Summary
Dextran सल्फेट सोडियम (DSS) पीने के पानी में प्रशासित एक स्थापित murine तीव्र बृहदांत्रशोथ के भड़काऊ चोट मॉडल है. इस प्रोटोकॉल DSS उपचार और ऊतकों की तैयारी के लिए विधि रूपरेखा.
Abstract
बृहदांत्रशोथ है Crohn सबसे विशेष रूप से ulcerative बृहदांत्रशोथ बृहदांत्रशोथ और Crohn रोग के colonic संस्करण, वायरल या जीवाणु संक्रमण, इस्कीमिक अपमान, या autoimmune विकार से हो सकता है. तीव्र बृहदांत्रशोथ दर्द और पेट फैलावट, malabsorption, दस्त, hematochezia और मल में बलगम के साथ उपस्थित हो सकता है. हम पर्यावरण, आनुवांशिकी, और बृहदांत्रशोथ के सूजन आंत्र रोग और पशु मॉडल में उपकला बाधा रोग है इस रोग के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने में आवश्यक के बीच जटिल संबंधों को समझने की शुरुआत कर रहे हैं. एक लोकप्रिय मॉडल कम आणविक भार Dextran सोडियम सल्फेट (DSS) के साथ चूहों के पीने के पानी का सप्लीमेंट, उपकला नुकसान और बृहदान्त्र में एक मजबूत भड़काऊ प्रतिक्रिया में जिसके परिणामस्वरूप कई दिनों तक शामिल
Protocol
भाग 1: चोट मरम्मत बृहदांत्रशोथ मॉडल
- आधारभूत वजन DSS उपचार शुरू प्रत्येक माउस के लिए पहले प्राप्त किया जाना चाहिए.
- 3% (w / v) Dextran पानी में सल्फेट सोडियम नमक समाधान और एक 0.45 सुक्ष्ममापी सेलूलोज़ एसीटेट फिल्टर के साथ फिल्टर बनाओ.
- माउस पिंजरे में चार दिनों के लिए 3% DSS समाधान के साथ पीने के पानी बदलें. चूहों पानी के किसी अन्य स्रोत (यानी अपवर्जन स्वचालित पानी सिस्टम पर रखा सुझावों) तक पहुँच नहीं होना चाहिए.
- चार दिन में एक अतिरिक्त तीन दिनों के लिए पानी के साथ इस के बारे समाधान की जगह, कुछ colonic उपकला वसूली की अनुमति है. चूहों चार दिन पर तौला जाना चाहिए, क्रम में करने के लिए बृहदांत्रशोथ के प्रणालीगत परिणाम यों. वजन घटाने गंभीर चोट के साथ आम है.
- 7 दिन, वजन और चूहों बलिदान. चूहे isoflurane, या संस्थागत अन्य inhalational अधिक मात्रा द्वारा euthanized किया जा सकता है है, IACUC तरीकों को मंजूरी दे दी.
भाग 2: Necropsy और बृहदान्त्र की कटाई
- माउस और सुरक्षित पैरों के ventral पक्ष बेनकाब करने के लिए पेट के लिए unobstructed का उपयोग सुनिश्चित करने के लिए. 70% इथेनॉल के साथ पेट पूरी तरह से गीले.
- ऊतक संदंश के साथ पेट के midline समझ और ऊपर की तरफ इस तरह त्वचा tenting विस्तार. ठीक इत्तला दे दी कैंची का उपयोग करने के लिए इस प्रकार पेट की सामग्री को उजागर पेट काटकर अलग कर देना. Midline पर xyphoid प्रक्रिया की नोक चीरा बढ़ाएँ और फिर द्विपक्षीय तटीय मार्जिन के अवर पहलू के साथ विस्तार.
- छोटी आंत cecum और बृहदान्त्र को पहचानें. ध्यान से काटना / आसपास अन्त्रपेशी से बृहदान्त्र तंग. आड़ा काट श्रोणि में गहरी बृहदान्त्र के बाहर का बृहदान्त्र और मलाशय मुक्त. प्रॉक्सिमल बृहदान्त्र मुक्त colonocecal मार्जिन पर बृहदान्त्र आड़ा काट. इस प्रक्रिया के दौरान देखभाल लिया जाना चाहिए करने के लिए बृहदान्त्र सफाई समस्याग्रस्त हो सकता है अगर वेध होता है के रूप में बृहदान्त्र नुकसान नहीं है.
- एक 20G खिला सुई और 10 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग intubate, और ठंडा पीबीएस के साथ बृहदान्त्र फ्लश जब तक eluate मल के पूरी तरह से स्पष्ट है.
