Summary
Destrano sodio solfato (DSS) somministrata in acqua potabile è un consolidato modello murino lesioni infiammatorie di colite acuta. Questo protocollo descrive il metodo per il trattamento DSS e la preparazione dei tessuti.
Abstract
Colite possono essere causati da infezioni virali o batteriche, insulto ischemico, o malattie autoimmuni, in particolare colite ulcerosa e la variante del colon del morbo di Crohn - Colite di Crohn. Colite acuta può presentarsi con dolore e distensione addominale, malassorbimento, diarrea, ematochezia e muco nelle feci. Stiamo cominciando a comprendere le complesse interazioni tra ambiente, genetica, e disfunzione della barriera epiteliale nei modelli di malattia infiammatoria intestinale e animali di colite sono stati essenziali nel portare avanti la nostra comprensione di questa malattia. Un modello popolare prevede che completa l'acqua potabile di topi con basso peso molecolare destrano solfato di sodio (DSS), con conseguente danno epiteliale ed una robusta risposta infiammatoria nel colon di più giorni
Protocol
Parte 1: Lesioni-Repair Modello Colite
- Peso di base dovrebbe essere ottenuto per ogni mouse prima dell'inizio del trattamento DSS.
- Effettuare una (w / v) 3% di soluzione di destrano solfato di sodio sale in acqua e filtrare con un filtro da 0,45 micron acetato di cellulosa.
- Sostituire l'acqua potabile nella gabbia del mouse con la soluzione DSS 3% per quattro giorni. I topi non dovrebbero avere accesso a qualsiasi altra fonte d'acqua (punte esclusione cioè immessi sul sistema di irrigazione automatico).
- Il quarto giorno, sostituire la soluzione DSS con l'acqua per altri tre giorni, permettendo una certa ripresa epiteliali del colon. I topi deve essere pesato il quarto giorno al fine di quantificare le conseguenze sistemiche di colite. La perdita di peso è comune con gravi lesioni.
- Il giorno 7, pesare e il sacrificio dei topi. I topi possono essere eutanasia per overdose inalazione di isoflurano o altri istituzionalmente, IACUC approvato i metodi.
Parte 2: l'autopsia e la raccolta di Colon
- Esporre la parte ventrale del mouse e le gambe sicuro per garantire un libero accesso ad all'addome. Bagnare l'addome completamente con il 70% di etanolo.
- Afferrare la linea mediana dell'addome con una pinza tessuti e estendersi verso l'alto così tenda la pelle. Utilizzare forbici a punta fine di incidere l'addome esponendo così il contenuto addominale. Estendere l'incisione a punta del processo xifoideo sulla linea mediana e poi si estendono lungo l'aspetto inferiore del margine costale bilaterale.
- Identificare l'intestino tenue, cieco e del colon. Con attenzione sezionare / stuzzicare i due punti dal mesentere circostante. Transetto i due punti in profondità nella pelvi per liberare il colon distale e del retto. Transetto del colon al margine colonocecal per liberare il colon prossimale. Si deve prestare attenzione durante questo processo non danneggiare i due punti come la pulizia del colon sarà problematico se si verifica la perforazione.
- Utilizzando un ago 20 G di alimentazione e siringa da 10 ml, intubare e sciacquare i due punti con gelida PBS finché l'eluato è del tutto chiaro delle feci.
- A questo punto, se l'analisi macroscopica con un microscopio da dissezione è desiderato, i due punti possono essere fissati come "salsicce". Se l'analisi istologica solo si desidera di passare alla Parte 4 "Fare Rolls svizzera per l'analisi istologica di colite acuta".
Parte 3: Elaborazione di "Salsicce" per l'analisi macroscopica di tutto il colon
- E 'importante mantenere il corretto orientamento del colon, quindi, tenere l'estremità distale del colon più vicina all'operatore. Tagliate due pezzi di sutura non riassorbibili (SP116 1,5 seta intrecciata metrico), uno di circa 1 pollice di lunghezza, gli altri 2 pollici.
- Utilizzare il pezzo da 2 pollici di sutura per legare l'estremità distale più vicino possibile al margine possibile mantenendo comunque una buona tenuta.
- Inserire un ago 20G alimentazione contenente 5 ml di 10% di formalina tamponata fosfato nelle estremità prossimale del colon. Liberamente legare il pezzo rimanente di sutura immediatamente prossimale al bulbo dell'ago alimentazione. Afferrare il colon saldamente al bulbo dell'ago alimentazione e infondere formalina fino a quando il colon è espanso. Stringere il nodo della sutura quando si estrae l'ago di alimentazione, lasciando così l'infuso, colon esteso come una "salsiccia".
