有益なコメント、ダニエラターレルとマルガレッタ神父hwirth技術支援のための、言語編集用のモニカファレル、ウーラング、マルギットホルツアップフェルと産科の部でサンドラEppichためpHPL、エヴァローデとニコールホフマンを提供するためのカタリーナSchallmoserに感謝コードを提供する。
この作品は、オーストリアの研究財団（FWF、DSへの助成金N211 - NAN）、オーストリアの研究推進機構（FFG、DSへの助成金N200）で、成体幹細胞研究財団（AR）によってサポートされています。 ARは、グラーツの医科大学の博士課程のプログラム分子医学の仲間です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alpha modified MEM | Sigma-Aldrich | ||
| L-GLutamin | Sigma-Aldrich | ||
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | ||
| EBM | Lonza Inc. | ||
| Single cytokine quots | Lonza Inc. | ||
| 75 cm2 flasks | Corning | ||
| 150 cm2 plates | Corning | ||
| Cell scraper | Corning | ||
| Trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| Monoclonal antibodies | BD Biosciences | ||
| PBS | |||
| 50 ml tubes | Falcon BD | ||
| 500 mL filter 20 μm pore size | EMD Millipore | ||
| Preservative free heparin | Biochrom AG |
References
- Schallmoser, K. Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells. Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).
- Reinisch, A. Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application. Regen Med. 2, 371-382 (2007).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. 113, 6716-6725 (2009).
- Strunk, D. Phenotypic characterization and preclinical production of human lineage-negative cells for regenerative stem cell therapy. Transfusion. 45, 315-326 (2005).
