Summary
식수에서 실시 Dextran 황산 나트륨 (DSS)은 급성 대장염의 설립 murine 염증성 손상 모델입니다. 이 프로토콜은 DSS 치료와 조직의 준비를 위해 방법을 설명합니다.
Abstract
- Crohn의 대장염 궤양성 대장염 특히 및 Crohn의 질병의 colonic 변종, 대장염은 바이러스 또는 박테리아 감염, 허혈성 모욕, 또는자가 면역 질환에서 발생할 수 있습니다. 급성 대장염은 복부 통증과 팽창, 흡수 장애, 설사, hematochezia 및 배설물에 점액과 함께 제공됩니다. 우리는 환경, 유전 및 대장염의 염증성 장 질환과 동물 모델에서 상피 장벽 부전이 질병의 우리의 이해를 발전에 필수되었습니다 사이의 복잡한 상호 작용을 이해하기 시작하고 있습니다. 하나의 인기있는 모델은 몇 일 지속 상피 손상과 콜론의 강력한 염증 반응의 결과로, 낮은 분자량 Dextran 나트륨 황산 (DSS)와 생쥐의 식수를 보충 포함
Protocol
1 부 : 상해 - 복구 대장염 모델
- 기준 무게 DSS 치료를 시작하기 전에 각각의 마우스에 대한 취득해야합니다.
- 3 % (W / V) Dextran의 황산 나트륨 소금물에 솔루션과 0.45 μm의의 셀룰로스 아세테이트 필터와 필터를 확인하십시오.
- 나흘 동안 3 % DSS 솔루션 마우스 케이지에서 식수를 교체합니다. 쥐를 물의 다른 소스 (자동 급수 시스템에 위치 즉, 제외 팁)에 액세스할 수 없습니다.
- 일 4 층에 일부 colonic 상피 복구를 허용, 추가로 3 일 동안 물을 DSS 솔루션을 대체합니다. 생쥐는 대장염의 체계적 결과를 계량하기 위해 일 넷 무게해야합니다. 체중 감소는 심각한 부상 일반적입니다.
- 일 7, 무게 및 생쥐를 희생. 마우스가 isoflurane, 또는 institutionally 상대방의 inhalational 과용으로 euthanized 수 IACUC이 방법을 승인했다.
2 부 : 검시와 콜론의 착취
- 복부에 가리지 액세스를 보장하기 위해 마우스 및 보안 다리 복부 측면을 폭로. 70 % 에탄올로 완전히 복부가 젖었어.
- 티슈 포셉와 복부의 정중선을 파악하고 tenting 피부를 따라서 위쪽으로 연장. 따라서 복부 내용을 노출 복부를 절개하는 미세 밀고 가위를 사용합니다. 정중선에서 xyphoid 과정의 끝에으로 절개를 확장하고 양자 늑골 여백의 하부 측면 따라 연장.
- 소장, 맹장 및 결장을 식별합니다. 신중하게 해부하다 / 주변 장간막에서 콜론을 괴롭혀. 말초 콜론과 직장을 무료로 골반 깊은 콜론을 가로로 쪼개다. 근위 대장을 무료로 colonocecal 여백에 콜론을 가로로 쪼개다. 케어는 천공이 발생하는 경우에는 콜론이 문제가 될 청소로 콜론을 손상하지 않도록이 과정에서 촬영해야합니다.
- 20G 먹이를 바늘과 10 ML의 주사기를 사용 intubate 및 eluate가 대변을 완전히 명확 때까지 얼음처럼 차가운 PBS로 콜론을 플러시.
- 해부 현미경으로 매크로 분석 원하는 경우이 시점에서, 콜론은 "소시지"으로 해결할 수 있습니다. histologic 분석은 4 "급성 대장염의 Histological 분석을 위해 스위스 롤스 만들기"부분으로 진행보다 원하는 경우.
3 부 : 전체 대장의 매크로 해석에 대해 "소시지"으로 처리
- 그것은 콜론의 올바른 방향을 유지하는 것이 중요하다, 따라서, 운영자에 가장 가까운 콜론의 말초 끝을 유지. 비 흡수성 봉합사 두 조각 (SP116 1.5 통계 꼰 실크), 길이 한 약 1 인치, 다른 2인치 컷.
- 여전히 좋은 도장을 유지하면서 가능한 한 여백에 가까운 말초 끝을 묶을 봉합의 2 인치 조각을 사용합니다.
- 10 % 5 ML을 포함 20G 먹이 바늘은 결장의 근위 끝에 포르말린 인산염을 버퍼 플레이스. 대충 먹이 바늘의 전구 즉시 근위 봉합의 나머지 부분을 묶어. 먹이 바늘의 전구에 단단히 콜론을 파악하고 콜론이 확장 때까지 포르말린 달이다. 당신은 따라서 "소시지"으로 주입 확장 콜론을두고, 먹이를 바늘을 철회로 봉합에 매듭을 조인다.