- इस बिंदु पर, अगर एक विदारक माइक्रोस्कोप के साथ macroscopic विश्लेषण वांछित है, कॉलन "सॉस" के रूप में तय किया जा सकता है. यदि histologic विश्लेषण केवल वांछित है की तुलना में भाग 4 "तीव्र बृहदांत्रशोथ के histological विश्लेषण के लिए स्विस रोल्स बनाना" के लिए आगे बढ़ना.
भाग 3: पूरे बृहदान्त्र के macroscopic विश्लेषण के लिए "सॉस" के रूप में प्रसंस्करण
- यह बृहदान्त्र के सही ओरिएंटेशन को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है, इसलिए रखने के लिए, ऑपरेटर के लिए निकटतम बृहदान्त्र के बाहर का अंत. गैर absorbable सीवन के दो टुकड़े (SP116 1.5 मीट्रिक लट रेशम), लंबाई में लगभग 1 इंच, अन्य 2 इंच का कट.
- सीवन के 2 इंच टुकड़ा का उपयोग बंद के रूप में संभव के रूप में मार्जिन के करीब है जबकि अभी भी एक अच्छा सील को बनाए रखने के लिए बाहर का अंत टाई.
- प्लेस एक 20G 10% के 5 मिलीलीटर खिला युक्त सुई बृहदान्त्र के प्रॉक्सिमल अंत में formalin फॉस्फेट buffered. शिथिल खिला सुई के बल्ब के लिए तुरंत प्रॉक्सिमल सीवन के शेष टुकड़ा टाई. बृहदान्त्र मजबूती से खिला सुई के बल्ब और मुट्ठी formalin बिगोना तक बृहदान्त्र विस्तार है. सीवन में गाँठ कस के रूप में आप भोजन सुई वापस लेने के लिए, इस प्रकार एक "सॉसेज" के रूप में संचार, विस्तार बृहदान्त्र छोड़ने.
- भरें एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के साथ 10% formalin फॉस्फेट buffered और ट्यूब में बृहदान्त्र जगह. 24 घंटे के लिए ठीक है.
- बंद formalin डालो और एक अतिरिक्त 24hrs के लिए 70% EtOH के साथ की जगह. (70% EtOH में Colons संग्रहीत किया जा सकता है अनिश्चित काल के कमरे के तापमान पर.)
- शंक्वाकार ट्यूब से बृहदान्त्र निकालें और एक स्केलपेल के साथ प्रत्येक के अंत पर तार काट, बृहदान्त्र नुकसान नहीं सावधान किया जा रहा है. याद रखें कि बाहर का अंत स्ट्रिंग के सबसे लंबे समय तक टुकड़ा है. डिस्टल से longitudinally बृहदान्त्र के प्रॉक्सिमल अंत करने के लिए इतना है कि यह एक लंबे पत्र रूपों कट. इस बिंदु पर, पेट के एक विदारक खुर्दबीन के नीचे देखा जा सकता है.
भाग 4: तीव्र बृहदांत्रशोथ के histological विश्लेषण के लिए स्विस रोल्स बनाना
- यह बृहदान्त्र के सही ओरिएंटेशन को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है, इसलिए रखने के लिए, ऑपरेटर के लिए निकटतम बृहदान्त्र के बाहर का अंत.
- बृहदान्त्र लंबाई उपाय. यह मीट्रिक चोट की गंभीरता के एक और संकेत है. बृहदांत्रशोथ के edema बढ़ जाती है और समग्र बृहदान्त्र लंबाई shortens.
- ठीक इत्तला दे दी कैंची का प्रयोग, बृहदान्त्र के प्रॉक्सिमल अंत करने के लिए बाहर का longitudinally काटकर अलग कर देना. चीरा के किसी भी बढ़त समझ और laterally खोलने के अपने रास्ते distally -> proximally काम करने के लिए, इस तरह के एक फ्लैट शीट के रूप में बृहदान्त्र प्रदर्शित ठीक इत्तला दे दी संदंश का प्रयोग करें.
- बृहदान्त्र रोलिंग संदंश की एक जोड़ी और एक दो हाथ तकनीक की आवश्यकता है. संदंश के साथ बाहर का मार्जिन के दोनों किनारे मुट्ठी. Sequentially घूर्णन और प्रॉक्सिमल मार्जिन पर कार्यवाही संदंश द्वारा जारी बृहदान्त्र रोल के लिए आगे बढ़ें. इस प्रकार एक तीसरा आयाम या "स्विस रोल के साथ एक सर्पिल पैदा.लुढ़का फार्म को बनाए रखने के लिए, रोल संदंश के साथ मजबूती और समझ के लिए यह एक सुई 27G1 / 2 के साथ आड़ा काट. सुई सुई झुकने के रूप में यह रोल बाहर निकलता है द्वारा सुरक्षित.