- Riempire un tubo da 15 ml con 10% di formalina tamponata fosfato e il luogo del colon nel tubo. Fix per 24 ore.
- Eliminare formalina e sostituire con 70% EtOH per un ulteriore 24 ore. (Due punti possono essere memorizzati in 70% EtOH a tempo indeterminato a temperatura ambiente.)
- Rimuovere i due punti dal tubo conico e tagliare le corde alle estremità con un bisturi, facendo attenzione a non danneggiare il colon. Ricordate che l'estremità distale è il più lungo pezzo di spago. Tagliato longitudinalmente da distale a prossimale del colon in modo da formare un foglio lungo. A questo punto, il colon può essere visto sotto un microscopio da dissezione.
Parte 4: Esecuzione di Rolls svizzera per l'analisi istologica di colite acuta
- E 'importante mantenere il corretto orientamento del colon, quindi, tenere l'estremità distale del colon più vicina all'operatore.
- Misurare la lunghezza del colon. Questo dato è un altro indicatore della gravità della lesione. Colite aumenta l'edema e riduce la lunghezza totale del colon.
- Utilizzando le forbici a punta fine, incidere longitudinalmente da distale a prossimale del colon. Usare bene pinze punta a cogliere uno dei bordi della ferita e aprire lateralmente tuo modo di lavoro-distale> prossimale, visualizzando così i due punti come una lamiera piana.
- Rotolamento del colon richiede un paio di pinze e una tecnica a due mani. Afferrare entrambi i bordi del margine distale con una pinza. Procedere a rotolare i due punti in sequenza ruotando e rilasciando il forcipe di procedere con il margine prossimale. Generando così una spirale con una terza dimensione o "Roll svizzero".Per mantenere la forma arrotolata, afferrare saldamente il rotolo con una pinza e transetto con un 27G1 / 2 ago. Fissare l'ago piegando l'ago quando esce il rotolo.
- Inserire il rotolo in una cassetta tessuto opportunamente etichettato e posto in un vaso del 10% formalina tamponata fosfato a temperatura ambiente per 24 ore per garantire la fissazione dei tessuti.
- Eliminare formalina e sostituire con 70% EtOH per un ulteriore 24 ore. (Due punti possono essere memorizzati in 70% EtOH a tempo indeterminato a temperatura ambiente.)
- Una volta che il campione è stato fissato, esso può essere incluso in paraffina, sezionati e montati su vetrini per l'analisi istologica.
Parte 5: Risultati Rappresentante
Il modello DSS per la colite acuta consente al ricercatore di ottenere, correggere e analizzare i due punti che i modelli colite acuta. Quando il rotolo svizzero viene tagliato e montato, dovrebbe costituire una fetta rappresentativa di tutto il colon se vi fosse stata correttamente (Figura 1). Il rullo montato può essere colorato con H & E, per determinare l'entità del danno al colon, dal distale (interno) fine alla prossimale (fuori) fine (Figura 2). Immunoistochimica può essere eseguita anche sul rotolo svizzero per identificare e quantificare infiltrati infiammatori. Se il metodo salsiccia è stata eseguita correttamente, i due punti fissi saranno dilatati e l'intera superficie della mucosa può essere facilmente manipolato e osservato al microscopio da dissezione (Figura 3).
Figura 1. Correttamente-Il eseguito "Swiss roll". (A) I due punti sono rotolato dalla distale a prossimale, sezionato con un ago e garantito piegando la fine dell'ago. E 'poi messo in una cassetta di tessuto per il fissaggio. (B) H & E macchiato sezione 5 micron di un rotolo svizzero fatta dal colon di un topo trattati con DSS (d = colon distale p = colon prossimale).
Figura 2. DSS due punti trattati mostrano segni di colite acuta. Danno l'infiammazione e la cripta sono evidenti nel DSS trattati con due punti rispetto a un controllo dell'acqua trattata.
Figura 3. Un esempio di "salsiccia". La salsiccia infuso con formalina e completamente esteso. Una leggera angolazione sarà presente secondaria alla curvatura naturale del colon. La salsiccia aperto deve essere piatto.
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Discussion
Questo protocollo può essere modificato per modello lesioni acute, lesioni di riparazione, o cronica processi di lesioni del colon.
Lesioni Modifica acuta:
DSS ad lib trattamento per 4-6 giorni, seguita dal sacrificio immediato
Infortuni Riparazione Modifica:
Lesioni con 4-6 giorni di trattamento DSS seguita da periodo di recupero di 3-4 giorni e il sacrificio (come descritto nel protocollo di cui sopra).