- 10 % 포르말린 인산염을 버퍼와 튜브에 콜론을 장소와 15 ML 원뿔 튜브를 입력합니다. 24 시간 동안 수정.
- 포르말린을 붓고 및 추가 24에 대한 70 % EtOH로 바꿉니다. (콜론은 상온에서 무한정 70 % EtOH에 저장할 수 있습니다.)
- 원뿔 관에서 콜론을 제거하고 대장을 손상하지 않도록주의하고, 메스 각 끝에있는 문자열을 잘라. 말초 끝이 문자열의 가장 긴 부분을했다는 것을 기억 하여라. 그것은 긴 시트를 형성 있도록 결장의 근위 끝에 말초에서 길이 방향 컷. 이 시점에서 콜론은 해부 현미경으로 볼 수 있습니다.
4 부 : 급성 대장염의 Histological 분석을 위해 스위스 롤스 만들기
- 그것은 콜론의 올바른 방향을 유지하는 것이 중요하다, 따라서, 운영자에 가장 가까운 콜론의 말초 끝을 유지.
- 콜론의 길이를 측정합니다. 이 통계는 부상의 심각도의 또 다른 지표이다. 대장염은 부종을 증가 시키며, 전체 대장의 길이를 단축.
- 세부적으로 밀고 가위를 사용하여 콜론의 근위 끝에 말초에서 길이 방향 절개. 따라서 평면 시트로 콜론을 표시 절개 중 가장자리를 파악하고 distally -> proximally 길을 작업을 옆으로 열어 좋은 밀고 집게를 사용하십시오.
- 콜론 롤링 것은 포셉 한 켤레, 두 손으로 기술을 필요로합니다. 포셉와 말초 여백 중 하나 가장자리를 파악. 순차적으로 근위 여백을 진행 포셉를 회전하고 공개하여 콜론을 롤로 진행합니다. 따라서 3 차원 또는 "스위스 롤"로 나선형을 생성.압연 양식을 유지하려면, 집게로 단단히 롤을 파악하고 27G1 / 2 바늘로 그것을 가로로 쪼개다. 그것이 출구 롤로 바늘을 절곡하여 바늘을 고정합니다.
- 10 % 병에 적절하게 표시 조직 카세트과 장소에 롤 장소는 조직 고정을 위해 24 시간을위한 상온에서 포르말린 인산염을 버퍼.
- 포르말린을 붓고 및 추가 24에 대한 70 % EtOH로 바꿉니다. (콜론은 상온에서 무한정 70 % EtOH에 저장할 수 있습니다.)
- 샘플가 해결되면, 그것은 파라핀 - 임베디드, sectioned 및 histologic 분석을위한 슬라이드에 장착할 수 있습니다.
제 5 부 : 대표 결과
급성 대장염에 대한 DSS 모델은 연구자가 얻을 수정, 그 모델 급성 대장염 콜론을 분석할 수 있습니다. (그림 1) 정상적으로 압연하는 경우 스위스 롤을 절단하고 장착하면, 그것은 전체 결장의 대표 슬라이스를 형성한다. 장착 롤은 말초 (내부) 끝에서 근위 (외부) 끝 (그림 2), 콜론 손상의 범위를 결정하기 위해 H & E 물들일 수 있습니다. Immunohistochemistry 또한 염증성 infiltrates를 파악하고 계량하는 스위스 롤을 수행할 수 있습니다. 소시지 방법이 올바르게 수행되고있다면, 고정 콜론이 확대되고 전체 점막 표면이 쉽게 해부 현미경 (그림 3)에서 조작하고 볼 수 있습니다.
그림 1. 적절한 실행 "스위스 롤". (A) 콜론은 근위 끝에 말초에서 굴러 바늘로 가로와 바늘의 끝을 굽힘에 의해 보안됩니다. 그것은 다음 고정을위한 조직 카세트에 배치됩니다. (B) H & E는 DSS (D = 말초 콜론 P = 근위 대장)를 취급 마우스 콜론 만든 스위스 롤 5 μm의 부분을 얼룩.
그림 2. DSS 취급 콜론은 급성 대장염의 흔적을 보여줍니다. 염증과 토굴 손상이 물 처리 제어에 비해 DSS - 처리 대장에 분명 있습니다.
그림 3. "소시지"의 예. 소시지는 포르말린과 함께 주입하고 완전하게 확대했습니다. 약간의 각도는 결장의 자연 굴절률이 존재 보조 것입니다. 열린 소시지가 평평 거짓말을한다.