- एक उचित लेबल ऊतक और 10% की एक जार में कैसेट जगह में रोल प्लेस 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर formalin फॉस्फेट buffered ऊतक निर्धारण सुनिश्चित.
- बंद formalin डालो और एक अतिरिक्त 24hrs के लिए 70% EtOH के साथ की जगह. (70% EtOH में Colons संग्रहीत किया जा सकता है अनिश्चित काल के कमरे के तापमान पर.)
- एक बार नमूना तय किया गया है, यह आयल - एम्बेडेड sectioned, और histologic विश्लेषण के लिए स्लाइड पर घुड़सवार जा सकता है.
भाग 5: प्रतिनिधि परिणाम
तीव्र बृहदांत्रशोथ के लिए DSS मॉडल शोधकर्ता प्राप्त करने के लिए, ठीक है, और एक कि मॉडल तीव्र बृहदांत्रशोथ बृहदान्त्र का विश्लेषण करने के लिए अनुमति देता है. जब स्विस रोल कट और घुड़सवार है, यह पूरे बृहदान्त्र के एक प्रतिनिधि टुकड़ा के रूप में अगर ठीक से लुढ़का (चित्रा 1) चाहिए. घुड़सवार रोल एच एंड ई के साथ दाग जा सकता है क्रम में बृहदान्त्र के लिए बाहर का अंत (अंदर) से प्रॉक्सिमल अंत (बाहर) (चित्रा 2) के लिए क्षति की सीमा निर्धारित है. Immunohistochemistry की पहचान करने और भड़काऊ पैठ यों स्विस रोल पर भी किया जा सकता है. यदि सॉसेज विधि सही ढंग से प्रदर्शन किया गया है, तय बृहदान्त्र और फैली हुई हो पूरे mucosal सतह को आसानी से हो सकता है और चालाकी से कर सकते हैं विदारक माइक्रोस्कोप (चित्रा 3) के अंतर्गत देखा.
चित्रा 1 ठीक से मार डाला "स्विस रोल". (ए) बृहदान्त्र प्रॉक्सिमल अंत से बाहर का लुढ़का है, एक सुई के साथ transected और सुई के अंत झुकने द्वारा सुरक्षित है. यह तो निर्धारण के लिए एक ऊतक कैसेट में रखा गया है. (ख) एच एंड ई 5 DSS (घ = बाहर का बृहदान्त्र p = प्रॉक्सिमल बृहदान्त्र) के साथ इलाज एक माउस के बृहदान्त्र से बना एक स्विस रोल के सुक्ष्ममापी अनुभाग दाग.
चित्रा 2. DSS इलाज कोलन तीव्र बृहदांत्रशोथ के लक्षण बताते हैं . सूजन और तहखाना नुकसान DSS इलाज बृहदान्त्र में एक इलाज पानी को नियंत्रित करने के लिए तुलना में स्पष्ट कर रहे हैं.
चित्रा 3. एक "सॉसेज" का एक उदाहरण है . सॉसेज formalin के साथ संचार और पूरी तरह से विस्तार. एक मामूली कोण वर्तमान बृहदान्त्र के प्राकृतिक वक्रता के लिए माध्यमिक जाएगा. खोला सॉसेज फ्लैट झूठ चाहिए.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल के लिए गंभीर चोट, चोट की मरम्मत, या पुरानी colonic चोट प्रक्रियाओं मॉडल संशोधित किया जा सकता है है.
तीव्र चोट संशोधन:
DSS 4-6 दिनों के लिए तत्काल बलिदान के बाद उपचार विज्ञापन उदारीकरण
चोट मरम्मत संशोधन:
DSS 3-4 दिन और बलिदान की वसूली की अवधि (के रूप में ऊपर प्रोटोकॉल में वर्णित) द्वारा बाद उपचार के 4-6 दिनों के साथ चोट.
जीर्ण बृहदांत्रशोथ संशोधन:
चूहे प्रत्येक चक्र के बीच वसूली के सोलह दिन के साथ तीन 3% DSS का पांच दिवसीय चक्र पर रखा जाता है. चूहे अंतिम बाकी 16 दिन की अवधि के बाद बलिदान हैं.
वहाँ कई मुद्दों है कि शोधकर्ताओं ने इस मॉडल के साथ के बारे में पता करने की आवश्यकता है कर रहे हैं:
- चोट की साइट में परिवर्तनशीलता: हमारे हाथ में, हम प्रॉक्सिमल बृहदान्त्र और cecum के रिश्तेदार बख्शते के साथ मुख्य रूप से बाहर का चोट पैटर्न, देखते हैं. दूसरों को चोट पैटर्न अधिक समीपस्थ प्रबलता की सूचना दी है.
