拉瓦尔环腺解剖：从德罗索菲拉分离发育内分泌器官

Overview

这个视频描述了 嗜血杆菌 环腺，一个复杂的内分泌结构，对生物合成和分泌的湿类固醇和其他激素很重要。特色协议展示了其解剖、固定和免疫染色。

Protocol

本协议摘自Imura等人的摘录，《可视化类固醇原器官及其相互作用器官与果蝇德罗索菲拉梅拉诺加斯特免疫污染协议》，J.Vis.Exp.（2017年）。

注： 协议的整体方案显示在 图1中。

1. 拉瓦尔环腺的解剖 （RG）

注： 在 D.梅拉诺加斯特，它属于环形体迪普泰拉，PG是在一个称为环腺的复合内分泌器官内（RG， 图2D）。由于 PG 与其他类型的细胞（稍后讨论）进行手术分离是不可行的，因此实际目标是通过解剖来隔离完好无损、完好无损的 RG。

1. 在适当的发育阶段准备幼虫
   注： 为了同步 德拉诺加斯特 幼虫的发育阶段，有必要在狭窄的时间窗口内收集卵子，并在适当的时候收集幼虫。
   1. 在25°C的葡萄汁糖盘上收集鸡蛋2小时。
   2. 用钳子在解剖显微镜下收集新孵出^的1号 星幼虫，并将其转移到含有捣碎标准酵母/玉米粉飞食的小瓶中。
      注： 幼虫的年龄表现为"产卵后数小时（hAEL）"、"孵化后数小时"或"L3涡流后数小时（hAL3E）"。
   3. 在适当的时候，用一次性塑料环收集分期幼虫，以避免不良伤害。为了最大限度地减少^第三 只星幼虫发育的差异，在70 hAEL（48 hAH）收集^第二 只星内幼虫，并允许它们以2小时间隔进行割毛。然后，在L3湿疹后2小时内收集^第3 个星内幼虫：这个程序给0-2 hAL3E幼虫。
   4. 将分阶段幼虫转移到装满磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的菜肴中。
   5. 用PBS冲洗幼虫，从体内去除残留食物。
2. 解剖显微镜下幼虫的粗解剖
   1. 用钳子抓住幼虫的嘴钩。使用微型剪刀将幼虫身体切成身体长度的前三分之一。
   2. 用一对钳子保持前幼虫身体的切端。使用另一对钳子，轻轻地将头尖推向身体内部：这个程序把幼虫的身体从内到外。
      注： 这一步可以跳过1^星 幼虫的解剖。
   3. 重复步骤 1.2.1-1.2.2 与额外的幼虫 5-10 分钟。
      注： 幼虫的数量应等于或少于20，以节省解剖时间。
3. 用免疫化学修复和染色组织
   1. 将前三分之一的幼虫体（步骤1.2.2）放入一个1.5 mL的微管中，里面装满了500μL的固定溶液（PBS中4%的副甲醛）。一次修复少于 20 个样品，否则连接到固定样品的 PBS 可能会导致固定样品的不利稀释。对于圆角解剖，删除一滴 PBS，然后添加一滴修复解决方案。
      注： 对于固定解决方案，可以使用 3.7% 的甲醛或 4% 的甲醛。
   2. 在室温 （RT） 下在固定溶液中孵育解剖组织 30 分钟，或在 4 °C 下将解剖组织孵化 2 小时。
   3. 用 500 μL PBS 替换修复解决方案，并快速冲洗样品 3 次。在 RT 的摇动器上用 500 μL 0.3% PBT（PBS + 0.3% 八苯酚乙氧酸盐）清洗样品 15 分钟。要进行圆角解剖，请取出昆虫别针，并将样品转移到 1.5 mL 微管中。
      注： 为了增加抗体渗透到组织的渗透性，样品在RT的摇动器上用500微升2.0%PBT处理，1-2小时。
   4. 用 500 μL 阻塞溶液（PBT 中的 2% 牛血清白蛋白）替换 PBT。在 RT 的摇动器上将样品孵化 1.5 小时。
   5. 将阻塞溶液替换为 50 μL 的主要抗体溶液， 即 阻塞溶液中稀释的抗体。
   6. 在 4 °C 的摇杆上连夜孵化样品。
   7. 用 500 μL 0.3% PBT 替换主抗体溶液，并快速冲洗样品 5 次。用 500μL 0.3% PBT 清洗样品 3 次，每次在 RT 的摇动器上洗 15 分钟。
   8. 将 0.3% PBT 替换为 50 μL 二次抗体溶液（阻塞溶液中稀释的染料结合抗体）。对于核染色，0.5 μL 4'，6-迪亚米迪诺-2-苯林多（DAPI，0.1毫克/mL库存溶液）添加到50微L溶液中。在 RT 或 4 °C 的夜间在摇杆上孵化样品 2 小时。
      注： 将样品放在黑暗中。
   9. 用 500 μL 0.3% PBT 替换抗体溶液，冲洗 5 次。用 500μL 0.3% PBT 清洗样品 3 次，每次在 RT 上洗 15 分钟。
4. 包含 PG 和安装的脑 RG 复合体的精细解剖
   1. 使用一次性管道将免疫污染的样品转移到装满 0.3% PBT 的菜肴中。
      注： 为了避免在解剖和安装过程中出现不方便的气泡，0.3% PBT 可以替换为 PBS。
   2. 在解剖显微镜下，用一对钳子握住皮质层或嘴钩。使用附着在 1 mL 注射器上的 27 G 针作为"刀"，切开食道和眼盘的前尖，从身体角质层中去除脑-RG-眼盘复合物。
   3. 将食道和肠道与带钳子的脑-RG-眼睛盘复合物分开。由于食道穿过心室神经带（VNC）上方的大脑，将肠道拉到后侧。
      注： 要从样品中取出额外的假想光盘，用针刀切断大脑、眼盘和腿盘之间的连接。
   4. 对于其他样本，重复步骤 1.4.1-1.4.4。
      注： 为了防止组织碎片粘附在样品上，将每个已完成的样品转移到不同干净的盘子中，里面装满了 0.3% PBT 或 PBS。
   5. 将样品转移到带微皮带的清洁玻璃滑梯中心。
      注： 对于第² 或^{第 3 个} 星内幼虫，应用剃须刀刀片截断微尖端。
   6. 在解剖显微镜下，使用钳子将单个样本与后侧对齐。
      注： RG位于大脑的后侧（图2A）。此对齐有助于成像期间对单个样品进行规范。
   7. 倾斜玻璃滑梯，并尽可能多地擦去多余的 PBT。将一滴安装试剂放在幻灯片的一侧。将盖片的边缘从掉落的另一侧放出，然后用钳子缓慢地将盖片放在样品上。
      注： 此程序可防止样品移出盖滑。
   8. 将样品存放在 4 °C。 将样品放在黑暗中。