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Discussion
이 프로토콜은 급성 부상, 부상 - 수리, 또는 만성 colonic 부상 프로세스를 모델로 수정할 수 있습니다.
급성 상해 변경 :
즉각적인 희생 뒤에 4~6일에 대한 DSS 처리 광고 lib과
상해 - 수리 수정 :
3-4일과 희생의 복구 기간 (위의 프로토콜에서 설명) 다음 DSS 치료 4-6일로 부상.
만성 대장염의 변경 :
생쥐는 각 사이클 사이에 회복 명이나 일 3 % DSS의 세 5 일주기에 게재됩니다. 생쥐는 마지막 16 일 휴식 기간 이후에 희생됩니다.
연구자들은이 모델로 인식하고 있어야 할 몇 가지 문제가 있습니다 :
- 부상 사이트의 다양성이 : 우리 손에, 우리는 근위 대장과 맹장의 상대적인 살려주과 함께 주로 말초 부상 패턴을 참조하십시오. 기타 부상 패턴에 더 근위 우위를보고있다.
- 환경 변화. 중대한 환경 변화가있다. 이것은 부분적으로 장내 microflora, 다이어트 및 기타 환경 고려 사항의 차이로 인해 가능성이 높습니다.
- 높은 분자량의 DSS는 (예 : 500,000 다) 사용하는 경우이 모델은 효과가 있습니다.
- 이 모델 4 상당한 변형 변화가 있습니다.
콜론의 생화학 분석은 근위 또는 말초 여백에서 샘플을 채취하여 수행할 수 있습니다. 부상의 정도에 따라이 histologic 부상 점수를 생성하는 능력에 영향을 수 있습니다. 생체내 BrdU에서 증식을 측정하기 위하여 분류하는 것은 α - BrdU IHC 처리 뒤에 희생하기 전에 16.7 μg / kg BrdU 2 시간의 intraperitoneal 주사로 얻을 수 있습니다.
'소시지'에 대한 대안으로서, 콜론 완전히 평평 해결할 수 있습니다. 왓먼 종이와 유리 섬유 복합 용기의 하단에와 10 %로 종이를 발라 라인 포르말린 인산염을 버퍼. "검시와 콜론의 착취 제 2 부"에 설명된대로 콜론을 해부하다. 다시, 운영자에 가장 가까운 콜론의 말초 끝을 유지. 세부적으로 밀고 가위를 사용하여 콜론의 근위 끝에 말초에서 길이 방향 절개. 좋은 밀고 포셉은 절개 중 가장자리를 파악하므로 평면 시트로 콜론을 표시 작업을 옆으로 열려있는 상태. 사전 절어 왓먼 신문이 플랫 시트를 전송합니다. 10 % 포르말린 인산염을 버퍼로 왓먼으로 젖은 채 다른 조각으로 평평 콜론을 커버. 왓먼 완전히 포르말린로 덮여 있지만 콜론을 리프트 너무 많이 안한다. 유리 섬유 복합을 봉쇄하고 24 시간 동안 수정. 유리 섬유 복합에서 콜론을 제거하고 15 ML 원뿔 튜브 10 ML 70 % 에탄올에 놓으십시오. (콜론은 상온에서 무한정 70 % EtOH에 저장할 수 있습니다.)
colonic 부상 5,6,7를 quantifying 여러 가지 방법이 있습니다. 염증, 어느 정도의 참여, 재생, 지하실 손상 및 퍼센트 참여 8 한 가지 방법은, 예를 들면, 포함하는 다중 매개 변수 크기를 사용합니다.
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Disclosures
동물 실험은 밴더빌트 IACUC에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.
Acknowledgments
NIH (1 K08 DK080221 - 01)와 밴더빌트 기관 개발 기금에서 제공하는 자금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran Sulfate Sodium Salt | USB Corp., Affymetrix | 9011-18-1 | mol wt 40,000-50,000 |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC 57319-474-06 | |
| TISSUE PATH Macrosette Cassettes | Fisher Scientific | 15182706 | |
| BD 10 ml Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco-AAPER | E190 | Dilute to 70% with distilled water |
| 20G Straight Feeding Needle | VWR international | 20068-612 | |
| 27G1/2 PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 305109 | |
| Dissecting Scissors Sharp/Blunt Tip | VWR international | 82027-588 | |
| Waugh Forceps | VWR international | 82027-428 | |
| Non-absorbable Suture | LOOK Surgical | SP116 | |
| Whatman Blotting Paper | VWR international | 28298-020 | Cut as needed |
| Nalgene Surfactant-Free Cellulose Acetate (SFCA) Filter | Cole-Parmer | EW-06731-2 | |
| Carbon fiber composites digital caliper | Fisher Scientific | 15-007-958 |
References
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- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
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- Dieleman, L. A. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