Colite cronica Modifica:
I topi sono posti su tre cicli di cinque giorni del 3% DSS con sedici giorni di recupero tra ogni ciclo. I topi sono sacrificati dopo la finale di 16 giorni periodo di riposo.
Ci sono diverse questioni che i ricercatori devono essere consapevoli che con questo modello:
- Variabilità nel sito di lesione: Nelle nostre mani, vediamo uno schema lesioni prevalentemente distale, con relativo risparmio del colon prossimale e cieco. Altri hanno riferito predominanza più prossimale al modello lesioni.
- Variabilità ambientale. Vi sia una significativa variabilità ambientale. Questo è probabilmente, in parte, a causa delle differenze nella microflora intestinale, la dieta e altre considerazioni di carattere ambientale.
- Questo modello è inefficace se DSS alto peso molecolare (vale a dire 500.000 Da).
- C'è uno sforzo considerevole variabilità con questo modello 4.
Analisi biochimica del colon può essere effettuata prelevando campioni dai margini prossimale e distale. A seconda della gravità del danno che può influire sulla capacità di generare un punteggio istologico lesioni. In vivo BrdU etichettatura per misurare la proliferazione può essere ottenuto mediante iniezione intraperitoneale di 16,7 mcg / kg BrdU 2 ore prima del sacrificio seguito da α-BrdU IHC elaborazione.
In alternativa alla "salsiccia", il colon può essere risolto completamente piatto. Foderare il fondo di un contenitore Tupperware con carta Whatman e godersi la carta con il 10% tamponata fosfato formalina. Sezionare i due punti, come descritto nella "Parte 2: l'autopsia e raccolta di Colon". Ancora una volta, tenere l'estremità distale del colon più vicina all'operatore. Utilizzando le forbici a punta fine, incidere longitudinalmente da distale a prossimale del colon. Con pinza a punta sottile afferrare uno dei bordi della ferita e aperto lateralmente di lavoro, visualizzando così i due punti come una lamiera piana. Trasferire questo foglio piatto al pre-impregnato carta Whatman. Coprire i due punti appiattito con un altro pezzo di Whatman e bagnate con il 10% tamponata fosfato formalina. Il Whatman deve essere completamente coperto in formalina, ma non così tanto che solleva il colon. Sigillare la Tupperware e fissare per 24 ore. Rimuovere i due punti dalla Tupperware e metterlo in 10 ml di etanolo al 70% in un tubo da 15 ml. (Due punti possono essere memorizzati in 70% EtOH a tempo indeterminato a temperatura ambiente.)
Ci sono diversi metodi per quantificare lesioni del colon 5,6,7. Un metodo, per esempio, utilizza un multi-parametro di scala tra cui: il coinvolgimento infiammazione, la portata, la rigenerazione, danni cripta, e il coinvolgimento per cento 8.
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Disclosures
Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dalla Vanderbilt IACUC.
Acknowledgments
Il finanziamento fornito dal NIH (1 DK080221 K08-01) ei fondi di sviluppo Vanderbilt istituzionali.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran Sulfate Sodium Salt | USB Corp., Affymetrix | 9011-18-1 | mol wt 40,000-50,000 |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC 57319-474-06 | |
| TISSUE PATH Macrosette Cassettes | Fisher Scientific | 15182706 | |
| BD 10 ml Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco-AAPER | E190 | Dilute to 70% with distilled water |
| 20G Straight Feeding Needle | VWR international | 20068-612 | |
| 27G1/2 PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 305109 | |
| Dissecting Scissors Sharp/Blunt Tip | VWR international | 82027-588 | |
| Waugh Forceps | VWR international | 82027-428 | |
| Non-absorbable Suture | LOOK Surgical | SP116 | |
| Whatman Blotting Paper | VWR international | 28298-020 | Cut as needed |
| Nalgene Surfactant-Free Cellulose Acetate (SFCA) Filter | Cole-Parmer | EW-06731-2 | |
| Carbon fiber composites digital caliper | Fisher Scientific | 15-007-958 |
References
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- Martinez, J. A. Deletion of Mtgr1 sensitizes the colonic epithelium to dextran sodium sulfate-induced colitis. Gastroenterology. 131 (2), 579-588 (2006).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
- Mahler, M. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274, G544-551 (1998).
- Aharoni, R. Immunomodulatory therapeutic effect of glatiramer acetate on several murine models of inflammatory bowel disease. J Pharmacol Exp Ther. 318 (1), 68-78 (2006).
- Hahm, K. B. Loss of transforming growth factor beta signalling in the intestine contributes to tissue injury in inflammatory bowel disease. Gut. 49 (2), 190-198 (2001).
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- Dieleman, L. A. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