Representative Results

图1：协议的总体方案。 根据实验的目的，两种截然不同的解剖方法适用于幼虫和成年雌性。安装方法也根据样本条件进行设计。固定、染色和成像技术在所有样品中基本上都很常见。 请单击此处查看此图的更大版本。

图2：PG和PG投影神经元的可视化。 （A 和 B） 野生 3 型星幼虫的脑环腺^（RG） 复合物。在 （B） 中，PG 由虚线勾勒出来。大脑和RG之间的细丝结构是气管。（C-E）PG 的内部在飞光系列中以 MCD8：：GFP 驱动 ，由 GMR45C06-GAL4 驱动。PG和GFP阳性神经元分别标有抗斯罗抗体（品红色）和抗GFP抗体（绿色）。荧光图像与传输光图像合并，以指定组织轮廓。在（D），PG， 公司阿拉塔 （CA） 和公司心脏 （CC） 被说明.PG投影神经元在具有 40X 目标镜头（E 中的箭头）的高功率图像中比具有 10 倍目标镜头 （C） 的低功耗图像更突出。缩放栏 = 100μm. 请单击此处查看此图的更大版本。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Egg collection
tissue culture dish (55 mm)	AS ONE	1-8549-02	for grape-juice agar plates
collection cup	HIKARI KAGAKU
yeast paste	Oriental dry yeast, Tokyo
100% grape juice	Welch Food Inc.
rearing larvae
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS)	SARSTEDT	58.487
disposable loop	AS ONE	6-488-01
standard fly food			The recipe is on the website of Bloomington stock center.
Dissection
dissecting microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
dissecting microscope	Leica	S8 AP0
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated)	IWAKI	1000-035
Sylgard	TORAY		coarting silicon inside dishes
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm)	TERUMO	NN-2719S	A "knife" to cut the tissue
forceps, Inox, #5	Dumont, Switzerland
insect pin (0.18 mm in diameter)	Shiga Brand		for fillet dissection
micro scissors	NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.	MB-50-10
Fixation
ultrapure water	Merck Millipore
phosphate buffered saline (PBS)
Formaldehyde	Nacalai tesque	16222-65
Paraformaldehyde	Nacalai tesque	02890-45
Triton-X100	Nacalai tesque	35501-15
microtubes (1.5 ml)	INA OPTIKA	CF-0150
Incubation
As one swist mixer TM-300 (rocker)	As one	TM-300	rocker
Bovine Serum Albumin	SIGMA	9048-46-8
Primary antibody
anti-Sro (guinea pig), 1:1000
anti-GFP (rabbit), 1:1000	Molecular Probes	A6455	Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100	Nakarai tesque	04363-66
anti-5HT (rabbit), 1:500	SIGMA	S5545
anti-Hts 1B1 (mouse)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1
anti-DE-cadherin (rat), 1:20	DSHB	DCAD2
anti-nc82 (mouse), 1:50	DSHB	nc82
Secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11008
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11001
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate	Life Technologies	A-11081
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate	Life Technologies	A-21435
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin	Life Technologies	A-22283
Mounting reagents
Micro slide glass	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	SS7213
Square microscope cover glass	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	C218181
FluorSave reagent (Mounting reagent)	Calbiochem	345789
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper)	WATSON	5660-222-1S
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP			gifts from K. Ito, The University of Tokyo.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4			Li, H. H. (2014) and Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010)
w; UAS-mCD8::GFP			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)