- पर्यावरण परिवर्तनशीलता. वहाँ महत्वपूर्ण पर्यावरणीय परिवर्तनशीलता है. यह संभावना है, भाग में, आंतों microflora, आहार और अन्य पर्यावरणीय विचार में मतभेद की वजह से.
- यह मॉडल अप्रभावी है अगर उच्च आणविक भार DSS (यानी 500.000 दा) प्रयोग किया जाता है.
- इस मॉडल 4 के साथ काफी तनाव परिवर्तनशीलता है.
बृहदान्त्र के बायोकेमिकल विश्लेषण प्रॉक्सिमल या बाहर का मार्जिन से नमूने लेने के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है है. चोट की गंभीरता के आधार पर यह आपके लिए एक histologic चोट स्कोर उत्पन्न करने की क्षमता प्रभाव हो सकता है. Vivo BrdU प्रसार को मापने के लिए लेबलिंग 16.7 μg / किलो BrdU 2 बजे के पहले intraperitoneal इंजेक्शन α BrdU आईएचसी प्रसंस्करण बाद बलिदान के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.
"सॉसेज" के लिए एक विकल्प के रूप में, बृहदान्त्र को पूरी तरह से फ्लैट तय किया जा सकता है. रेखा वाटमान कागज के साथ एक Tupperware कंटेनर के नीचे और 10% के साथ कागज सोख formalin फॉस्फेट buffered. बृहदान्त्र: Necropsy और बृहदान्त्र के फसल काटने वाले भाग 2 "में वर्णित के रूप में काटना. फिर, ऑपरेटर के लिए निकटतम बृहदान्त्र के बाहर का अंत रखो. ठीक इत्तला दे दी कैंची का प्रयोग, बृहदान्त्र के प्रॉक्सिमल अंत करने के लिए बाहर का longitudinally काटकर अलग कर देना. के साथ ठीक इत्तला दे दी संदंश चीरा के दोनों किनारे समझ और पार्श्व को खोलने के काम कर रहे है, इस प्रकार एक फ्लैट शीट के रूप में बृहदान्त्र प्रदर्शित. इस फ्लैट शीट पूर्व लथपथ वाटमान कागज स्थानांतरण. वाटमान और गीला का एक टुकड़ा के साथ कवर चपटी बृहदान्त्र के साथ 10% formalin फॉस्फेट buffered. वाटमान formalin में पूरी तरह से कवर किया जाना चाहिए, लेकिन इतना है कि यह बृहदान्त्र बंद लिफ्टों नहीं तो. Tupperware सील और 24 घंटे के लिए ठीक है. Tupperware से बृहदान्त्र निकालें और यह एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 10 मिलीलीटर 70% इथेनॉल में जगह. (70% EtOH में Colons संग्रहीत किया जा सकता है अनिश्चित काल के कमरे के तापमान पर.)
Colonic 5,6,7 चोट बढ़ाता करने के लिए कई तरीके हैं. सूजन हद तक भागीदारी, उत्थान, तहखाना नुकसान, और 8 प्रतिशत की भागीदारी: एक विधि, उदाहरण के लिए, सहित एक पैरामीटर बहु पैमाने का उपयोग करता है.
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Disclosures
जानवरों पर प्रयोग Vanderbilt IACUC द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
Acknowledgments
एनआईएच (1 K08 DK080221-01) और Vanderbilt संस्थागत विकास कोष द्वारा प्रदान की अनुदान.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran Sulfate Sodium Salt | USB Corp., Affymetrix | 9011-18-1 | mol wt 40,000-50,000 |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC 57319-474-06 | |
| TISSUE PATH Macrosette Cassettes | Fisher Scientific | 15182706 | |
| BD 10 ml Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco-AAPER | E190 | Dilute to 70% with distilled water |
| 20G Straight Feeding Needle | VWR international | 20068-612 | |
| 27G1/2 PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 305109 | |
| Dissecting Scissors Sharp/Blunt Tip | VWR international | 82027-588 | |
| Waugh Forceps | VWR international | 82027-428 | |
| Non-absorbable Suture | LOOK Surgical | SP116 | |
| Whatman Blotting Paper | VWR international | 28298-020 | Cut as needed |
| Nalgene Surfactant-Free Cellulose Acetate (SFCA) Filter | Cole-Parmer | EW-06731-2 | |
| Carbon fiber composites digital caliper | Fisher Scientific | 15-007-958 |
References
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